趙思佳 王曉璐 孫紀(jì)錄 田健 張杰

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，保定 071000；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

赤蘚糖醇（erythritol）在自然界中分布廣泛，是一種天然甜味劑、滲透保護(hù)劑。它存在于梨、葡萄等水果，蘑菇、甜菜等蔬菜，啤酒、清酒等飲料，醬油等發(fā)酵食品，海藻以及人和動(dòng)物體液中［1]。赤蘚糖醇的口感、質(zhì)地與蔗糖相似，甜度為蔗糖的60%-80%，熱量?jī)H為蔗糖的5%，在多元醇中對(duì)動(dòng)物機(jī)體的副作用最小［2-4]。赤蘚糖醇能被小腸快速吸收，但90%不參與人體代謝，且與尿液一起排出體外，不改變體內(nèi)血糖和胰島素水平，被認(rèn)為是一種零熱量、安全性高的甜味劑，受到了糖尿病患者和減肥人群的青睞。除了作為功能性甜味劑外，赤蘚糖醇還有一定的抗氧化特性，可作為自由基清除劑［5]。此外，它還具有保護(hù)肝臟、吸濕性低、熱穩(wěn)定性好、溶解熱低、耐受量高、防齲齒、加工特性優(yōu)良等特點(diǎn)［6]。目前，赤蘚糖醇被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工及化妝品等領(lǐng)域，用于制作牙膏、無糖食品、飲品、保健品以及藥品［7]。據(jù)預(yù)測(cè)，2023年全球赤蘚糖醇的年產(chǎn)值可達(dá)1.5億美元，相比2017年提升了1.9倍［8]。

天然的蔬菜、水果中赤蘚糖醇的含量太低，直接提取的成本較高，故赤蘚糖醇的生產(chǎn)方法主要是化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法［9]?；瘜W(xué)合成法包括用金屬或金屬氧化物催化、用阿拉伯酸或核糖酸電解脫羧等方法，但這些反應(yīng)過程需要高溫、高壓，生產(chǎn)成本高昂［10]。微生物發(fā)酵法主要是用真菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)赤蘚糖醇，此外一些細(xì)菌如酒球菌（Oenococcus oeni）、明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、舊金山乳桿菌（Lactobacillus sanfranciscensis）等也可以生產(chǎn)少量赤蘚糖醇［11-13]。目前，被用于生產(chǎn)赤蘚糖醇的菌屬有：耶氏酵母屬（Yarrowia）、假絲酵母屬（Candida）、圓酵母屬（Torula）、假酵母屬（Pseudozyma）、叢梗孢酵母屬（Moniliella）等［14]。常用的酵母菌包括叢梗孢酵母（Moniliella pollinis）、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）、球頭三型孢菌（Trichosporonoides oedocephalis）等［15]?；贛.pollinis細(xì)胞裂解物的培養(yǎng)基可以使乙醇轉(zhuǎn)化為赤蘚糖醇，從而提高赤蘚糖醇總產(chǎn)量，在甘蔗汁補(bǔ)料分批發(fā)酵M. pollinis時(shí)，獲得了最大滴度為94.9 g/L的赤蘚糖醇［16]。以粗甘油為原料、Y. lipolytica野生型為底盤菌株，探究提高赤蘚糖醇產(chǎn)量的方法，研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)過表達(dá)GUT1的突變株GUT1表達(dá)量可以提高11倍，由于基因的協(xié)調(diào)作用，同時(shí)，過表達(dá)GUT1、GUT2粗甘油同化可以提高1/3。過表達(dá)TKL1的菌株赤蘚糖醇效價(jià)比對(duì)照菌株增加了48.1%，說明編碼轉(zhuǎn)酮醇酶的TKL1對(duì)于赤蘚糖醇的合成起了重要作用。過表達(dá)GUT1、GUT2和TKL1，敲除EYD1是生產(chǎn)赤蘚糖醇的最佳組合，根據(jù)此組合獲得的突變株Y-11在5 L生物反應(yīng)器中赤蘚糖醇產(chǎn)量達(dá)到了150 g/L［17]。以T. oedocephalis為底盤菌株，敲除HOG1后在200 g/L葡萄糖和0.3%檸檬酸條件下發(fā)酵120 h，得到（69.12±0.19）g/L赤蘚糖醇，但當(dāng)檸檬酸濃度增加到0.4%時(shí)，赤蘚糖醇的產(chǎn)量降低，說明較高濃度的檸檬酸可能會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并影響代謝［18]。

甲基營(yíng)養(yǎng)酵母畢赤酵母（Pichia pastoris）易于遺傳操作、在葡萄糖和甘油上能夠快速生長(zhǎng)、可以高細(xì)胞密度發(fā)酵以及在細(xì)胞內(nèi)、外產(chǎn)生高水平異源蛋白質(zhì)的能力使它成為一種有吸引力的多功能底盤細(xì)胞［19]。近年來，P. pastoris已被廣泛用作生產(chǎn)各種高價(jià)值生物活性化合物的高效細(xì)胞工廠，包括蘋果酸［20]、脂肪酸［21]、肌醇［22]等。P. pastoris作為一種耐高滲酵母菌，具有高產(chǎn)赤蘚糖醇的潛力，但目前還沒有赤蘚糖醇在P. pastoris中合成的相關(guān)報(bào)道。

本研究以P. pastoris GS115為出發(fā)菌株構(gòu)建赤蘚糖醇細(xì)胞工廠，分析糖酵解途徑、戊糖磷酸途徑碳代謝流改造及4-磷酸赤蘚糖磷酸化酶、糖醇磷酸酶、赤蘚糖還原酶的過表達(dá)對(duì)P. pastoris中赤蘚糖醇生產(chǎn)的影響，同時(shí)利用生物信息學(xué)結(jié)合代謝工程技術(shù)研究副產(chǎn)物阿拉伯糖醇和核糖醇合成關(guān)鍵基因，為高產(chǎn)赤蘚糖醇P. pastoris工程菌株構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

所用菌株及質(zhì)粒見附表1。所用引物均由擎科生物合成（附表2）。

表2 突變株C5高密度發(fā)酵產(chǎn)物Table 2 Products of high-density fermentation of mutant C5

1.2 方法

1.2.1 基因組編輯載體的構(gòu)建 為了構(gòu)建生產(chǎn)赤蘚糖醇的P. pastoris菌株，并提高其產(chǎn)量，試驗(yàn)弱化了P. pastoris自身的果糖-6-磷酸激酶I基因pfk1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（PAS_chr2-1_0437）；敲除了果糖-6-磷酸激酶II基因pfk2，合成阿拉伯糖醇和核糖醇的基因PAS_chr2-2_0019、PAS_chr4_0988、PAS_chr4_0754和PAS_chr1-1_0490；過表達(dá)自身轉(zhuǎn)酮酶基因TKL1（PAS_chr1-4_0150），來源于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的核酮糖-3-磷酸差向異構(gòu)酶基因rpe1和去磷酸化酶基因pyp1，來源于E. coli的去磷酸化酶基因yidA，來源于里氏木霉（Trichoderma reesei）的赤蘚糖還原酶基因err1，來源于Y. lipolytica的NADH依賴型以及木蘭假絲酵母（Candida magnoliae）的NADPH依賴型赤蘚糖還原酶基因er，經(jīng)過組合，共構(gòu)建了7個(gè)基因組編輯質(zhì)粒（附表1）。

P. pastoris基因組編輯質(zhì)粒的構(gòu)建參照前期已經(jīng)建立的方法［22]。以重組質(zhì)粒p19-3-1-Δaox-Pgap1-pyp1的構(gòu)建為例：以P. pastoris GS115基因組為模板，擴(kuò)增aox兩側(cè)各1000 bp左右的DNA序列作為上下游同源臂，將上游同源臂與p19-3-1質(zhì)粒連接，通過PCR及overlap PCR獲得small arm-Pgap1-pyp1-down arm片段，利用同源重組試劑盒將該片段與p19-3-1-up-arm質(zhì)粒連接，即獲得p19-3-1-Δaox-Pgap1-pyp1重組質(zhì)粒。其他基因組編輯質(zhì)粒的構(gòu)建與之類似，不再贅述。

1.2.2 重組畢赤酵母菌株的構(gòu)建 共構(gòu)建11個(gè)重組P. pastoris菌株。P. pastoris工程菌構(gòu)建分為兩部分：目的片段的敲入和抗性基因的敲除。構(gòu)建方法參考文獻(xiàn)［22]，簡(jiǎn)述如下：

目的片段的敲入。利用限制性內(nèi)切酶Not I酶切載體，將線性化的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化P. pastoris菌株，經(jīng)30℃、30 min復(fù)蘇后，將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含Zeocin抗性的BMGY培養(yǎng)基，30℃倒置培養(yǎng)48 h。待單克隆出現(xiàn)后，利用克隆PCR和測(cè)序的方法驗(yàn)證目的片段的敲入情況。

抗性基因的敲除。選取成功整合目的片段的菌株進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)，通過mazF毒性基因的表達(dá)結(jié)合同源重組將抗性標(biāo)簽敲除。甲醇誘導(dǎo)體系：5 mL YNB、45 mL ddH2O和500 μL甲醇。30℃誘導(dǎo)，每24 h補(bǔ)加500 μL甲醇。誘導(dǎo)2-3 d后的菌液梯度稀釋涂布BMGY培養(yǎng)基，利用克隆PCR和測(cè)序的方法驗(yàn)證抗性標(biāo)簽的去除情況。

1.2.3 外源基因在畢赤酵母中的表達(dá) 為了快速篩選外源基因，采用構(gòu)建游離質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化P. pastoris的方法，驗(yàn)證外源基因是否表達(dá)?；A(chǔ)表達(dá)質(zhì)粒T-ARS-PGAP是在T載體的基礎(chǔ)上構(gòu)建，含有能在P. pastoris中自我復(fù)制的ARS（autonomously replicating sequence）復(fù)制子，組成型強(qiáng)啟動(dòng)子PGAP，用于純化的His標(biāo)簽，Ampicillin、Zeocin抗性標(biāo)記以及預(yù)留的多個(gè)酶切位點(diǎn)。篩選的目的基因包括來源于S. cerevisiae的pyp1，來源于T. reesei的err1，來源于Y. lipolytica的er（NADH）、ER10、ER25和JX885，來源于C. magnoliae的er（NADPH），來源于M. megachiliensis的er1、er3，經(jīng)密碼子優(yōu)化后，由北京六合華大基因科技有限公司合成。yidA和rpe1分別以E. coli和S. cerevisiae的基因組為模板擴(kuò)增獲得。目的基因刪除終止密碼子，經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，利用同源重組試劑盒連接到T-ARS-PGAP載體的Hind III和Xho I酶切位點(diǎn)，獲得這些基因的表達(dá)載體（附表1）。

將含有目的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化P. pastoris C0菌株，挑取單克隆轉(zhuǎn)化子，30℃培養(yǎng)24 h。選擇生長(zhǎng)旺盛的菌株接種于50 mL BMGY培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，然后，按2%接種量轉(zhuǎn)接于200 mL BMGY培養(yǎng)基，30℃、200 r/min培養(yǎng)48 h。將菌液于5000 r/min離心，獲得菌體，經(jīng)液氮研磨，用10 mL Tris-HCl（pH 7.4）重懸，12000 r/min離心10 min，取上清。含His標(biāo)簽的蛋白通過磁珠法純化（His-tag蛋白純化磁珠，海貍公司），進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

1.2.4 搖瓶發(fā)酵與高密度發(fā)酵 挑取正確的單克隆接種于50 mL BMGY生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)48 h，制作發(fā)酵種子液。搖瓶發(fā)酵在含有200 mL低鹽發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形三角瓶（1 L）中進(jìn)行，培養(yǎng)溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，每個(gè)菌株設(shè)置3個(gè)平行。高密度發(fā)酵在含有7 L低鹽發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐（10 L）中進(jìn)行，溫度30℃，溶氧量30%，菌株生長(zhǎng)前期以甘油為碳源，控制pH 4.5。當(dāng)細(xì)胞濕重達(dá)到180-200 mg/mL時(shí)，碳源換為葡萄糖，將菌株的狀態(tài)由生長(zhǎng)轉(zhuǎn)換為生產(chǎn)。

1.2.5 產(chǎn)物含量的檢測(cè) 采用高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)發(fā)酵液中的赤蘚糖醇、葡萄糖、阿拉伯糖醇、核糖醇等化合物的含量。1 mL發(fā)酵液經(jīng)12000 r/min離心3 min，用0.22 μm濾器過濾上清，取200 μL置于內(nèi)插管中，4℃保存待測(cè)。檢測(cè)儀器為示差折光檢測(cè)器，色譜柱型號(hào)Agilent Hi-Plex Ca（7.7 mm×300 mm，8 μm），流動(dòng)相為超純水，流速為0.5 mL/min，柱溫80℃。

2 結(jié)果

2.1 弱化糖酵解途徑

細(xì)胞從外界吸收葡萄糖，經(jīng)過磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸，其中一部分進(jìn)入戊糖磷酸途徑，另一部分進(jìn)入糖酵解途徑進(jìn)行代謝。為了使更多的葡萄糖-6-磷酸進(jìn)入戊糖磷酸途徑，進(jìn)而流向赤蘚糖醇的前體物質(zhì)——赤蘚糖-4-磷酸，試驗(yàn)首先對(duì)糖酵解途徑進(jìn)行了弱化。進(jìn)入糖酵解途徑的葡萄糖-6-磷酸被葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶異構(gòu)化生成果糖-6-磷酸，果糖-6-磷酸在磷酸果糖激酶作用下生成果糖-1,6-磷酸，隨后，在醛縮酶的作用下生成甘油醛-3-磷酸（圖1）。已知P. pastoris中起作用的磷酸果糖激酶有磷酸果糖激酶I（PFK1,GenBank：PAS_chr2-1_0402）和磷酸果糖激酶II（PFK2,GenBank：PAS_chr2-1_0047）。

圖1 畢赤酵母中赤蘚糖醇合成通路的構(gòu)建Fig. 1 Construction of erythritol biosynthetic pathway in P. pastoris

據(jù)報(bào)道，pfk1、pfk2在P. pastoris中均可實(shí)現(xiàn)單獨(dú)敲除，但不能同時(shí)敲除，不論敲除順序如何，均不能得到pfk1、pfk2雙敲菌株，因此，選擇在pfk2敲除的菌株P(guān). pastoris C1中弱化pfk1。在P. pastoris中，甘油的利用受到葡萄糖的抑制，而抑制作用主要是由于甘油代謝的第一步基因——甘油激酶基因（gut1）的表達(dá)受到調(diào)控所致。因此，選擇利用甘油激酶基因的啟動(dòng)子Pgut1替換了C1菌株中pfk1的啟動(dòng)子，以期利用碳代謝抑制（carbon catabolite repression，CCR）的原理調(diào)控糖酵解的代謝流，成功獲得菌株P(guān). pastoris C2。

對(duì)獲得的突變株P(guān). pastoris C2及對(duì)照菌株C0進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。菌株首先利用發(fā)酵培養(yǎng)基中的甘油為唯一碳源生長(zhǎng)24 h，之后補(bǔ)加50 g/L葡萄糖繼續(xù)發(fā)酵。由圖2-A可以看出，2株菌在前24 h生長(zhǎng)基本一致，說明以甘油為碳源時(shí)，C2菌株的Pgut1-pfk1正常表達(dá)。在培養(yǎng)基中補(bǔ)加葡萄糖后，C2的生長(zhǎng)明顯慢于對(duì)照菌株C0，發(fā)酵72 h時(shí)，C2的OD600僅為C0的2/3。由此可見，敲除pfk2并用Pgut1控制pfk1的表達(dá)，以葡萄糖為碳源時(shí)減弱了C2的糖酵解途徑，抑制了菌株生長(zhǎng)。同時(shí)，發(fā)酵結(jié)果顯示，菌株C2在搖瓶發(fā)酵過程中產(chǎn)生了副產(chǎn)物——阿拉伯糖醇和核糖醇（圖2-B）。2個(gè)副產(chǎn)物均來自戊糖磷酸途徑，說明C2的戊糖磷酸途徑的代謝流得到加強(qiáng)。但副產(chǎn)物的產(chǎn)生會(huì)影響目標(biāo)產(chǎn)物的生產(chǎn)，并對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的分離純化造成困擾，因此，消除和降低副產(chǎn)物也是本研究的重要內(nèi)容。

圖2 畢赤酵母菌株C0和C2的表型驗(yàn)證Fig. 2 Phenotype verification of P. pastoris C0 andC2 strains

2.2 副產(chǎn)物合成關(guān)鍵基因的敲除

根據(jù)搖瓶發(fā)酵結(jié)果，已知C2菌株發(fā)酵過程中的主要副產(chǎn)物為阿拉伯糖醇和核糖醇。通過KEGG、NCBI等數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，與這兩個(gè)副產(chǎn)物合成相關(guān)的糖醇脫氫酶基因主要有3個(gè)：0019（GenBank：PAS_chr2-2_0019）、0754（GenBank：PAS_chr4_0754）和0988（GenBank：PAS_chr4_0988）。其中，0754和0988在P. pastoris基因組上的位置相近。通過同源重組的方法將3個(gè)基因依次敲除，得到突變株P(guān). pastoris C3（Δ0019）和C4（Δ0019Δ0988Δ0754）。

對(duì)C3和C4突變株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。結(jié)果（圖3）顯示，敲除0019使C3的核糖醇產(chǎn)量相比C2降低了58.6%。由于核糖醇和阿拉伯糖醇來自于同一個(gè)前體物核酮糖-5-磷酸，因此C3的阿拉伯糖醇產(chǎn)量有所升高。進(jìn)一步敲除0988和0754后，C4的阿拉伯糖醇產(chǎn)量相比C2降低了95.6%，而對(duì)應(yīng)的核糖醇產(chǎn)量有所提升。由此可見，0019主要催化核糖醇的生產(chǎn)，而0988和0754主要介導(dǎo)阿拉伯糖醇的生產(chǎn)。C3和C4突變株的副產(chǎn)物總產(chǎn)量（阿拉伯糖醇和核糖醇之和）分別為5.6和1.9 g/L，相比C2菌株（6.2 g/L）分別降低了6.7%和69.4%。

圖3 畢赤酵母菌株C2、C3、C4阿拉伯糖醇和核糖醇的生產(chǎn)Fig. 3 Production of arabitol and ribitol by P. pastoris C2,C3 and C4 strains

2.3 構(gòu)建赤蘚糖醇合成通路

赤蘚糖醇合成的前體物是來自戊糖磷酸途徑的赤蘚糖-4-磷酸。在真菌中，赤蘚糖-4-磷酸首先去磷酸化生成赤蘚糖，然后在赤蘚糖還原酶的作用下還原成赤蘚糖醇。在細(xì)菌中，赤蘚糖-4-磷酸則先被赤蘚糖醇-4-磷酸脫氫酶還原成赤蘚糖醇-4-磷酸，再通過磷酸酶作用生成赤蘚糖醇。本研究選擇前一條通路，在P. pastoris中構(gòu)建赤蘚糖醇合成途徑。

2.3.1 赤蘚糖還原酶基因的篩選與外源基因的表達(dá) 選取不同來源的赤蘚糖還原酶基因（表1）［23-25]。將選取的赤蘚糖還原酶基因以及本研究中所涉及的其他外源基因與含有His標(biāo)簽的過表達(dá)載體連接（圖4-A），并轉(zhuǎn)入P. pastoris驗(yàn)證其表達(dá)情況。結(jié)果顯示，4-磷酸赤蘚糖磷酸化酶基因yida，赤蘚糖還原酶基因err1、er（NADH）和er1，糖醇磷酸酶基因pyp1及磷酸核酮糖差向異構(gòu)酶基因rpe1能在P. pastoris中表達(dá)（圖4-B），因此，選擇這些基因在P. pastoris中構(gòu)建赤蘚糖醇合成通路。

圖4 外源基因在畢赤酵母中表達(dá)Fig. 4 Expressions of exogenous genes in P. pastoris

2.3.2 構(gòu)建畢赤酵母赤蘚糖醇合成通路 首先在P. pastoris中敲入赤蘚糖還原酶基因，即過表達(dá)Y.lipolytica來源的依賴于NADH的赤蘚糖還原酶基因er（NADH），探究在P. pastoris自身含有的磷酸酶基因以及敲入的赤蘚糖還原酶基因的作用下能否生產(chǎn)赤蘚糖醇。

經(jīng)過基因組編輯，在C4菌株中整合了PGAP-er（NADH）表達(dá)框獲得菌株C5。高密度發(fā)酵結(jié)果顯示，C5突變株的發(fā)酵液中沒有赤蘚糖醇的積累（表2）。猜測(cè)可能有兩個(gè)原因造成了這個(gè)現(xiàn)象：（1）前體物赤蘚糖-4-磷酸供給不足；（2）P. pastoris自身的磷酸酶不能將赤蘚糖-4-磷酸轉(zhuǎn)化成赤蘚糖，需要表達(dá)外源磷酸酶基因。因此，選擇對(duì)糖酵解中的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（GAPD，GenBank：PAS_hr2-1_0437）進(jìn)行弱化，使更多的碳代謝流留在戊糖磷酸途徑。

將C4菌株的GAPD啟動(dòng)子替換成Pgut1啟動(dòng)子，獲得菌株C6。S. cerevisiae來源的糖醇磷酸酶PYP1可以催化赤蘚糖醇-4-磷酸水解為赤蘚糖醇，因此，在菌株C6中過表達(dá)經(jīng)密碼子優(yōu)化后的pyp1，獲得菌株C7。然而，結(jié)果顯示，突變株C7并沒有獲得生產(chǎn)赤蘚糖醇的能力。在過表達(dá)pyp1的基礎(chǔ)上，選擇再整合表達(dá)來源于E. coli的4-磷酸赤蘚糖磷酸化酶基因yidA，構(gòu)建了菌株C8。結(jié)果顯示，C8突變株的生物量相比出發(fā)菌株有一定的降低（圖5-A），發(fā)酵液中生產(chǎn)了約30 mg/L的赤蘚糖醇（圖5-B）。另外，副產(chǎn)物阿拉伯糖醇和核糖醇也有一定的積累圖5-C）。

圖5 畢赤酵母菌株C0和C8的表型驗(yàn)證Fig. 5 Fermentation profiles of P. pastoris C0 and C8 strains

2.4 強(qiáng)化戊糖磷酸途徑

在Y. lipolytica中，過表達(dá)戊糖磷酸途徑關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)酮酶基因TKL可以提高赤蘚糖醇的生產(chǎn)［26]。并且根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析，P. pastoris GS115菌株中缺少磷酸核酮糖差向異構(gòu)酶基因rpe。因此，選擇過表達(dá)S. cerevisiae來源的rpe1以及P. pastoris自身的轉(zhuǎn)酮酶基因TKL1（PAS_chr1-4_0150），使更多的葡萄糖-6-磷酸流向赤蘚糖醇的前體物質(zhì)——赤蘚糖-4-磷酸，從而達(dá)到提高赤蘚糖醇產(chǎn)量的目的。

在過表達(dá)pyp1和yidA菌株的基礎(chǔ)上，又整合了PGAP-rpe1和PGAP-TKL1表達(dá)框，構(gòu)建了菌株C10。搖瓶發(fā)酵結(jié)果由圖6所示，菌株C0與C10的生長(zhǎng)接近，C10的赤蘚糖醇產(chǎn)量達(dá)到1.2 g/L，相比C8提高了約40倍。C10的發(fā)酵液中并沒有檢測(cè)到阿拉伯糖醇的生產(chǎn)，但核糖醇達(dá)到10.0 g/L，相比C8也大幅提升。

圖6 畢赤酵母菌株C0和C10的表型驗(yàn)證Fig. 6 Phenotype verification of P. pastoris C0 and C10 strains

搖瓶發(fā)酵由于不能控制溶氧和pH，無法真正反映菌株的生產(chǎn)潛力，因此，使用10 L發(fā)酵罐對(duì)C10菌株進(jìn)行了高密度發(fā)酵。發(fā)酵初期以甘油為碳源，待菌體生長(zhǎng)至濕重約180 mg/mL后流加70%葡萄糖進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵，流加葡萄糖72 h后發(fā)酵結(jié)束。HPLC分析結(jié)果（圖7）顯示，突變菌株C10赤蘚糖醇產(chǎn)量為10.6 g/L，副產(chǎn)物阿拉伯糖醇7.5 g/L，核糖醇8.7 g/L。

圖7 畢赤酵母菌株C10高密度發(fā)酵Fig. 7 High-cell-density fermentation with strain P. pastoris C10

2.5 過表達(dá)赤蘚糖還原酶對(duì)赤蘚糖醇產(chǎn)量的影響

赤蘚糖還原酶可催化赤蘚糖生成赤蘚糖醇，是赤蘚糖醇合成途徑的最后一步催化酶，其活性對(duì)赤蘚糖醇的生產(chǎn)尤為關(guān)鍵。根據(jù)不同來源的赤蘚糖還原酶在P. pastoris中的表達(dá)情況（圖4-B），選擇來源于Y. lipolytica的依賴于NADH的er（NADH）和來源于T. reesei的依賴于NADPH的err1進(jìn)行過表達(dá)［27-28]。2個(gè)基因使用PGAP作為啟動(dòng)子整合到了C10菌株的基因組上，分別得到突變株C11（PGAPerr1）和C12（PGAP-er（NADH））。對(duì)C11、C12菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵（表3）。C11和C12的赤蘚糖醇產(chǎn)量均為1.2 g/L，與C10的搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量一致。C10菌株在搖瓶發(fā)酵中沒有檢測(cè)到阿拉伯糖醇，而C11和C12的阿拉伯糖醇產(chǎn)量分別達(dá)到4.9和5.1 g/L，說明過表達(dá)的2個(gè)還原酶對(duì)核酮糖底物也可能具有一定的還原活性，因此，造成了阿拉伯糖醇產(chǎn)量的提升。

表3 突變株C11和C12搖瓶發(fā)酵產(chǎn)物Table 3 Products of shake-flask fermentation of mutant C11 and C12

對(duì)副產(chǎn)物含量較少的菌株C11進(jìn)行了高密度發(fā)酵（圖8）。C11高密度發(fā)酵的濕重最高可達(dá)320.0 mg/mL，赤蘚糖醇在發(fā)酵過程中一直積累，發(fā)酵結(jié)束時(shí)產(chǎn)量?jī)H為2.1 g/L，相比C10的高密度發(fā)酵有較大幅度的降低。副產(chǎn)物阿拉伯糖醇和核糖醇產(chǎn)量達(dá)到了17.9和18.5 g/L，相比C10的高密度發(fā)酵有很大程度的提高，再次說明在P. pastoris中過表達(dá)赤蘚糖還原酶對(duì)赤蘚糖醇的生產(chǎn)具有負(fù)面作用。

圖8 畢赤酵母菌株C11高密度發(fā)酵Fig. 8 High-cell-density fermentation with strain P. pastoris C11

3 討論

在過去的幾十年里，P. pastoris已經(jīng)進(jìn)行了許多成功的糖基化研究，使這種甲基營(yíng)養(yǎng)酵母成為最常用的蛋白質(zhì)，特別是人源蛋白質(zhì)表達(dá)酵母宿主之一［29]。P. pastoris已被用于在工業(yè)水平上生產(chǎn)各種重組蛋白產(chǎn)品，包括微生物蛋白、酶和生物制藥蛋白［30]。近期，它被報(bào)道用于合成高價(jià)值的生物活性物質(zhì)。在P. pastoris中融合表達(dá)LevB1、SacB兩個(gè)酶，1.5 L生物反應(yīng)器水平下，從160 g蔗糖可以獲得72.9 g不含單糖的Levan型低聚果糖［31]。應(yīng)用糖基磷脂酰肌醇錨定系統(tǒng)，將β-葡萄糖苷酶BGL、內(nèi)切葡聚糖酶EG、纖維二糖水解酶CBH共同展示在P. pastoris表面，結(jié)合SPI1啟動(dòng)子和分泌信號(hào)序列進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞表面纖維素酶活性，獲得能將磷酸溶脹纖維素水解為葡萄糖的P. pastoris菌株，在此基礎(chǔ)上表達(dá)丙酮酸裂解酶UbiC，進(jìn)行96 h分批發(fā)酵，該菌株從磷酸溶脹纖維素產(chǎn)生了975 mg/L 4-羥基苯甲酸，產(chǎn)量比以葡萄糖為底物高2倍以上［32]。通過聯(lián)合過表達(dá)ZWF1和SOL3提高NADPH供應(yīng)，過表達(dá)腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶增強(qiáng)AMP供應(yīng)，低強(qiáng)度表達(dá)NADH激酶POS5，敲除NADH依賴性二羥基丙酮磷酸還原酶得到P. pastoris X33-38菌株。經(jīng)過72 h搖瓶發(fā)酵產(chǎn)生了3.09 g/L α-法尼烯，產(chǎn)量比出發(fā)菌株高41.7%［33]。近幾年研究表明，P. pastoris是性狀優(yōu)良的高價(jià)值生物活性物質(zhì)生產(chǎn)平臺(tái)。

P. pastoris的眾多優(yōu)勢(shì)是選擇它作為生產(chǎn)赤蘚糖醇的宿主細(xì)胞的原因，但在本研究開展的過程中也發(fā)現(xiàn)以該菌株作為底盤細(xì)胞生產(chǎn)高價(jià)值化合物時(shí)存在一些缺點(diǎn)，特別是應(yīng)用代謝工程的方法改造P.pastoris生產(chǎn)赤蘚糖醇的過程中，伴隨著大量副產(chǎn)物的產(chǎn)生。P. pastoris是耐滲透酵母，當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境中糖濃度較高時(shí)，會(huì)通過產(chǎn)生一些物質(zhì)維持滲透壓平衡。經(jīng)過弱化糖酵解途徑，增加戊糖磷酸途徑的碳流量，發(fā)酵產(chǎn)物中出現(xiàn)了副產(chǎn)物阿拉伯糖醇和核糖醇。根據(jù)之前的報(bào)道，包括核糖醇和阿拉伯糖醇在內(nèi)的一些糖醇化合物是酵母菌的滲透調(diào)節(jié)劑［14]。通過調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，向培養(yǎng)基中添加一定量的NaCl能夠?qū). lipolytica的副產(chǎn)物甘露醇和阿拉伯糖醇分別減少46%和30%［17]，也可以說明產(chǎn)生滲透調(diào)節(jié)劑是酵母菌的應(yīng)激反應(yīng)。盡可能地敲除副產(chǎn)物合成途徑且不產(chǎn)生新的副產(chǎn)物是代謝工程改造菌株研究中的一個(gè)重要部分。本研究選擇了產(chǎn)生核糖醇和阿拉伯糖醇的關(guān)鍵基因并對(duì)其進(jìn)行敲除，副產(chǎn)物產(chǎn)量明顯下降，且沒有新的副產(chǎn)物生成。戊糖磷酸途徑中關(guān)鍵酶的活性對(duì)赤蘚糖醇的生產(chǎn)至關(guān)重要，核糖醇和阿拉伯糖醇等副產(chǎn)物的產(chǎn)生也說明P. pastoris中核酮糖-5-磷酸的轉(zhuǎn)化受到了一定的限制。因此，本研究選擇過表達(dá)S. cerevisiae來源的3-磷酸核酮糖差向異構(gòu)酶rpe1以及轉(zhuǎn)酮醇酶TKL1，使更多的碳源流向產(chǎn)物。根據(jù)先前的報(bào)道，來源于Y. lipolytica和T. reesei的赤蘚糖還原酶對(duì)赤蘚糖具有較高的催化活性，但同時(shí)對(duì)其他底物，如阿拉伯糖、果糖等也有一定的活性［27-28]，而且不同來源的赤蘚糖還原酶的底物特異性也有所不同。本研究選擇過表達(dá)這兩個(gè)酶進(jìn)一步提高赤蘚糖醇產(chǎn)量，但是結(jié)果顯示赤蘚糖醇的合成并未提升，反而造成了阿拉伯糖醇產(chǎn)量的提高，因此，推測(cè)這兩個(gè)酶可能對(duì)核酮糖也有一定還原活性，后續(xù)研究將對(duì)具有專一性的赤蘚糖還原酶進(jìn)行探索。傳統(tǒng)的發(fā)酵方法是利用游離的菌體通過發(fā)酵獲得產(chǎn)品，有研究將細(xì)胞固定化的方法應(yīng)用到生產(chǎn)赤蘚糖醇中，通過將底盤細(xì)胞M. pollinis固定在2 L生物反應(yīng)器內(nèi)，96 h生產(chǎn)了47.03 g/L赤蘚糖醇，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞固定化生產(chǎn)赤蘚糖醇［34]。在后續(xù)的工作中可以嘗試將此方法用于P. pastoris或其他酵母菌株來生產(chǎn)赤蘚糖醇以及更有價(jià)值的化合物。

4 結(jié)論

以P. pastoris為底盤細(xì)胞構(gòu)建了赤蘚糖醇合成通路，弱化糖酵解途徑關(guān)鍵基因，敲除阿拉伯糖醇和核糖醇等副產(chǎn)物生產(chǎn)相關(guān)基因，過表達(dá)糖醇磷酸酶和4-磷酸赤蘚糖磷酸化酶基因有利于赤蘚糖醇的生產(chǎn)。強(qiáng)化戊糖磷酸途徑關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)酮酶和磷酸核酮糖差向異構(gòu)酶的表達(dá)，大幅提高了赤蘚糖醇的產(chǎn)量。最優(yōu)菌株在搖瓶和高密度發(fā)酵中赤蘚糖醇的產(chǎn)量分別達(dá)到1.2和10.6 g/L。

文章所有附表數(shù)據(jù)請(qǐng)到本刊官網(wǎng)下載（http://biotech.aiijournal.com/CN/1002-5464/home.shtml）。