付凱璇,王雪穎,黃彥喆,薛海曌,胡英菡,趙宗保

1(中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所,遼寧 大連,116000)2(中國科學(xué)院大學(xué),北京,100000)

1,3-丙二醇(1,3-propanediol,1,3-PD)是重要化工原料,廣泛應(yīng)用于食品、化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域[1]。根據(jù)GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》,丙二醇的功能為穩(wěn)定劑和凝固劑、抗結(jié)劑、消泡劑、乳化劑、水分保持劑、增稠劑。目前1,3-PD生產(chǎn)方法主要分為化學(xué)法和生物法,與化學(xué)合成法相比,生物合成法有著設(shè)備成本低、條件溫和、環(huán)境友好的優(yōu)點(diǎn)[2]。因此,生物轉(zhuǎn)化,尤其是以廉價原料甘油轉(zhuǎn)化生產(chǎn)1,3-PD,引起廣泛關(guān)注。目前已在克雷伯氏菌屬(Klebsiella)[3]、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)[4]、乳桿菌屬(Lactobacillus)[5]中發(fā)現(xiàn)了將甘油轉(zhuǎn)化為1,3-PD的天然途徑。該天然途徑涉及兩種關(guān)鍵酶,一是甘油脫水酶(glycerol dehydratase, GDHt, EC 4.2.1.30),可將甘油轉(zhuǎn)化為3-羥基丙醛(3-hydroxypropionaldehyde, 3-HPA);二是1,3-丙二醇氧化還原酶(1,3-propanediol oxidoreductase, PDOR, EC 1.1.1.202),在NADH的參與下,將3-HPA還原為1,3-PD(圖1-a、圖1-b)[6]。來源于肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)的PDOR(KpPDOR)由于其較高的催化活性和穩(wěn)定性被廣泛研究(圖1-c)。KpPDOR適宜pH范圍窄,其最適pH值為7.4,而在pH 5.0和pH 10.0時還原活性僅剩40%和20%。溫度也是影響KpPDOR活性的因素,在37 ℃還原活性最佳,在20 ℃和55 ℃活性均降低10%[7]。PDOR作為生物合成1,3-PD的限速酶之一,其催化活性,耐溫、耐酸堿及穩(wěn)定性是制約1,3-PD生物制造的重要因素。

a-甘油轉(zhuǎn)化為1,3-丙二醇;b-微生物甘油轉(zhuǎn)化合成1,3-丙二醇途徑;c-K.pneumoniae來源PDOR晶體結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)定向進(jìn)化已被廣泛應(yīng)用于提高工業(yè)酶在高溫、酸堿環(huán)境和有機(jī)溶劑中的活性和穩(wěn)定性[8],主要方法包括隨機(jī)突變、半理性設(shè)計和理性設(shè)計。隨機(jī)突變方法需構(gòu)建大量突變體文庫和篩選,JIANG等[9]通過構(gòu)建K.pneumoniae來源的PDOR的隨機(jī)突變文庫,篩選到氧化活性比野生型PDOR提高4.9倍的A199S突變體。然而,上述方法過程復(fù)雜且工作量大。半理性設(shè)計方法基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和序列信息,結(jié)合計算機(jī)輔助,篩選熱點(diǎn)殘基,有效提高文庫構(gòu)建效率。PARVEZ等[10]利用序列比對和蛋白結(jié)構(gòu)信息,改造來源于丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum) PDOR的二聚體界面氨基酸,經(jīng)定點(diǎn)飽和突變和篩選,獲得突變體P299E,在pH 4.0比野生型PDOR還原活性提高5倍,以及N298C,在pH 8.0下寬溫度范圍內(nèi)還原活性提高,但該研究屬半理性方法,仍需構(gòu)建單位點(diǎn)飽和突變文庫并篩選上千突變體。理性設(shè)計方法通過計算機(jī)技術(shù)分析蛋白結(jié)構(gòu)和序列信息,指導(dǎo)小而精的定點(diǎn)突變文庫設(shè)計,提高定向進(jìn)化效率。目前,生物信息學(xué)工具PoPMuSiC 2.1,通過計算蛋白突變的去折疊自由能ΔΔG,預(yù)測蛋白質(zhì)突變后穩(wěn)定性,其計算相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.8[11],已成功輔助改良阿魏酸酯酶[12]、甘油脫水酶[13]和角蛋白酶[14]等蛋白的活性和穩(wěn)定性。HotSpot Wizard 3.0被廣泛應(yīng)用于識別蛋白的熱點(diǎn)氨基酸,以提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、催化活性、底物特異性等[15],其內(nèi)置的CAVE、JSD和Fpocket組件可識別位于活性中心且突變后可提高催化功能的可變殘基。

本工作通過計算機(jī)輔助的方法,結(jié)合序列保守性分析,確立KpPDOR定點(diǎn)突變,最終獲得催化性能、熱穩(wěn)定性、pH耐受性提高的突變體N262E和V155N。此外,進(jìn)一步通過蛋白結(jié)構(gòu)模擬探究了KpPDOR性能改良的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化甘油合成1,3-PD,發(fā)現(xiàn)突變體N262E和V155N工程菌株1,3-PD產(chǎn)能高于野生型KpPDOR工程菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和培養(yǎng)基

本研究使用大腸桿菌(Escherichiacoli) BL21(DE3)作為蛋白質(zhì)表達(dá)的宿主,Synbio Technologies股份有限公司合成肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)來源的PDOR的編碼基因dhaT,克隆在質(zhì)粒pTrc99K-dhaT。通用生物股份有限公司合成丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)來源的GDHt的編碼基因dhaB12,克隆在質(zhì)粒pET15b-dhaB12。2.6節(jié)中的工程菌株含有以上2個質(zhì)粒。

LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,氯化鈉10 g/L。

TB培養(yǎng)基:胰蛋白胨12 g/L,酵母提取物24 g/L,磷酸氫二鉀0.072 mol/L,磷酸二氫鉀0.017 mol/L,甘油4 mL/L。

1.1.2 引物

引物由上海生工生物股份有限公司合成,如表1所示。

表1 本研究所用引物

1.1.3 主要試劑和儀器

NADH、3-HPA、甘油,北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司。

Power Wave XS全波長酶標(biāo)掃描儀,Bio-Tek Instruments Inc;Molecular Operating Environment(CCG),Montreal;AVANCE Ⅲ核磁共振譜儀(400 MHz),Bruker。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1K.pneumoniae來源PDOR的理性設(shè)計

PoPMuSiC 2.1(http://babylone.ulb.ac.be/popmusic)上傳KpPDOR(PDB ID:3BFJ)晶體結(jié)構(gòu),計算各位點(diǎn)突變后的去折疊自由能(ΔΔG),選取ΔΔG負(fù)值顯著的作為定點(diǎn)突變。用HotSpot Wizard 3.0 (https://loschmidt.chemi.muni.cz/)內(nèi)置的CAVE、JSD和Fpocket組件預(yù)測功能熱點(diǎn)氨基酸,選取可變性分?jǐn)?shù)(mutability score)≥6的氨基酸,并結(jié)合BLAST組件分析這些氨基酸的保守性,最終確定突變位點(diǎn)。

1.2.2 突變體的構(gòu)建和酶活性測定

以質(zhì)粒pTrc99K-dhaT為模板,通過不依賴限制性內(nèi)切酶的克隆(RF克隆)方法[16]引入定點(diǎn)突變,PCR產(chǎn)物使用DpnI消化,電轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,復(fù)蘇后,涂布于含卡那霉素的LB平板,37 ℃培養(yǎng)16 h,轉(zhuǎn)化子送上海生物工程有限公司測序。

將構(gòu)建成功的突變體進(jìn)行活性鑒定,24孔板培養(yǎng)野生型KpPDOR及其突變體的菌株,每孔2.5 mL LB,50 μg/mL卡那霉素,0.1 mmol/L IPTG,25 ℃誘導(dǎo)48 h,設(shè)置野生型KpPDOR為正對照,含pTrc99K空載體的E.coliBL21(DE3)為負(fù)對照,設(shè)置3個平行;培養(yǎng)結(jié)束收集菌體,每孔加入細(xì)胞裂解液250 μL[Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)10 mmol/L,MgCl21 mmol/L,溶菌酶1 mg/mL,DNaseI 0.1 mg/mL],37 ℃裂解2 h,離心留上清液。酶活性檢測體系:37 ℃,N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, HEPES](pH 7.5)50 mmol/L,3-HPA 30 mmol/L,(NH4)2SO430 mmol/L,NADH 0.8 mmol/L,粗酶液10 μL。根據(jù)反應(yīng)液在340 nm光吸收變化測定突變體的活性。

1.2.3KpPDOR和N262E、V155 N的純化

純化活性高于野生型KpPDOR的突變體蛋白,將野生型KpPDOR其突變體的菌體使用TB培養(yǎng),50 μg/mL卡那霉素,0.1 mmol/L IPTG,25 ℃誘導(dǎo)48 h。菌液離心,收集菌體,洗滌后。置于冰浴中超聲破碎,離心收集裂解液上清,上清液倒入Ni-NTA層析柱,先后以洗滌緩沖液NWB(50 mmol/L NaH2PO4,0.5 mol/L NaCl,40 mmol/L咪唑,pH 8.0)洗滌雜蛋白,以洗脫緩沖液NEB(50 mmol/L NaH2PO4,0.5 mol/L NaCl,250 mmol/L咪唑,pH 8.0)洗脫,收集蛋白溶液,于超濾離心管中超濾濃縮。用Bradford方法以BSA為標(biāo)準(zhǔn)品測定蛋白質(zhì)濃度。在12%變性SDS-PAGE凝膠中分析純化的N262E和V155N蛋白,以BeyoColorTM彩色預(yù)染蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(10～170 kDa)確定目的蛋白分子質(zhì)量。

1.2.4 酶活力的測定

還原反應(yīng)酶活性檢測體系37 ℃,HEPES(pH 7.5) 50 mmol/L,3-HPA 30 mmol/L,(NH4)2SO430 mmol/L,NADH 0.8 mmol/L,野生型和突變體純酶0.56 μg/mL。每個樣品設(shè)置3個平行。氧化反應(yīng)測定體系為37 ℃,HEPES(pH 7.5) 50 mmol/L,(NH4)2SO430 mmol/L、NAD 2 mmol/L,酶0.52 μg/mL,1,3-PD 100 mmol/L。根據(jù)反應(yīng)液在340 nm光吸收變化測定突變體的活性。酶活力單位的定義:每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol NADH所需的酶量。NADH的摩爾消光系數(shù)為6.22 L/(mmol·cm)。

1.2.5 酶學(xué)性質(zhì)研究

測定突變體在pH 2.0～12.0的酶活力,所用緩沖液為甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH 2.4) 100 mmol/L、乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 4.0) 100 mmol/L、HEPES緩沖液(pH 7.5) 50 mmol/L、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 10.0) 50 mmol/L和氯化鉀-氫氧化鈉緩沖液(pH 12.0)200 mmol/L。檢測體系3-HPA 30 mmol/L、(NH4)2SO430 mmol/L、NADH 0.8 mmol/L、酶0.56 μg/mL,酶在37 ℃分別與pH 2.0～12.0的緩沖液孵育2 min后,加入3-HPA和NADH啟動反應(yīng)。根據(jù)反應(yīng)液在340 nm光吸收變化測定突變體的活性。每個樣品設(shè)置3個平行。研究酶的pH穩(wěn)定性。酶在37 ℃分別與pH 2.0～12.0的緩沖液孵育1 h后,測定酶活力,以孵育2 min酶活力為100%,每個樣品設(shè)置3個平行。

測定突變體在溫度25～55 ℃的酶活力,檢測體系HEPES(pH 7.5) 50 mmol/L,3-HPA 30 mmol/L、(NH4)2SO430 mmol/L、NADH 0.8 mmol/L和酶0.56 μg/mL。酶在pH 7.5,25～55 ℃孵育2 min后,加入3-HPA和NADH啟動反應(yīng)。根據(jù)反應(yīng)液在340 nm光吸收變化測定突變體的活性。每個樣品設(shè)置3個平行。研究酶的溫度穩(wěn)定性,酶分別在pH 7.5,25～55 ℃孵育1 h后,測定酶的殘余活力,以孵育2 min 酶活力為100%。每個樣品設(shè)置3個平行。

將純化后的KpPDOR及N262E,V155N在pH 7.5,37 ℃孵育,于0、30、60、120、180、240、300、330 min取樣并測定殘余酶活力。以孵育2 min酶活力為100%。將殘余酶活力的 ln值為對時間t作圖,計算酶失活速率常數(shù)k,由公式t1/2=ln2/k,計算酶的半衰期。

1.2.6 酶動力學(xué)

還原反應(yīng)測定體系為HEPES(pH 7.5) 50 mmol/L,(NH4)2SO430 mmol/L、NADH 0.8 mmol/L,酶0.52 μg/mL,3-HPA梯度濃度,加超純水至100 μL,每個樣品設(shè)置3個平行。將酶在37 ℃,pH 7.5孵育2 min后。加入3-HPA和NADH啟動反應(yīng)。根據(jù)反應(yīng)液在340 nm光吸收變化測定突變體的活性。氧化反應(yīng)測定體系為HEPES (pH 7.5) 50 mmol/L,(NH4)2SO430 mmol/L、NAD 2 mmol/L,酶0.52 μg/mL,1,3-PD梯度濃度,方法同上,每個樣品設(shè)置3個平行。使用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,計算動力學(xué)常數(shù)。

1.2.7 酶結(jié)構(gòu)分析

使用分子操作環(huán)境(molecular operating environment,MOE)分別進(jìn)行KpPDOR野生型和突變體的結(jié)構(gòu)分析。選擇KpPDOR的晶體結(jié)構(gòu)的A鏈作為模板,在A鏈的基礎(chǔ)上進(jìn)行定點(diǎn)突變,并能量最小化。

1.2.8 靜息細(xì)胞催化

1.2.8.1 樣品準(zhǔn)備

將1.1.1節(jié)中的質(zhì)粒pET15b-dhaB12通過電轉(zhuǎn)化的方法分別轉(zhuǎn)入含有KpPDOR野生型和突變體質(zhì)粒的E.coliBL21(DE3)中,構(gòu)建工程菌株。將KpPDOR野生型和突變體的工程菌接入LB培養(yǎng)基(50 μg/mL卡那霉素和100 μg/mL羧芐青霉素)接菌,37 ℃培養(yǎng)12 h,以初始OD600值為0.05轉(zhuǎn)接于50 mL LB培養(yǎng)基(50 μg/mL卡那霉素,50 μg/mL羧芐青霉素 0.2 mmol/L IPTG),25 ℃誘導(dǎo)48 h。取7.5×109個細(xì)胞,用50 mmol/L HEPES緩沖液(pH 7.5)洗1次,然后用0.5 mL靜息細(xì)胞反應(yīng)液(50 mmol/L HEPES,40 mmol/L 甘油)重懸,37 ℃、200 r/min反應(yīng)2 h。加入等體積0.1 mol/L HCl終止,離心,取上清液。將樣品冷凍干燥,后溶于0.5 mL氘水中,加入順丁烯二酸使其終濃度為60 mmol/L。

1.2.8.2 定量核磁檢測產(chǎn)物

采用定量核磁氫譜方法(quantitative nuclear magnetic hydrogen spectroscopy,1H-qNMR)檢測1,3-PD含量,為了精準(zhǔn)定量,選取合適的內(nèi)標(biāo)順丁烯二酸,其在氘水溶劑中化學(xué)位移6.3且不與樣品峰重合。設(shè)置D1為30 s以保證目的氫核馳豫充分;掃描次數(shù)NS為32以保證信噪比。

1.2.8.3 數(shù)據(jù)處理

將圖譜先進(jìn)行基線和峰形的校正。根據(jù)文獻(xiàn)[17],1.7～1.8的五重峰歸屬與1,3-PD C2的2個氫原子,因此使用1.7～1.8處峰定量1,3-PD,利用核磁氫譜不同化學(xué)位移的氫峰面積與氫核數(shù)目成正比,用已知含量的順丁烯二酸作為定量標(biāo)準(zhǔn),對1,3-PD進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 理性設(shè)計定向突變

PoPMuSiC 2.1預(yù)測的結(jié)果(圖2)顯示了每個殘基的最優(yōu)突變及其對應(yīng)的去折疊自由能(ΔΔG),從中選擇ΔΔG負(fù)值顯著的L38E、V99H、G144T、V155N作為定點(diǎn)突變位點(diǎn)(圖2-c)。HotSpot Wizard 3.0內(nèi)置的CAVE、JSD和Fpocket組件預(yù)測功能熱點(diǎn)氨基酸,選取可變性分?jǐn)?shù)≥6的氨基酸作為候選位點(diǎn)(圖2-a),結(jié)合內(nèi)置的BLAST組件分析候選位點(diǎn)序列保守性(圖2-b),其第276、272、283和262位氨基酸出現(xiàn)頻率最高的分別是Phe、Pro、Leu、Gly和Glu。綜上,構(gòu)建L38E、V99H、G144T、V155N、N262E、N262G、L276F,Q272P,V283L共9個突變體(表2)。

表2 KpPDOR定點(diǎn)突變位點(diǎn)

a-HotSpot Wizard 3.0功能熱點(diǎn)氨基酸分析;b-HotSpot Wizard 3.0序列保守性分析;c-PoPMuSiC 2.1去折疊自由能分析;d-最終選定的突變位點(diǎn)

2.2 突變體的構(gòu)建和活性鑒定

由RF克隆成功構(gòu)建點(diǎn)突變后的質(zhì)粒(圖3-a),轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)中。測定KpPDOR及突變體在37 ℃,pH 7.5的對3-HPA的還原活性,結(jié)果如圖3-b所示,N262E的還原活性是KpPDOR的1.1倍,V155N是KpPDOR的1.7倍。其余突變體活性均低于KpPDOR。將野生型KpPDOR、N262E、V155N通過Ni-NTA蛋白純化系統(tǒng)純化,并進(jìn)行SDS-PAGE鑒定,KpPDOR、N262E、V155N純化后蛋白無雜帶,分子質(zhì)量約為42 kDa(圖3-c)。

M-蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn);泳道1-WT;泳道2-N262E;泳道3-V155N

2.3 酶學(xué)性質(zhì)探究

2.3.1 酶在不同pH的活性和穩(wěn)定性

分別檢測了KpPDOR及其突變體在pH 2.0～12.0條件下的還原活性(圖4-a),KpPDOR最適pH 7.5,N262E、V155N的最適pH與KpPDOR一致。酸性條件(pH 4.0)下,V155N和N262E的酶活性分別為KpPDOR的2.5倍和1.9倍。堿性條件(pH 10.0)下,V155N酶活性為KpPDOR的1.6倍。因此,V155N在pH 4.0～10.0,N262E在pH 4.0～7.5活性高于KpPDOR,這表明V155N和N262E能適應(yīng)更寬泛的pH條件。

a-KpPDOR和突變體在25～55 ℃的活性;b-KpPDOR和突變體在25～55 ℃的熱穩(wěn)定性;c-KpPDOR和突變體在pH 2.0～12.0時的活性;d-KpPDOR和突變體在pH 2.0～12.0時的穩(wěn)定性;e-KpPDOR和突變體在37 ℃時的半衰期;f-KpPDOR和突變體的Michaelis-Menten方程

pH穩(wěn)定性的結(jié)果顯示(圖4-b),在pH 2.0～12.0孵育1 h后,KpPDOR分別保留57%、72%、76%、73%、64%、59%的殘余酶活力,V155N和N262E在相同條件下處理后,V155N和N262E殘余酶活力略高于KpPDOR,pH穩(wěn)定性優(yōu)于KpPDOR。

2.3.2 酶在不同溫度的活性和穩(wěn)定性

分別檢測了KpPDOR及其突變體在25～55 ℃條件下的活性(圖4-c),KpPDOR最適溫度為37 ℃,N262E、V155N與KpPDOR一致。V155N在25、37、45、55 ℃酶活性分別是是KpPDOR的1.3、1.8、1.2、1.4倍。這表明V155N在不同溫度下保持更高的催化活性。

酶熱穩(wěn)定性結(jié)果顯示(圖4-d),在25～55 ℃孵育1 h后,N262E分別保留87%、90%、84%、74%的殘余酶活力,高于KpPDOR,V155N在25～55 ℃殘余酶活力略高于KpPDOR。因此,N262E和V155N熱穩(wěn)定性優(yōu)于KpPDOR。

2.3.3 酶半衰期測定

測定KpPDOR和V155N、N262E在37 ℃,pH 7.5孵育0～300 min的殘余酶活力(圖4-d)。結(jié)果表明,在孵育120 min后,KpPDOR保留71%的酶活力,V155N和N262E分別保留78%和84%的殘余酶活力;在孵育240 min后,野生型KpPDOR保留56%的殘余酶活力,而V155N和N262E分別保留酶活力的64%和71%。N262E在37 ℃的半衰期為462 min,為KpPDOR的1.4倍,V155N的半衰期為365 min,為KpPDOR的1.1倍(圖4-e)。

2.4 酶動力學(xué)

測定KpPDOR和V155N、N262E的對還原反應(yīng)的底物3-HPA和氧化反應(yīng)底物1,3-PD的動力學(xué)數(shù)據(jù)(表3)。KpPDOR比酶活51.16 U/mg,V155N和N262E比酶活分別為72.08 U/mg和60.22 U/mg,分別比KpPDOR提高41%和18%。從還原反應(yīng)來看,V155N和N262E的Km分別為KpPDOR的0.59倍和0.85倍,表明其對3-HPA結(jié)合親和力提高,催化效率kcat/Km分別為KpPDOR的2.7倍和1.49倍。氧化反應(yīng)與還原反應(yīng)的數(shù)據(jù)結(jié)果相互印證。

表3 野生型和突變體動力學(xué)

2.5 酶的結(jié)構(gòu)分析

MOE分析野生型KpPDOR和V155N、N262E蛋白結(jié)構(gòu),如圖5所示。N取代155位上的V后,蛋白結(jié)構(gòu)引入兩個氫鍵,V155N側(cè)鏈氮原子與D106側(cè)鏈羧基的氧原子形成距離2.01 ?的氫鍵;側(cè)鏈氧原子與K164側(cè)鏈氮原子形成距離2.72 ?的氫鍵(圖5-b)。氫鍵作為一種強(qiáng)非共價相互作用力,可穩(wěn)定155位氨基酸所在的β-折疊,從而提高酶穩(wěn)定性[18]。E取代262位N,N262E的羧基與R152上胍基的兩個氮原子形成距離分別為3.72 ?和3.97 ?的氫鍵(圖5-d),增強(qiáng)了催化中心的剛性[19]。

a-野生型V155位點(diǎn)與周圍氨基酸相互作用;b-突變體V155N位點(diǎn)與周圍氨基酸相互作用;c-野生型N262位點(diǎn)與周圍氨基酸相互作用;d-突變體N262E位點(diǎn)與周圍氨基酸相互作用

2.6 靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化結(jié)果

通過靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化,以甘油為底物轉(zhuǎn)化合成1,3-PD,以1H-qNMR方法對野生型KpPDOR和突變體V155N、N262E的工程菌1,3-PD產(chǎn)量進(jìn)行定量,該方法具有快速便捷的優(yōu)點(diǎn)[20]。圖6為不同菌株反應(yīng)后產(chǎn)物的核磁共振氫譜,用已知含量的順丁烯二酸作為定量標(biāo)準(zhǔn),以1.7～1.8的五重峰[17]對1,3-PD進(jìn)行定量。

a-野生型KpPDOR反應(yīng)后的譜圖;b-N262E反應(yīng)后的譜圖;c-V155N反應(yīng)后的譜圖;d-BL21(DE3)負(fù)對照反應(yīng)后的譜圖

經(jīng)數(shù)據(jù)處理,各體系中1,3-PD含量如表4所示。將順丁烯二酸的峰面積歸一化為2。經(jīng)2 h的靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化后,野生型KpPDOR轉(zhuǎn)化后1,3-PD含量為12.3 mmol/L,產(chǎn)能0.82 mmol/L/OD600。突變體N262E和V155N轉(zhuǎn)化后的1,3-PD產(chǎn)能分別提升至0.90 mmol/L/OD600和1.16 mmol/L/OD600。這說明突變體對甘油生物轉(zhuǎn)化為1,3-PD具有促進(jìn)作用。

表4 1H-qNMR數(shù)據(jù)處理結(jié)果

3 結(jié)論與討論

1,3-PD在食品領(lǐng)域常作為加工助劑、吸濕劑和溶劑。在備受關(guān)注的甘油生物轉(zhuǎn)化合成1,3-PD中,KpPDOR是其中的關(guān)鍵限速酶之一,因此,其催化活性、熱穩(wěn)定性和pH耐受性的改良有重要價值。本研究改造KpPDOR的策略,一方面借助PoPMuSiC 2.1計算蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的重要指標(biāo)去折疊自由能ΔΔG,一方面借助Hotspot wizard 3.0功能熱點(diǎn)分析和保守序列分析,理性選取定點(diǎn)突變位點(diǎn)。最終成功獲得性能改良的N262E和V155N突變體,其可促進(jìn)甘油轉(zhuǎn)化為1,3-PD。這說明其具有應(yīng)用于1,3-PD生物制造的潛力。

本工作獲得25～55 ℃酶活力高于KpPDOR的V155N,以及熱穩(wěn)定性高于KpPDOR的N262E,這拓寬了該酶在工業(yè)生產(chǎn)中寬溫度范圍的活性和穩(wěn)定性。此外,寬pH范圍的活性和穩(wěn)定性對1,3-PD合成也是至關(guān)重要的。有研究表明,由于微生物發(fā)酵產(chǎn)1,3-PD 積累有機(jī)酸,導(dǎo)致胞內(nèi)pH值的下降會抑制KpPDOR活性,降低1,3-PD產(chǎn)量[21]。此外,有研究報道,pH 6.5時體外合成1,3-PD的產(chǎn)率是中性條件下的2.2倍[22]。這表明弱酸性環(huán)境有利于體外合成1,3-PD合成,因此提高KpPDOR耐酸性具有必要性。V155N pH 4.0的酸性條件下催化活性為KpPDOR的2.5倍,且同時在更寬溫度范圍活性高于KpPDOR。綜上分析表明,V155N具有應(yīng)用于微生物內(nèi)和體外環(huán)境生產(chǎn)1,3-PD的潛力。

本工作通過蛋白結(jié)構(gòu)分析,加深了對蛋白結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)識。氫鍵作為蛋白最重要的非共價相互作用力,對維持蛋白質(zhì)的二級、三級結(jié)構(gòu)起到關(guān)鍵作用[23]。V155位于KpPDOR的β-折疊,N取代155位上的V,引入兩個氫鍵,與其形成氫鍵的D106和K164分別位于KpPDOR的α-螺旋和β-折疊(圖4-b),氫鍵穩(wěn)定了該區(qū)域的二級結(jié)構(gòu),從而使V155N在較寬的pH和溫度范圍內(nèi)的維持較穩(wěn)定的構(gòu)象,以發(fā)揮其活性。有研究表明,改造酶活性中心結(jié)構(gòu)靈活的殘基可提高酶穩(wěn)定性和活性,如引入氫鍵可提高催化中心剛性,使蛋白更穩(wěn)定[19]。KpPDOR催化中心的262位點(diǎn)引入兩個氫鍵(圖4-d),提高其剛性,利于其在極端條件下保持催化中心的正確構(gòu)象[24]。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以上結(jié)構(gòu)分析表現(xiàn)出一致性。如需進(jìn)一步闡明KpPDOR構(gòu)效關(guān)系,可結(jié)合X射線衍射、核磁共振和遠(yuǎn)、近紫外光譜等手段來研究蛋白結(jié)構(gòu)。

綜上所述,基于理性設(shè)計的方法指導(dǎo)KpPDOR改造,成功改良其催化活性、熱穩(wěn)定性和耐酸性,有望提升1,3-PD的生物制造的產(chǎn)能,從而降低其在食品工業(yè)中的成本。獲得性能優(yōu)化的突變體后,進(jìn)一步通過結(jié)構(gòu)分析闡釋了性能優(yōu)化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),加深了對生物酶構(gòu)效關(guān)系的認(rèn)識。本研究使用的理性設(shè)計的思路,也為改良其他工業(yè)酶的性能提供了指導(dǎo)。