姚紅紅,任學(xué)梅,嚴(yán)幻汝,祝霞,2,楊學(xué)山,2*

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅 蘭州,730070) 2(甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州,730070)

源自葡萄果實(shí)的萜烯、甲氧基吡嗪、C13-降異戊二烯和揮發(fā)性硫醇等品種香氣化合物,是呈現(xiàn)葡萄酒風(fēng)格和特色的關(guān)鍵因素[1-2]。它們?cè)跐{果成熟期不斷合成和積累,主要以游離態(tài)或糖苷鍵合態(tài)形式存在[3]。含量遠(yuǎn)大于游離態(tài)的非揮發(fā)性鍵合態(tài)香氣前體物,需要在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)酸解或糖苷酶催化,釋放出香氣糖苷配基才能被消費(fèi)者感知[4]。酸解過(guò)程效率較低,且會(huì)造成部分配基重排[5];而酶解反應(yīng)能高效釋放糖苷配基,最大程度避免香氣化合物重排。在已研究的葡萄香氣糖苷中,葡萄糖與阿拉伯糖、鼠李糖或木糖等進(jìn)一步縮合而成的二糖苷占總糖苷的80%;其次為葡萄糖單糖苷(約10%),三糖苷含量最低[2]。因此,高效酶解釋放二糖苷鍵合態(tài)香氣前體物質(zhì),是提高葡萄酒品種香氣典型性的重要途徑。

二糖苷鍵合態(tài)化合物在酶解時(shí),首先根據(jù)糖苷的差異,分別被α-L-阿拉伯糖苷酶(α-L-arabinofuranosidase,α-L-Ara,E.C 3.2.1.55)、α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase,α-L-Rha,E.C 3.2.1.40)或β-D-木糖苷酶(β-D-xylosidase,β-Xyl,E.C 3.2.1.37)等催化,釋放出相應(yīng)的單萜基-β-D-葡萄糖苷;再在β-D-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,β-Glu,E.C 3.2.1.21)作用下即可釋放出揮發(fā)性香氣苷元[6]。有研究顯示,在葡萄酒釀造過(guò)程中外源性添加的糖苷酶,其活力易受發(fā)酵溫度、pH和SO2等因子的抑制,影響作用效果[7]。存在于釀酒葡萄果皮表面的非釀酒酵母(non-Saccharomycesyeasts)菌株,作為酒精發(fā)酵前期的主要驅(qū)動(dòng)力,雖然發(fā)酵能力較弱,但可以合成活力更高、適應(yīng)性更強(qiáng)的糖苷酶[8]。彭傳濤[9]從云南、河南和河北3個(gè)葡萄酒產(chǎn)區(qū)共分離485株酵母菌,通過(guò)篩選鑒定得到1株高產(chǎn)β-Glu的葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum),將其用于葡萄酒增香釀造試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)葡萄酒感官質(zhì)量和香氣成分明顯增強(qiáng);徐建坤[10]從吐魯番盆地釀酒葡萄表皮篩選得到92株酵母菌,并進(jìn)一步篩選高產(chǎn)β-Glu的菌株,發(fā)現(xiàn)5株產(chǎn)β-Glu較高的菌株,將其用于葡萄酒釀造,發(fā)現(xiàn)優(yōu)選菌株對(duì)釋放源自葡萄的結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)具有顯著作用;SPAGNA等[11]對(duì)300多株酵母菌進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)1株異常畢赤酵母(Pichiaanomala)表現(xiàn)出較高的α-L-Ara活力;SABEL等[12]通過(guò)對(duì)異常維克漢遜酵母(Wickerhamomycesanomalus)產(chǎn)β-Glu的研究發(fā)現(xiàn),該菌株也表現(xiàn)出了較高的α-L-Ara和β-Xyl活力,具有良好的葡萄酒增香釀造潛力?？傮w而言,目前關(guān)于非釀酒酵母菌株的β-Glu及其對(duì)葡萄酒香氣品質(zhì)的研究相對(duì)較多,但對(duì)高產(chǎn)二糖苷酶優(yōu)良菌株的篩選及相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)的研究還十分欠缺。

甘肅河西走廊產(chǎn)區(qū)葡萄種植歷史悠久,風(fēng)土條件獨(dú)特,具備篩選本土非釀酒酵母菌株的自然資源優(yōu)勢(shì)。本試驗(yàn)分別從產(chǎn)區(qū)各子產(chǎn)地采集主栽釀酒葡萄進(jìn)行自然發(fā)酵,通過(guò)七葉苷定性顯色法和對(duì)硝基苯酚(p-nitrophenol,p-NP)定量法篩選高產(chǎn)β-Glu、α-L-Ara、α-L-Rha、β-Xyl的優(yōu)良本土非釀酒酵母菌株;并探討各糖苷酶對(duì)葡萄酒釀造因子的響應(yīng)規(guī)律,評(píng)價(jià)發(fā)酵條件對(duì)菌株所產(chǎn)糖苷酶活力的影響。以期篩選、鑒定優(yōu)良本土非釀酒酵母菌株,為產(chǎn)區(qū)葡萄酒增香釀造提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

在采收期分別從甘肅河西走廊葡萄酒廠采集主栽釀酒葡萄:嘉峪關(guān)紫軒(威代爾、美樂)、高臺(tái)祁連(貴人香、蛇龍珠)、張掖國(guó)風(fēng)(美樂、赤霞珠)和武威莫高(貴人香、黑比諾)各10 kg,用無(wú)菌塑料袋封裝,冷藏條件下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。樣品總糖198.85～279.00 g/L、pH 3.48～3.95、可滴定酸(酒石酸計(jì))5.08～6.51 g/L,符合釀酒要求。

七葉苷、對(duì)硝基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside,p-NPG)、4-硝基苯基-α-L-吡喃鼠李糖苷(p-nitrophenyl-α-L-mannopyranoside,p-NP-αRha)、4-硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷(p-Nitrophenyl-α-L-arabinopyranoside,p-NP-αAra)、4-硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷(p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside,p-NP-βXyl),上海源葉生物科技有限公司;酵母浸粉、蛋白胨,北京奧博星生物技術(shù)有限公司;無(wú)水葡萄糖、無(wú)水碳酸鈉、檸檬酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂等均為國(guó)產(chǎn)分析純,天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái)、GZX-GF10-Ⅱ型恒溫干燥箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;LDZX-50KBS型立式高壓蒸汽滅菌器,上海申安醫(yī)療器械廠;電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;生化培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;pHS-3C型pH計(jì),上海雷磁責(zé)任有限公司;TU-1810型可見分光光度計(jì),上海元析儀器有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基[13](g/L):葡萄糖20,酵母浸粉10,蛋白胨20,自然pH,固體培養(yǎng)基加入20 g/L的瓊脂,121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基[14](g/L):蛋白胨20,葡萄糖20,NH4NO33,KH2PO44,MgSO4·7H2O 0.5,吐溫80 1%(體積分?jǐn)?shù))和酵母浸粉20。

WL培養(yǎng)基:購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。稱取80.25 g干粉加入1 000 mL蒸餾水中,加熱溶解分裝,121 ℃滅菌20 min,pH值為5.5±0.2。

初篩培養(yǎng)基[15](g/L):七葉苷3、檸檬酸鐵0.5、NaCl 2、MgSO4·7H2O 0.5、KH2PO41,121 ℃滅菌20 min。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 菌株分離純化

葡萄分選、除梗破碎后,加入30 mg/L SO2,分批裝入5 L的玻璃發(fā)酵罐中,25 ℃自然發(fā)酵(樣液以子產(chǎn)區(qū)酒廠名稱+品種首字母命名)。每隔24 h測(cè)定發(fā)酵液的還原糖和酒精度變化。當(dāng)發(fā)酵液殘?zhí)恰? g/L時(shí),終止發(fā)酵。

待發(fā)酵啟動(dòng)后,分別于2、4、6、8、10 d各取樣1 mL。樣液以十進(jìn)制進(jìn)行梯度稀釋,選取稀釋梯度為10-4、10-5、10-6的菌液,無(wú)菌吸取0.1 mL,均勻涂布于加有100 mg/L氯霉素(抑制細(xì)菌生長(zhǎng))的WL培養(yǎng)基上,并在28 ℃條件下培養(yǎng)3～5 d后,觀察菌落顏色形態(tài)及大小。

根據(jù)菌落顏色、形態(tài)及大小,挑取單菌落,在加有100 mg/L氯霉素的YPD固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)2～3代后,挑取菌落形態(tài)一致的菌株接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基活化48 h。配制40%的滅菌甘油,與菌液按照1∶1(體積比)的比例加入甘油管,-80 ℃保藏。

1.4.2 產(chǎn)β-Glu菌株初篩

七葉靈(6,7-2-羥基-香豆素-β-D-葡萄糖苷)在β-Glu的作用下能生成葡萄糖和七葉苷原(6,7-2-羥基-香豆素),七葉苷原和Fe3+作用呈棕黑色[16],可對(duì)菌株產(chǎn)酶情況進(jìn)行初步定性分析。將再次YPD液體培養(yǎng)基活化后的菌株,分別按5%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接入到含有七葉苷篩選培養(yǎng)基的96孔板中,28 ℃培養(yǎng)24 h后,根據(jù)顏色變化,將其分為高酶活力(深黑色“++++”)、較高酶活力(黑色“+++”)、中酶活力(深灰色“++”)、低酶活力(灰色“+”)和無(wú)酶活力(白色“-”)5個(gè)顯色等級(jí)。對(duì)顯色結(jié)果為深黑色的菌株,按照產(chǎn)區(qū)首字母大寫+品種名稱首字母大寫+菌株序號(hào)進(jìn)行編號(hào)后,分別進(jìn)行β-Glu、α-L-Ara、α-L-Rha、β-Xyl活力定量測(cè)定。

1.4.3 產(chǎn)糖苷酶菌株酶活力測(cè)定

(1)β-Glu:酶活力測(cè)定反應(yīng)體系:200 μL反應(yīng)底物(5 mmol/Lp-NPG),750 μL 0.2 mol/L檸檬酸-0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 5.0),250 μL培養(yǎng)液;反應(yīng)條件:50 ℃恒溫水浴30 min。反應(yīng)結(jié)束后加入1 mL 1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)。在400 nm處測(cè)定吸光度。

酶活力單位(U)定義為pH 5.0,50 ℃反應(yīng)條件下,1 min水解p-NPG生成1 μmolp-NP所需酶量。

(2)二糖苷酶:參考祝霞等[18]的方法。分別以p-NP-αRha、p-NP-αAra、p-NP-βXyl為底物。反應(yīng)體系:250 μL培養(yǎng)液,130 μL底物,600 μL 0.2 mol/L檸檬酸-0.1 mol/L磷酸緩沖液;反應(yīng)條件同β-Glu測(cè)定。加入1 mL 0.5 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)后,在400 nm 處測(cè)定吸光度。

酶活力單位(U)定義為pH 5.0、50 ℃條件下,每1 min水解p-NP-αRha、p-NP-αAra、p-NP-βXyl產(chǎn)生1 μmolp-NP所需酶量。

1.4.4 優(yōu)選菌株鑒定

將優(yōu)選菌株活化后涂布于WL培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)72 h,根據(jù)菌落形態(tài)特征進(jìn)行初步分類。并對(duì)所選菌株進(jìn)行重新命名,將M-H-1、Q-S-3、Z-W-2和Z-W-5分別命名為HX-1、HX-2、HX-3和HX-4。

基因組DNA提取。采用正向引物NL15′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′和NL4反向引物5′-GGTCCGTGGTTCAAGACGG-3′擴(kuò)增26S rDNA。對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序后,登錄NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行BLAST分析。

1.4.5 糖苷酶的釀酒適應(yīng)性分析

將保藏在-80 ℃的優(yōu)選菌株接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基活化48 h,配制pH 3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、5.0、6.0、7.0的檸檬酸-磷酸緩沖液,按1.4.3節(jié)的方法(下同),測(cè)定菌株糖苷酶活力。

固定檸檬酸-磷酸緩沖液體系為pH 5.0,分別在水浴溫度為15、20、25、30、40、50、60、70 ℃、葡萄糖含量0、25、50、100、150、200、250、300 g/L、乙醇體積分?jǐn)?shù)0%、5%、10%、12%、14%、15%、SO2添加量為0、10、20、30、40、50、60 mg/L(以Na2S2O5計(jì))的參數(shù)條件下,測(cè)定糖苷酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 自然發(fā)酵期間還原糖和酒精度的變化

發(fā)酵醪液還原糖和酒精度動(dòng)力學(xué)曲線分別見圖1-A、圖1-B。整體而言,發(fā)酵初期(1～2 d),還原糖逐步下降,酒精度逐步上升;發(fā)酵中期(3～5 d),還原糖大幅下降,酒精度大幅上升;發(fā)酵后期(6～10 d),還原糖下降變緩,酒精度上升也變緩;當(dāng)酒中還原糖含量≤4 g/L 時(shí),發(fā)酵結(jié)束。取不同發(fā)酵階段(2、4、6、8、10 d)的發(fā)酵液進(jìn)行菌株分離純化,得到912株酵母菌株。

A-還原糖含量;B-酒精度

2.2 產(chǎn)β-Glu菌株初篩

利用96孔板七葉苷培養(yǎng)基的顯色反應(yīng)(圖2),按照顯色等級(jí)初步定性判定供試菌株β-Glu活力高低,快速?gòu)?12株酵母菌中篩選出191株顯色等級(jí)不同的產(chǎn)β-Glu菌株。產(chǎn)酶菌株在不同發(fā)酵時(shí)期和不同產(chǎn)區(qū)分布不同,第2天高產(chǎn)β-Glu菌株共20株,其中分離自MGH有4株,MGG 1株,QLS 1株,ZXM 8株,ZXW 4株,GFM 2株。第4天高產(chǎn)β-Glu的菌株共有24株,其中MGH 1株,MGG 1株,ZXM 16株,ZXW 3株,GFM 3株。第6天高產(chǎn)β-Glu的菌株數(shù)量大幅下降,共有5株,其中QLS 2株,QLG 1株,GFM 2株。第8天和第10天未檢測(cè)到產(chǎn)酶菌株,可能與發(fā)酵后期酒精含量較高,抑制了非釀酒酵母菌株的生長(zhǎng)繁殖有關(guān)。綜上,通過(guò)七葉苷定性初步篩選,共初選得到49株高產(chǎn)β-Glu菌株,其中分離自紫軒的高產(chǎn)β-Glu 菌株占比最高(ZXM 49.0%、ZXW 14.3%)。由此表明,非釀酒酵母菌株產(chǎn)糖苷酶的能力具有菌株差異性,且與生存的自然風(fēng)土條件及發(fā)酵生境的動(dòng)態(tài)變化存在一定相關(guān)性。

圖2 供試菌株在七葉苷培養(yǎng)基中的顯色篩選

2.3 菌株產(chǎn)糖苷酶活力定量測(cè)定

為了更準(zhǔn)確表征初篩菌株的產(chǎn)酶能力,采用p-NP比色法分別對(duì)初篩得到的49株菌進(jìn)行β-Glu、α-L-Ara、α-L-Rha、β-Xyl活力定量測(cè)定,結(jié)果如圖3所示。其中β-Glu活力較高的菌株有M-H-1(12.391 mU/mL)、Z-W-2(9.414 mU/mL)、Q-S-3(13.642 mU/mL)、Z-W-5(12.441 mU/mL)、Z-M-19(8.868 mU/mL)、Z-M-25(8.364 mU/mL)、G-M-5(10.593 mU/mL)。α-L-Ara活力較高的菌株有M-H-1(8.491 mU/mL)、Q-S-3(5.991 mU/mL)、Z-W-2(7.130 mU/mL)、Z-W-5(9.159 mU/mL)、Z-M-3(7.948 mU/mL)。α-L-Rha活力較高的菌株有M-H-1(8.305 mU/mL)、Z-W-2(6.959 mU/mL)、Q-S-3(5.334 mU/mL)、Z-W-5(6.721 mU/mL),β-Xyl活力較高的菌株有M-H-1(18.725 mU/mL)、Z-W-2(13.476 mU/mL)、Z-M-1(6.379 mU/mL)、Q-S-3(6.369 mU/mL),Z-W-5(6.291 mU/mL)。結(jié)合二糖苷香氣前體物酶解釋放的反應(yīng)過(guò)程,綜合評(píng)價(jià)篩選結(jié)果,M-H-1、Z-W-2、Z-W-5和Q-S-3菌株不僅可以合成β-Glu,而且可以分泌高活力的二糖苷酶,具有在與釀酒酵母混菌發(fā)酵葡萄酒過(guò)程中增香的釀造應(yīng)用潛力。為了便于后期應(yīng)用,將上述4株菌依次分別命名為HX-1、HX-2、HX-3和HX-4。

圖3 本土菌株糖苷酶活性熱圖聚類分析

2.4 優(yōu)選菌株系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將優(yōu)選菌株涂布于WL固體培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)72 h后的菌落形態(tài)見圖4。菌株HX-1、HX-3(圖4-A、圖4-B)菌落呈綠色,邊緣透明,扁平,表面光滑,有透明環(huán),符合葡萄汁有孢漢遜酵母屬的菌落形態(tài)特征。菌株HX-2、HX-4(圖4-C、圖4-D)菌落呈突面,表面光滑,符合美極梅奇酵母屬(Metschnikowiapulcherrima)的菌落形態(tài)特征。

4株供試菌BLAST分析系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果如圖5所示。相同的種被歸于一個(gè)主分枝內(nèi),表明它們具有較近的親緣性,而不同的種被歸于不同的亞分枝上,顯示它們?cè)贒1/D2區(qū)域序列上具有明顯區(qū)別。HX-1、HX-3與葡萄汁有孢漢遜酵母模式菌株X22-9、APY13的基因序列相似性達(dá)到98%以上,確定菌株HX-1與HX-3均為葡萄汁有孢漢遜酵母。HX-2、HX-4與美極梅奇酵母模式菌株NRRLY-7111的基因序列相似性>99%,確定菌株HX-3與HX-4為美極梅奇酵母。

圖5 基于26S rDNA序列的酵母菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 菌株糖苷酶對(duì)釀造因子的適應(yīng)性分析

葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中,大多數(shù)非釀酒酵母菌株在發(fā)酵初期占主導(dǎo)地位,其生長(zhǎng)繁殖及所產(chǎn)糖苷酶活力受葡萄汁營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和發(fā)酵溫度、pH、酒精、糖含量和SO2添加量等的影響。通過(guò)測(cè)定各菌株糖苷酶在不同發(fā)酵條件下的活力并分析其變化規(guī)律,有助于在釀造過(guò)程中依據(jù)葡萄原料香氣糖苷特點(diǎn),合理選擇發(fā)酵菌株并優(yōu)化生產(chǎn)工藝參數(shù)。

2.5.1 菌株β-Glu活力變化

由圖6-A可知,4株菌所產(chǎn)β-Glu的最適pH均為5.0。pH 3.0～4.0時(shí),菌株HX-4的酶活力保持在pH 5.0時(shí)的79.31%～96.99%,HX-2的酶活力保持在84.50%～91.09%。圖6-B表明,溫度對(duì)4株菌的酶活力的影響存在差異,除HX-4菌株外,其他3株菌的β-Glu最適溫度均為50 ℃;15～30 ℃時(shí),HX-2的酶活力保持在最大酶活力的8.60%以上;HX-4保持在84.92%以上,而HX-3下降至最大酶活力的57.24%。由圖6-C可知,高質(zhì)量濃度葡萄糖會(huì)抑制β-Glu活力,隨著葡萄糖含量的增大,4株菌酶活力均有不同程度的下降。其中HX-3菌株酶活力下降幅度最大,為初始酶活力(葡萄糖含量0 g/L)的61.59%,其他3株菌酶活力均保持在70%以上;當(dāng)葡萄糖含量較低(<25 g/L)時(shí),對(duì)HX-2和HX-4菌株的酶活力有小幅促進(jìn)作用。乙醇體積分?jǐn)?shù)<5%時(shí),對(duì)酶活力幾乎沒有影響(圖6-D);隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大,酶活力開始小幅下降,當(dāng)酶活力>12%時(shí),除HX-2的酶活力保持在初始酶活力(乙醇體積分?jǐn)?shù)0%)的95%以上,其他3株菌的酶活力下降幅度均增大;其中HX-3下降幅度最大(降幅32.07%),HX-1和HX-4菌株酶活力下降幅度≤14%,說(shuō)明高乙醇含量對(duì)HX-1和HX-4菌株酶活力影響較小。隨著SO2含量增大,各菌株酶活力整體呈下降趨勢(shì),但對(duì)HX-4菌株的酶活力影響較小(圖6-E)。

A-pH;B-溫度;C-葡萄糖含量;D-乙醇體積分?jǐn)?shù);E-SO2

葡萄酒釀造生境是一個(gè)低pH(3.0～4.0)、較低溫度(15～30 ℃)、高SO2(40～60 mg/L),且葡萄糖含量逐漸降低,酒精度逐漸上升的過(guò)程。綜合圖6結(jié)果可知,在葡萄酒釀造條件范圍內(nèi),HX-2和HX-4菌株可以保持較高的β-Glu活力。

2.5.2 菌株α-L-Rha活力變化

由圖7-A可知,4株菌所產(chǎn)α-L-Rha最適pH值為5.0。隨著pH降低,酶活力下降幅度(22.42%～34.36%)比pH上升時(shí)降幅(13.49%～27.89%)更大,說(shuō)明α-L-Rha對(duì)低pH耐受性較弱。當(dāng)pH值在3.0～4.0時(shí),HX-1可保持pH 5.0時(shí)酶活力的69.58%～91.96%。圖7-B顯示,HX-1的最適溫度在40～50 ℃,其他3株菌的最適溫度為50 ℃。15～30 ℃時(shí),HX-1菌株的酶活力在最適溫度時(shí)的85.88%以上,相較其他3株菌能夠保持較高的酶活力。隨著葡萄糖含量的增大,菌株酶活力受到抑制,其中HX-1,HX-3保持較高酶活力,分別為初始酶活力的81.60%和77.09%;除HX-4外,低葡萄糖含量(<50 g/L)對(duì)其他3株菌酶活力有不同程度的促進(jìn)作用(圖7-C)。乙醇體積分?jǐn)?shù)<12%時(shí),對(duì)α-L-Rha活力抑制作用不明顯,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大,酶活力下降幅度增大,其中HX-2降幅(18.54%)最大(圖7-D)。圖7-E表明,SO2含量對(duì)4株菌α-L-Rha活力均有抑制作用,當(dāng)SO2含量>40 mg/L時(shí),HX-3酶活力大幅(29.53%)下降,而其他3株菌酶活力下降幅度(10%左右)大致相同。綜合圖7結(jié)果可以看出,在葡萄酒釀造條件范圍內(nèi),來(lái)源于HX-1的α-L-Rha活力始終保持較高水平,具有較高耐受性。

A-pH;B-溫度;C-葡萄糖含量;D-乙醇體積分?jǐn)?shù);E-SO2

2.5.3 菌株α-L-Ara活力變化

由圖8-A可知,4株菌所產(chǎn)α-L-Ara最適pH值為5.0。pH 3.0～4.0時(shí),菌株酶活力均保持在74%以上,其中HX-1和HX-4保持在82%以上。圖8-B,α-L-Ara最適溫度在50～60 ℃。15 ℃～30 ℃時(shí),HX-1和HX-2酶活力保持了最適溫度時(shí)的83.60%以上,其他2株菌酶活力在75.72%以上。圖8-C表明,較低葡萄糖含量(<50 g/L)對(duì)部分菌株酶活力具有促進(jìn)作用;而隨著葡萄糖含量的增大,α-L-Ara活力呈下降趨勢(shì),其中HX-3下降幅度(降幅31.80%)最大,其他3株菌降幅在23%左右,說(shuō)明該酶對(duì)高葡萄糖耐受性較低。如圖8-D所示,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到10%時(shí),對(duì)酶活力抑制作用增大,其中HX-2酶活力下降至初始酶活力的70.45%,HX-1,HX-4酶活力保持在84%以上。SO2含量對(duì)4株菌α-L-Ara活力均有抑制作用,且從圖8-E來(lái)看,不同菌株酶活力下降程度差異不明顯,4株菌酶活力均保持在初始酶活力(不添加SO2)87.74%以上。綜合圖8結(jié)果可知,在葡萄酒發(fā)酵條件下,HX-4菌株所產(chǎn)α-L-Ara可以保持較高酶活力。

A-pH;B-溫度;C-葡萄糖含量;D-乙醇體積分?jǐn)?shù);E-SO2

2.5.4 菌株β-Xyl活力變化

如圖9-A可知,不同菌株β-Xyl最適pH不同,其中HX-1的最適pH值為6.0,其他3株菌的最適pH值為5.0。pH值在3.0～4.0時(shí),HX-3保持在91%以上,HX-1在80%以上。β-Xyl最適溫度在50～60 ℃,溫度對(duì)不同菌株β-Xyl的影響差異較明顯,其中對(duì)HX-1酶活力影響程度較大。15～30 ℃時(shí),HX-3保持了86.98%～94.58%的酶活力,HX-2、HX-4酶活力保留了62.13%～82.31%(圖9-B)。圖9-C表明,葡萄糖含量對(duì)4株菌β-Xyl活力均有抑制作用。隨著葡萄糖含量增大,HX-2和HX-4菌株酶活力下降10%左右;當(dāng)葡萄糖含量<100 g/L時(shí),HX-1和HX-3酶活力迅速下降(降幅43.6%和32.7%)。圖9-D顯示,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大,HX-1酶活力下降趨勢(shì)(降幅58.22%)增大;而乙醇體積分?jǐn)?shù)<12%時(shí),其他3株菌下降趨勢(shì)平緩(降幅14%左右)。由圖9-E可以看出,SO2對(duì)4株菌的β-Xyl均有較低抑制作用,其中HX-2和HX-3酶活力保持在初始酶活力的94%以上。綜上,雖然HX-1的β-Xyl對(duì)溫度和乙醇含量耐受性較低,但其初始酶活力相較其他3株菌為最高,在釀造條件下仍可保持較高酶活力。

A-pH;B-溫度;C-葡萄糖含量;D-乙醇體積分?jǐn)?shù);E-SO2

3 討論

本研究通過(guò)p-NP比色法測(cè)定了河西走廊產(chǎn)區(qū)本土非釀酒酵母菌株的β-Glu、α-L-Ara、α-L-Rha、β-Xyl活力,最終優(yōu)選出高產(chǎn)單糖苷和/或二糖苷酶的4株非釀酒酵母菌株。經(jīng)26S rDNA D1/D2序列分析,確定HX-1和HX-3為葡萄汁有孢漢遜酵母,HX-2和HX-4為美極梅奇酵母。4株菌產(chǎn)酶結(jié)果表明,HX-1所產(chǎn)4種酶活力都較高,與MATEO等[19]篩選的2株葡萄汁有孢漢遜酵母的產(chǎn)酶情況一致;HX-3的β-Glu和β-Xyl表現(xiàn)出高活力,HX-4的β-Glu和α-L-Ara表現(xiàn)出高活力,HX-2僅對(duì)β-Glu表現(xiàn)出高活力,表明非釀酒酵母合成分泌糖苷酶具有種間和種內(nèi)菌株差異[20]。

菌株糖苷酶釀造適應(yīng)性研究發(fā)現(xiàn),其酶活力易受溫度、pH和SO2等發(fā)酵條件的影響。本研究中,各糖苷酶最適pH值為5.0～6.0,且pH對(duì)不同菌株糖苷酶活力的影響有較大差異,其中β-Glu活力變化最大,這與KUO等[21]的研究結(jié)果一致。本研究中各糖苷酶最適溫度在30～60 ℃,與來(lái)源于真菌的糖苷酶最適溫度在30～60 ℃的結(jié)論一致[22],且大部分菌株糖苷酶對(duì)高溫耐受性更高,與馬得草[7]的結(jié)果一致。HU等[23]指出,高葡萄糖含量對(duì)膠紅酵母β-Glu具有抑制作用,且隨著葡萄糖含量的增大抑制作用越明顯。本研究中各糖苷酶活力均被抑制,表明糖苷酶對(duì)葡萄糖耐受性較低。除來(lái)源于HX-1的β-Xyl外,其他菌株各糖苷酶活力受乙醇影響的結(jié)果相似,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)<10%或12%時(shí),酶活力下降幅度較小,部分菌株酶活力保持穩(wěn)定,與BAFFI等[24]對(duì)出芽短梗霉β-Glu在乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%和15%時(shí)分別保持了94%和71%的初始活性一致,且在β-Xyl中也得到同樣的結(jié)果[17]。有研究表明,低濃度的SO2(<20 mg/L)對(duì)非釀酒酵母的生長(zhǎng)繁殖并不會(huì)起到抑制作用,質(zhì)量濃度過(guò)高(>50 mg/L)才會(huì)表現(xiàn)出抑制作用,且一些非釀酒酵母對(duì)SO2具有較高的耐受性[25],本研究中除HX-3 α-L-Rha在SO2含量>40 mg/L時(shí)下降幅度(29.53%)較大外,SO2含量對(duì)其他菌株各糖苷酶活力影響差異不明顯,說(shuō)明菌株各糖苷酶對(duì)SO2具有較高的耐受性。

已有研究表明,不同葡萄品種香氣糖苷含量及種類不同,甚至有些品種具有其獨(dú)特的糖苷種類[26]。例如,在小粒麝香葡萄中,含量最豐富的香氣糖苷是葡萄糖苷和芹菜糖苷,分別為37%和35%[27];在Ecolly、蛇龍珠和玫瑰香中分別檢測(cè)到7、9和13種萜烯糖苷,其中4種為這3種葡萄所共有,而芳樟醇-3-O-α-L-阿拉伯呋喃-β-D-吡喃葡萄糖苷為Ecoll所特有,吡喃氧化芳樟醇-α-L-阿拉伯呋喃-β-D-吡喃葡萄糖苷為蛇龍珠所特有[28]。劉吉彬[29]通過(guò)研究4個(gè)不同芳香型葡萄品種(小白玫瑰、玫瑰香、愛格麗和蛇龍珠)中萜烯類香氣糖苷,共檢測(cè)到16種萜烯類糖苷:玫瑰香(13種)、蛇龍珠(9種)、小白玫瑰(9種)、愛格麗(7種),其中8-羥基里哪醇-芹菜糖呋喃基-葡萄糖苷與香茅醇-芹菜糖呋喃基-葡萄糖苷僅存在于玫瑰香葡萄果實(shí)中,吡喃-氧化里哪醇-呋喃阿拉伯糖基-葡萄糖苷僅存在于愛格麗葡萄果實(shí)中。因此,針對(duì)不同葡萄品種中糖苷含量和種類的不同,選擇產(chǎn)對(duì)應(yīng)糖苷酶較高的非釀酒酵母應(yīng)用于葡萄酒釀造,對(duì)葡萄酒香氣提升及特色葡萄酒生產(chǎn)具有重要意義。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)以甘肅河西走廊各子產(chǎn)區(qū)主栽釀酒葡萄自然發(fā)酵的酒樣為試材,選取不同發(fā)酵時(shí)期的發(fā)酵液分離純化得到912株酵母菌。利用96孔板七葉苷培養(yǎng)基進(jìn)行糖苷酶活性初篩,并采用p-NP法對(duì)供試菌株的β-Glu、α-L-Ara、α-L-Rha、β-Xyl粗酶液進(jìn)行定量測(cè)定。酶活力熱圖聚類分析結(jié)果顯示,菌株HX-1、HX-2、HX-3、HX-4的4種酶活力均表現(xiàn)出較高水平。菌株26S rDNA D1/D2 PCR擴(kuò)增測(cè)序結(jié)果表明,HX-1和HX-3為葡萄汁有孢漢遜酵母,HX-2和HX-4為美極梅奇酵母。

葡萄酒釀造因子對(duì)不同菌株酶活力耐受性的影響具有菌株依賴性,高乙醇、高葡萄糖和SO2含量對(duì)各糖苷酶均有抑制作用。在正常葡萄酒釀造條件范圍內(nèi),HX-2和HX-4菌株的β-Glu保持了較高活力;HX-1菌株的α-L-Rha、HX-4菌株的α-L-Ara、HX-1和HX-3的β-Xyl活力較高。因此,在實(shí)際釀酒生產(chǎn)中,可根據(jù)不同葡萄品種中香氣糖苷含量及種類,選擇對(duì)應(yīng)糖苷酶活力較高的菌株應(yīng)用于葡萄酒釀造。