蘇璐璐 朱文瑩 陳旭 王輝 曹依林 王富

摘要：本試驗以‘Micro-Tom番茄為試材，對其綠熟期（CR）、轉(zhuǎn)色期（BR）及紅熟期（RR）果實進行轉(zhuǎn)錄組學及代謝組學分析。轉(zhuǎn)錄組學分析結(jié)果表明，CR至RR過程中果實內(nèi)與可溶性糖相關(guān)的磷酸葡萄糖變位酶基因（PCM）、糖原磷酸化酶基因（CPH等下調(diào)，1，4-a-葡聚糖分支酶基因（SBE）、蔗糖合酶基因（SuSy/）等上調(diào)；參與抗壞血酸合成途徑的CDP-L-半乳糖磷酸化酶基因（CCP）、單脫氫抗壞血酸還原酶基因（MDHAR）一直呈現(xiàn)上調(diào)趨勢；而參與葉綠素降解、類胡蘿卜素合成的多數(shù)基因以及與細胞壁代謝相關(guān)的眾多基因則呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的趨勢；番茄堿生物合成途徑CAME家族基因呈先下調(diào)后上調(diào)的表達模式。代謝組學數(shù)據(jù)表明，與品質(zhì)形成有關(guān)的D-果糖、古洛糖酸、異檸檬酸、L-谷氨酸和L-天門冬氨酸等在番茄成熟過程中含量呈現(xiàn)持續(xù)增加的趨勢，L-蘋果酸呈下降趨勢，L-精氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸在BR至RR過程中增加明顯；槲皮素-3-0-葡萄糖苷、柚皮素在轉(zhuǎn)色期明顯增加。綜合可見，‘Micro-Tom番茄果實成熟過程中，可溶性糖、有機酸、氨基酸、黃酮類化合物等代謝物積累及關(guān)鍵基因表達均發(fā)生了規(guī)律性變化，可初步解析番茄果實品質(zhì)形成過程。

關(guān)鍵詞：番茄；轉(zhuǎn)錄組學；代謝組學；果實品質(zhì)

中圖分類號：S641.201：Q78 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2023）02-0009-11

番茄是一種重要的蔬菜作物，2018年我國番茄栽培面積110.9萬公頃，其中設施番茄面積64.2萬公頃。隨著人們生活水平的提高，番茄果實品質(zhì)尤其是口感和風味品質(zhì)受到更多關(guān)注，關(guān)于果實成熟過程中的品質(zhì)形成機理已有較多報道，利用多組學手段分析番茄果實品質(zhì)的相關(guān)研究成為近年來的研究熱點。Lu等研究發(fā)現(xiàn)，番茄果實成熟受MADS-type轉(zhuǎn)錄反饋回路的調(diào)控。大規(guī)模番茄果實ChIP-chip和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析證實，RIN通過直接結(jié)合和激活與成熟相關(guān)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)和調(diào)控基因ACS2/4、SGR1、Psy、Cel2、EXP1、PAL1、C4H、Loxc、AAT1、CNR、NOR、AP2a及其自身，在番茄果實成熟過程中發(fā)揮著重要作用。黃麗華等檢測了櫻桃番茄以及5份野生番茄的代謝物，并對其葉片和果實中有機酸、氨基酸及糖類含量進行了分析，結(jié)果顯示櫻桃番茄中含有豐富的營養(yǎng)成分，且除水分以外，各種營養(yǎng)成分均比大宗番茄高。Fraser等研究表明，番茄果實中番茄紅素脫氫酶基因的表達與B-胡蘿卜素、葉黃素等的含量密切相關(guān)。Moco等比較了番茄果肉和果皮間代謝物的差異，并建立了包含上百種代謝物的番茄代謝組數(shù)據(jù)庫。Tieman等研究顯示，番茄成熟果實中28種代謝物與其品質(zhì)風味和口感顯著相關(guān)，其中3-甲基丁醇可顯著提高果實的甜感。

上述研究多以成熟番茄果實為主，但對番茄果實品質(zhì)形成過程的研究目前鮮有報道，且番茄果實成熟過程中物質(zhì)代謝及基因表達的變化是高度復雜的，要明確番茄果實品質(zhì)形成的機理仍需要大量研究。本研究以‘Micro -Tom番茄為試材，對綠熟期、轉(zhuǎn)色期及紅熟期的果實進行轉(zhuǎn)錄組學和代謝組學分析，以明確番茄果實成熟過程中品質(zhì)形成的代謝物基礎和轉(zhuǎn)錄水平的變化，探索番茄果實品質(zhì)形成過程，為番茄優(yōu)質(zhì)栽培和育種提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試番茄品種為‘Micro -Tom，由青島農(nóng)業(yè)大學番茄育種課題組提供。于2021年3-7月開展試驗。將番茄種子洗凈后播種于72孔穴盤中，置于青島農(nóng)業(yè)大學人工氣候室，待幼苗長至三葉一心時移栽至直徑12 cm的花盆繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光周期12 h光/12 h暗，光照強度8 0001x，溫度25℃/18℃，空氣濕度75%；分別在果實綠熟期、轉(zhuǎn)色期和紅熟期取樣，將果實切碎，液氮冷凍，放于-80℃冰箱保存，待用。綠熟期、轉(zhuǎn)色期和紅熟期樣品分別標記為GR、BR和RR。

1.2試驗方法

1.2.1番茄果實轉(zhuǎn)錄組學測定及分析 取綠熟期、轉(zhuǎn)色期、紅熟期番茄果實混樣進行轉(zhuǎn)錄組測序，每組處理設置3次生物學重復，提取RNA后進行純化、建庫，然后使用第二代高通量測序技術(shù)（NGS），基于Illumina測序平臺進行文庫的雙末端（PE）測序，該部分工作由上海派森諾生物科技有限公司進行。將測序得到的數(shù)據(jù)進行基因的差異表達、GO富集及KEGG富集分析。

1.2.2轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的qRT-PCR驗證 采用So-larbio試劑盒，提取不同時期的番茄果肉總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒TaKaRa（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板、Actin為內(nèi)參進行qRT-PCR。利用在線引物設計軟件（https：//quantprime.mpimp-golm.mpg.de/）對所篩選的差異基因設計定量引物（表1），通過溶解曲線分析確認其特異性。qRT-PCR采用TaKaRa試劑盒（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司），在羅氏定量PCR儀上完成，程序設置為：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 60 s，40個循環(huán)。所有試驗均設置3個生物學重復，相對表達水平的計算方法為2-△△a法。

1.2.3番茄果實代謝組學測定及分析 取綠熟期、轉(zhuǎn)色期和紅熟期果實各6次重復共18個樣本進行代謝組分析。該部分工作由上海派森諾生物科技有限公司進行，實驗方法參照De Vos和San-gster等的方法。將得到的數(shù)據(jù)進行代謝產(chǎn)物的差異分析及KEGG富集分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同時期番茄果實轉(zhuǎn)錄組學分析

2.1.1差異表達基因分析 3個時期兩兩之間共檢測出18 601個差異表達基因（DEGs），其中GR與BR間（GR vs BR）存在6 537個DEGs，其中2 057個上調(diào)，4 480個下調(diào)；BR與RR間（BR vsRR）出現(xiàn)4 587個DEGs，其中2 042個上調(diào)，2 545個下調(diào)；GR與RR間（GR vs RR）檢測到7 477個DEGs，其中2 247個上調(diào)，5 230個下調(diào)。而且GR vs BR與BR vs RR之間有2 269個相同的DEGs，GR vs BR與GR vs RR之間有4 537個相同的DEGs，BR vs RR與GR vs RR之間有2 870個相同的DEGs，而GR vs BR、BR vs RR與GR vs RR三者之間共有1 240個相同的DEGs（圖1A）。

2.1.2差異表達基因的GO富集分析 GR vs BR的GO富集結(jié)果顯示，在細胞組分方面，DEGs主要富集在細胞周邊、細胞膜等條目上：在分子功能方面，主要富集在催化活性、單加氧酶活性等條目上：在生物過程方面，主要富集在碳水化合物代謝過程、單羧酸代謝過程等條目上（圖1B）。BR vs RR的GO富集結(jié)果顯示，在細胞組分方面，DEGs主要富集在光合系統(tǒng)、光合膜等條目上：在分子功能方面，主要富集在色素結(jié)合、葉綠素結(jié)合等條目上：生物過程方面主要富集在光合作用、蛋白質(zhì)一發(fā)色團連接等條目上（圖1C）。GR vs RR的GO富集結(jié)果顯示，在細胞組分方面，DEGs主要富集在細胞外圍、膜的固有成分等條目上：在分子功能方面，主要富集在色素結(jié)合、單加氧酶活性等條目上；在生物過程方面，主要富集在光合作用光系統(tǒng)中的光收集、光合作用光收集、次生代謝過程等條目上（圖1D）。

2.1.3差異表達基因的KEGG富集分析 KEGG富集分析結(jié)果顯示，GR vs BR共有1 247個差異基因注釋在119個通路上，富集較為顯著且與番茄果實品質(zhì)形成相關(guān)的通路主要有植物激素信號轉(zhuǎn)導、淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝、類黃酮生物合成等通路（圖2A）；BR vs RR共有848個差異基因注釋在109個通路上，富集較為顯著的有植物激素信號轉(zhuǎn)導、淀粉和蔗糖代謝、丙氨酸和天冬氨酸及谷氨酸的代謝、光合作用、類黃酮生物合成、果糖和甘露糖代謝等通路（圖2B）；GR vs RR共有1 440個差異基因注釋在117個通路上，其中1 111個差異基因被富集在87條代謝通路上，富集較為顯著的有植物激素信號轉(zhuǎn)導、淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝、糖酵解／糖異生、類黃酮生物合成等通路（圖2C）。

番茄果實由綠熟向紅熟轉(zhuǎn)變的過程中，蔗糖和淀粉代謝通路中的蔗糖磷酸合酶基因隨著果實的成熟一直呈現(xiàn)上調(diào)趨勢：參與抗壞血酸合成途徑的GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因（CCP）、單脫氫抗壞血酸還原酶基因（MDHAR）一直呈現(xiàn)上調(diào)趨勢：苯丙烷生物合成途徑中合成木質(zhì)素和柚皮素的反式肉桂酸4-單加氧酶表達呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的趨勢：類黃酮生物合成中5-0-（4-香豆酰）-D-奎寧酸3-單加氧酶基因、查爾酮合酶基因表達先上調(diào)后下調(diào)：另外在糖降解及其他代謝途徑中的一些與果實品質(zhì)形成相關(guān)的基因如糖原磷酸化酶基因（GPH）、磷酸葡萄糖變位酶基因（PGM）、異檸檬酸脫氫酶基因、谷胱甘肽生物合成酶基因也有不同程度的表達差異。

在果實由綠熟到轉(zhuǎn)色再到紅熟的過程中，與葉綠索降解關(guān)鍵基因SGRI、PPH均呈先上調(diào)后下調(diào)的趨勢：由綠熟期向轉(zhuǎn)色期轉(zhuǎn)變的過程中，與類胡蘿卜素生物合成相關(guān)的基因PSY1、PSY2、CRTISO、ZDS、PDS、BCH2、ZEP、NSY以及與細胞壁代謝相關(guān)的基因ExpJ、PC、PL、TBG4、CelJ、Cel2、XyL1等均呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢：與次級代謝產(chǎn)物形成相關(guān)的基因PAL、Tom LoxC、PPEAT、AAT1、FLORAlA、LIP8等均表現(xiàn)為先上調(diào)后下調(diào)的趨勢：多個參與花青素合成的基因如CHS1、CHI、F3H、F3'5'H、UGTs、F3HL等均表現(xiàn)為下調(diào)；參與生物堿合成的GORKy、SAMT以及GAME家族基因GAME1、CAME4、GAME5、GAME6、GAME11、GAME12、GAME17、CAME18均呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的趨勢：另外參與調(diào)控果實成熟與果實品質(zhì)形成的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在果實成熟過程中表達量也發(fā)生了較大的變化，如RIN表現(xiàn)為持續(xù)上調(diào)，NAC4、NAP2表現(xiàn)為先上調(diào)后下調(diào)的趨勢。

2.1.4 qRT-PCR驗證結(jié)果 為了驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準確性，我們篩選了12個差異表達基因，利用qRT-PCR對其進行表達分析，結(jié)果表明，盡管轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與qRT-PCR數(shù)據(jù)之間存在倍數(shù)上的差異，但是各個基因表達模式基本一致（圖3），這表明獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)是可信的，可以用于后續(xù)分析。

2.2不同時期番茄果實代謝組分析

2.2.1差異代謝物分析 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GR vs BR、BR vs RR、GR vs RR共鑒定出154種主要差異代謝物。其中GR vs BR、BR vs RR、GR vs RR分別存在138、103、144種差異代謝物，上調(diào)的分別有95、76、105種，下調(diào)的分別有43、27、39種。

差異代謝物中與番茄果實品質(zhì)形成相關(guān)的重要糖類、有機酸、氨基酸、類黃酮等物質(zhì)在番茄果實發(fā)育過程中的含量變化如表2所示。有機酸中反式肉桂酸在番茄果實成熟過程中呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢，異檸檬酸在果實發(fā)育過程中持續(xù)增加，L-蘋果酸在果實由BR至RR發(fā)育過程中明顯下降。氨基酸類化合物中的L-谷氨酸和L-天門冬氨酸在發(fā)育過程中逐漸增加，L-精氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸在BR至RR轉(zhuǎn)變過程中明顯增加：槲皮素-3-0-葡萄糖苷、柚皮素在轉(zhuǎn)色期明顯增加：糖類物質(zhì)D-果糖、D-麥芽糖在番茄果實從GR到BR的過程中含量增加。

2.2.2差異代謝產(chǎn)物的KEGG富集分析 利用KEGG數(shù)據(jù)庫和MetPA數(shù)據(jù)庫對果實不同時期差異代謝物參與的代謝通路進行富集。GR vs BR、BR vs RR、GR vs RR的差異代謝物均富集到50多條代謝通路，并且共同富集到的與品質(zhì)形成相關(guān)的代謝通路主要有類黃酮生物合成和檸檬酸鹽循環(huán)途徑（圖4）。GR vs BR和GR vs RR所富集的與品質(zhì)形成相關(guān)的代謝通路還包含有谷氨酸、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝，以及淀粉和蔗糖代謝等途徑。另外，BR vs RR還富集到磷酸戊糖途徑等。

3討論與結(jié)論

如何提高番茄果實品質(zhì)以及探究提高番茄果實品質(zhì)的分子機理已成為熱門研究課題。番茄果實中可溶性糖及有機酸的種類、含量、比例以及次生代謝物（多酚、揮發(fā)性有機化合物和生物堿）的種類和含量在果實成熟過程中均會發(fā)生較大的變化，這也對番茄果實口感及風味品質(zhì)的形成起著決定性作用。本研究采用轉(zhuǎn)錄組學與代謝組學相結(jié)合的方法，通過研究不同時期番茄果實中糖類、有機酸、氨基酸、維生素、色素等物質(zhì)及相關(guān)代謝通路的變化，初步探索番茄成熟后果實品質(zhì)形成的原因。

前人研究表明，番茄果實可溶性糖含量隨果實發(fā)育和成熟會發(fā)生明顯變化，且含糖量在一定程度上會影響果實的硬度和揮發(fā)性香氣物質(zhì)，是影響果實品質(zhì)的重要因素。果糖和葡萄糖是成熟番茄果實中的主要可溶性糖，蔗糖合成酶、酸性轉(zhuǎn)化酶和蔗糖磷酸合成酶是參與蔗糖代謝的重要酶，在果實中糖的積累中起重要作用。本研究中，番茄果實中的氨基葡萄糖含量從綠熟期到轉(zhuǎn)色期再到紅熟期呈現(xiàn)不斷升高的趨勢，在紅熟期達到最高：影響糖降解的磷酸葡萄糖變位酶基因、糖原磷酸化酶基因下調(diào)，控制合成糖原和海藻糖的1，4-a-葡聚糖分支酶基因（SBE）、介導蔗糖從韌皮部向果實輸送的SUT1基因（蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因）以及控制蔗糖卸載的基因SuSyJ（蔗糖合酶基因）在果實成熟過程中也呈現(xiàn)上升的趨勢：AGPL1在果實由轉(zhuǎn)色期向紅熟期轉(zhuǎn)變過程中也顯著上調(diào)，該基因調(diào)控果實成熟過程中的淀粉含量，促進可溶性固形物含量的增加。說明番茄果實由綠熟向紅熟轉(zhuǎn)變的過程中，己糖的合成、積累以及輸送和卸載相關(guān)通路的關(guān)鍵基因表達量的變化，最終導致果實內(nèi)糖分含量的增加，為番茄果實口感品質(zhì)的形成奠定了物質(zhì)基礎。

果實內(nèi)有機酸的種類和含量對番茄果實口感也非常重要，在果實發(fā)育過程中，有機酸的總含量呈現(xiàn)降低趨勢?？箟难崾欠压麑嵠焚|(zhì)中重要的指標。目前已報道的抗壞血酸生物合成途徑有4種：L-半乳糖途徑、古洛糖途徑、D-半乳糖醛酸途徑以及肌醇途徑。古洛糖途徑是在酶的作用下，將GDP-D-甘露糖經(jīng)一系列反應催化生成古洛糖酸，最后生成抗壞血酸：岳東的研究證明了這條途徑的準確性。本研究中，作為中間產(chǎn)物的古洛糖酸在整個發(fā)育時期含量持續(xù)增加，為番茄果實中抗壞血酸的合成提供了充足的底物：參與抗壞血酸合成途徑的GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因（GGP）、單脫氫抗壞血酸還原酶基因（MDHAR）也一直呈現(xiàn)上調(diào)趨勢。前人研究顯示，番茄果實中抗壞血酸含量在綠熟期至轉(zhuǎn)色期顯著增多，轉(zhuǎn)色期后上升速度逐漸下降：蘋果酸含量在番茄果實的整個發(fā)育階段都呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。本試驗結(jié)果顯示‘Micro-Tom番茄果實成熟過程中蘋果酸含量一直呈現(xiàn)下降趨勢，與前人研究結(jié)果基本一致。由上述結(jié)果我們推測，‘Micro-Tom番茄果實發(fā)育的整個過程中糖類物質(zhì)含量上升，酸類物質(zhì)總量下降，果實糖酸比值增加，番茄口感逐漸提升，是番茄果實品質(zhì)形成的重要原因。

揮發(fā)性芳香物質(zhì)的組分及含量是番茄果實的重要特征品質(zhì)指標，主要由萜烯、醛、醇、酯、酮等復雜混合物組成。根據(jù)不同的前體，揮發(fā)性有機物可以分為四大類：脂肪酸揮發(fā)物、氨基酸衍生的揮發(fā)物、萜類揮發(fā)物以及類胡蘿卜素衍生的揮發(fā)物。本試驗代謝組學分析結(jié)果顯示，番茄果實由轉(zhuǎn)色期到紅熟期轉(zhuǎn)變的過程中，大部分氨基酸的含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，氨基酸為芳香化合物合成的主要前體物質(zhì)，果實綠熟期到轉(zhuǎn)色期過程中多數(shù)氨基酸含量下降，可能是因為綠熟期積累的氨基酸到了轉(zhuǎn)色期后主要進入下游途徑合成芳香化合物。RNA-seq數(shù)據(jù)顯示，與脂肪酸揮發(fā)物生物合成相關(guān)的基因LIP8、TomLoxG、Lecithin：cholesterol在果實成熟過程中表達量呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，這些基因均與短鏈脂肪酸衍生物的合成密切相關(guān)：與氨基酸衍生的揮發(fā)物生物合成相關(guān)的基因FLORAIA、AA DC1也呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)。該結(jié)果也進一步證實了‘Micro-Tom番茄果實成熟過程中，氨基酸、脂肪酸的降解與代謝通路中關(guān)鍵基因表達水平的變化有關(guān)，促使果實中的揮發(fā)性芳香物質(zhì)逐漸積累并散發(fā)，最終決定番茄果實成熟后香味品質(zhì)的形成。

顏色作為番茄果實外觀品質(zhì)的最重要性狀之一，在果實成熟過程中發(fā)生著顯著變化，隨著葉綠素的降解和類胡蘿卜素／類黃酮的生物合成，最終形成番茄果實獨特的顏色。本研究發(fā)現(xiàn)，‘Mi-cro- rom番茄果實成熟過程中胡薄荷酮、槲皮素-3-0-葡萄糖苷、柚皮素、橙皮素等與果實顏色形成相關(guān)的代謝產(chǎn)物呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，參與葉綠素降解的基因SCRJ、PPH以及參與類胡蘿h素合成的基因PSY1、PSY2、CRTISO、ZDS、PDS、BCH2、ZEP、NSY在果實成熟過程中均呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的趨勢，由此推測‘Micro -Tom番茄果實成熟過程中果實葉綠素的降解和番茄紅素的合成主要發(fā)生在綠熟期向轉(zhuǎn)色期轉(zhuǎn)變的過程中，且隨著果實的成熟，葉綠素降解和番茄紅素合成的速度逐漸減弱。

綜上所述，通過對不同成熟時期番茄果實的代謝組學及轉(zhuǎn)錄組學分析，發(fā)現(xiàn)番茄果實從綠熟期向紅熟期轉(zhuǎn)變過程中，果實內(nèi)可溶性糖、有機酸、氨基酸、黃酮類化合物、醇類、酚類等多種化合物含量和種類以及相關(guān)通路中關(guān)鍵基因表達水平發(fā)生明顯變化，多種因素相互作用，形成了‘Micro-Tom成熟番茄果實的品質(zhì)。本研究為番茄品質(zhì)調(diào)控和優(yōu)質(zhì)番茄生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。