牛淑琳 鞠培娜 周冠華 戴南平 周晉軍 謝先芝 鄭崇珂

摘要：水稻是重要的糧食作物之一，在鹽堿地開發(fā)和改良中發(fā)揮著重要作用。為了創(chuàng)制高耐鹽水稻種質(zhì)資源，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，在水稻品種鹽豐47中對(duì)OsRR22設(shè)計(jì)3個(gè)靶位點(diǎn)進(jìn)行基因編輯。通過PCR和測序鑒定，在To代獲得16個(gè)突變單株，其中靶位點(diǎn)1和靶位點(diǎn)2均有純合突變，靶位點(diǎn)3沒有檢測到突變。在T1代轉(zhuǎn)基因株系中，獲得3株純合突變且無T-DNA插入的純合突變體。對(duì)T2代進(jìn)行農(nóng)藝性狀分析發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，突變體的株高顯著降低，產(chǎn)量相關(guān)農(nóng)藝性狀均無顯著變化。苗期耐鹽性鑒定結(jié)果表明，在200 mmol/L NaCI處理7天后，突變株的存活率比野生型提高30%以上。綜上，利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)水稻品種鹽豐47進(jìn)行了耐鹽性改良，為耐鹽水稻新品種的培育提供了理論和材料基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：水稻；耐鹽性；OsRR22；基因編輯

中圖分類號(hào)：S511：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2023）02-0030-06

鹽漬化一度被稱為土地的“絕癥”，目前中國的鹽堿地面積約為1億公頃，其中可改良利用的鹽堿地約667萬公頃，這是一筆“沉睡”的寶貴資源。水稻是世界上重要的糧食作物之一，也是中國種植面積最大的糧食作物，對(duì)于保障糧食安全至關(guān)重要。水稻是一種對(duì)鹽濃度中度敏感的作物，由于其特殊的栽培方式，已成為鹽堿地改良利用的先鋒作物。為了更好地發(fā)揮水稻在鹽堿地改良中的作用，提高水稻耐鹽性，培育優(yōu)質(zhì)耐鹽水稻品種已經(jīng)成為提高鹽堿地利用率和保障國家糧食安全的重要手段。

植物反應(yīng)調(diào)控因子RR（response regulator）是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞分裂素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控植物的生長發(fā)育和脅迫耐性。水稻中包括13個(gè)A型RR基因（OsRRl-OsRR13）和6個(gè)B型RR基因（OsRR21-OsRR26）。Os-RR22/ORR2編碼一個(gè)含有696個(gè)氨基酸的B型反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白，對(duì)于水稻的正常生長發(fā)育起著重要作用，該基因突變后水稻的耐鹽性明顯提高。WoIrhen等發(fā)現(xiàn)與野生型相比rr2//22/23突變體葉片更短，更窄：穗長變短，分支數(shù)變少：根長變短，側(cè)根形成量減少：而且在rr2//22/23突變體中，花藥心皮的柱頭刷發(fā)育受到損害從而妨礙花粉捕獲，這可能是導(dǎo)致籽粒填充不良的原因。Zhang等利用Cas9-OsRR22-gRNA表達(dá)載體敲除OsRR22，發(fā)現(xiàn)T2純合突變株的耐鹽性較野生型（wild type，WT）植株明顯增強(qiáng)。玉米中ABPH基因編碼A型應(yīng)答調(diào)控因子ZmRR3，ABPHI通過負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)的莖分生組織的擴(kuò)張限制莖尖原基的起始空間，從而控制葉的分生模式。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是近年發(fā)展起來的一種準(zhǔn)確、方便、高效的基因組編輯方法?；贑RISPR/Cas9的基因組編輯技術(shù)作為連接功能基因和遺傳改良的橋梁，越來越受到育種家的關(guān)注。Li等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯Xa13啟動(dòng)子，獲得了抗白葉枯病水稻。Zeng等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)同時(shí)編輯2個(gè)與產(chǎn)量相關(guān)的負(fù)調(diào)控基因（OsPIN5b和CS3）和1個(gè)耐冷基因（OsMyB30），獲得了高產(chǎn)耐冷水稻新品種。Alfatih等利用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得的水稻PARAQUAT TOLERANCE3（Os PQT3）基因敲除突變體具有更高的產(chǎn)量及抗氧化和鹽脅迫能力。

本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)，以黃河三角洲鹽堿地主栽品種鹽豐47為遺傳轉(zhuǎn)化受體材料，對(duì)耐鹽基因Os RR22進(jìn)行編輯，獲得有育種價(jià)值的純合突變體，為培育適宜在黃河三角洲鹽堿地種植的水稻品種提供耐鹽材料。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料與載體

以黃河三角洲鹽堿地主栽品種鹽豐47為遺傳轉(zhuǎn)化受體材料。所有材料種植于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院飲馬泉試驗(yàn)基地，常規(guī)水肥管理。植物CRISPR/Cas9基因編輯載體（pYLCRISPR/Cas9Pubi-H）由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光課題組饋贈(zèng)。

1.2靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)與載體構(gòu)建

在水稻基因組注釋計(jì)劃數(shù)據(jù)網(wǎng)站RAP（ht-tps：//rapdb.dna.affrc.go.jp/index.html）下載Os-RR22（Os06901831CO）基因組序列，利用CRISPR-GE（http：//skLscau.edu.cn/）設(shè)計(jì)OsRR22敲除靶點(diǎn)，選擇特異性好的候選靶位點(diǎn)作為目的靶位點(diǎn)，共選擇3個(gè)靶位點(diǎn)。載體構(gòu)建參考單子葉敲除載體構(gòu)建方法進(jìn)行，針對(duì)3個(gè)靶位點(diǎn)，設(shè)計(jì)gRTl、gRT2、gRT3引物對(duì)，用于構(gòu)建gRNA中間載體。Hpt和Cas9引物對(duì)分別用于轉(zhuǎn)基因植株篩選過程中對(duì)抗潮霉素基因Hpt和Cas9基因的篩選，OsRR22引物對(duì)用于對(duì)靶位點(diǎn)的重測序分析。引物（表1）合成與轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)測序由北京擎科生物科技有限公司（青島）完成。構(gòu)建好的轉(zhuǎn)化載體送至武漢伯遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。

1.3To代轉(zhuǎn)基因株系獲得及突變位點(diǎn)檢測

利用CTAB法提取獲得的轉(zhuǎn)基因To代植株的基因組DNA，利用潮霉素基因Hpt進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的陽性檢測。利用OsRR22F2和OsRR22R2引物進(jìn)行靶位點(diǎn)擴(kuò)增，擴(kuò)增片段送北京擎科生物科技有限公司（青島）進(jìn)行測序。利用DNAMAN軟件進(jìn)行測序結(jié)果分析。

1.4T1代無T-DNA株系篩選

將T0代自交獲得的T1代種子單株種植，分別提取DNA后用Hpt和Cas9基因檢測引物（表1）進(jìn)行檢測，兩對(duì)引物都不能擴(kuò)增出目的條帶，則認(rèn)為該株系為無T-DNA插入株系，可用于下一步的分析。

1.5T2代純合突變體農(nóng)藝性狀調(diào)查

T1代無T-DNA插入的單株自交后獲得T2代無T-DNA插入株系。每個(gè)株系種植3行，每行10株，行距×株距為25 cmx14 cm。在水稻抽穗期進(jìn)行轉(zhuǎn)基因后代的抽穗期調(diào)查：待水稻完全成熟后，每個(gè)株系選擇15個(gè)單株進(jìn)行株高、有效分蘗數(shù)、主穗長、主穗實(shí)粒數(shù)、千粒重等農(nóng)藝性狀調(diào)查。

1.6OsRR22突變體耐鹽性鑒定

將純合的Os RR22突變體與野生型種植在96孔板上，以Yoshida營養(yǎng)液培養(yǎng)至三葉一心，參照張治振等的方法對(duì)突變體和對(duì)照進(jìn)行鹽處理，具體為：水稻幼苗長到三葉一心后，用含有200mmol/L NaCl的Yoshida營養(yǎng)液處理7天，然后用不含NaCl的Yoshida營養(yǎng)液恢復(fù)培養(yǎng)7天，統(tǒng)計(jì)突變體和野生型存活單株數(shù)（有一片綠葉存活即記為存活單株），統(tǒng)計(jì)存活率。

存活率（%）=存活單株數(shù)／處理單株數(shù)×100。

2結(jié)果與分析

2.10sRR22基因編輯靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)與載體構(gòu)建

為提高突變效率，在OsRR22基因內(nèi)部設(shè)計(jì)3個(gè)敲除靶位點(diǎn)，其中，在第一外顯子區(qū)設(shè)計(jì)兩個(gè)靶位點(diǎn)T1和T2，分別距離起始密碼子ATG 52 bp和117 bp，PAM序列均為CGG；T3靶位點(diǎn)位于第二外顯子區(qū)，距離ATG 522 bp，PAM序列為TGG（圖1A）。OsRR22-CRISPR敲除載體如圖1B。

2.2T0代轉(zhuǎn)基因株系的檢測及突變情況分析

將構(gòu)建好的載體利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，共獲得16株轉(zhuǎn)基因苗。用潮霉素（Hpt）引物進(jìn)行檢測，所有植株均能檢測到特異條帶，說明均為轉(zhuǎn)基因陽性苗（圖2）。

利用特異性引物OsRR22F2和OsRR22R2對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的靶位點(diǎn)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增并測序分析。16個(gè)株系在靶位點(diǎn)Tl和12均發(fā)生突變，突變效率為100%，在T3靶位點(diǎn)未發(fā)生突變。其中，在靶位點(diǎn)T1檢測到純合突變株3株，占18.75%，雜合突變株5株，占31.25%，雙等位突變株8株，占50.00％；在靶位點(diǎn)T2檢測到純合突變株4株，占25.00％，雜合突變株3株，占18.75％雙等位突變株9株，占56.25%。

2.3T1代無T-DNA元件的突變植株篩選

將鹽豐47背景的To代靶位點(diǎn)T1為純合突變的單株自交后獲得T1代種子。隨機(jī)選取T1代種子100粒，萌發(fā)后種植在去除底部的96孔板中，以營養(yǎng)液培養(yǎng)至三葉一心期。按順序取樣后提取基因組DNA。用潮霉素鑒定引物進(jìn)行篩選，獲得無潮霉素?cái)U(kuò)增的單株。然后對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行測序驗(yàn)證，獲得純合突變且無T-DNA插入的單株，根據(jù)檢測到的單株排序，命名為rr22JI，rr22K1、rr22L/等（圖3）。自交留種后獲得T2代純合突變的轉(zhuǎn)基因株系，進(jìn)行農(nóng)藝性狀和耐鹽性分析。

2.4T2代純合突變體農(nóng)藝性狀分析

對(duì)各個(gè)轉(zhuǎn)基因株系和野生型植株的調(diào)查結(jié)果表明，野生型植株和突變體植株抽穗期沒有明顯差異，突變體植株比野生型植株株高顯著降低，有效分蘗數(shù)、穗長、穗粒數(shù)、千粒重均無明顯差異（圖4）。說明Os RR22基因的敲除能夠顯著降低水稻株高，但對(duì)產(chǎn)量性狀影響不顯著。

2.5T2代純合突變體耐鹽性分析

為了鑒定突變體的耐鹽性，選擇3個(gè)T2代純合突變體（rr22J1、rr22K1和rr22L/）和野生型鹽豐47，同時(shí)種植在96孔板上進(jìn)行耐鹽性試驗(yàn)，結(jié)果（圖5）表明，野生型鹽豐47鹽處理后存活率只有28.81％，而突變體rr22J1、rr22K、rr22L1的存活率分別為70.71％、76.81％和58.89％，均顯著高于野生型鹽豐47，說明利用CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)制的基于OsRR22基因的突變體耐鹽性顯著提高。

3討論與結(jié)論

CRISPR技術(shù)是近年來發(fā)展迅速的基因定點(diǎn)編輯技術(shù)，是繼鋅指核酸酶（zine finger nuclease，ZFN）技術(shù)和轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases．TALENs）之后的第三代基因標(biāo)記技術(shù)，具有成本低、效率高、構(gòu)建簡單、操作便捷、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。利用該技術(shù)能夠快速完成基因敲除、插入、替換、點(diǎn)突變、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和表觀修飾等操作，在細(xì)菌、植物和動(dòng)物中均有應(yīng)用，如Wu等利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功將1，4-BDO（1，4-butanediol）合成途徑插入E．coti中，實(shí)現(xiàn)了1，4-BDO在微生物中的代謝生產(chǎn)；Gao等采用CRISPP/Cas9技術(shù)將NRAMP1（natural resistance-associated macrophage protein-1）基因敲入奶牛中，獲得了11頭抗結(jié)核轉(zhuǎn)基因牛；Tang等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除金屬轉(zhuǎn)運(yùn)體基因OsNramp5，培育出Cd積累量低且無轉(zhuǎn)基因的新稻株。在水稻中已有多個(gè)基因編輯提高水稻耐逆性、抗病性的報(bào)道。本研究結(jié)果也表明，該技術(shù)能夠有效地應(yīng)用于水稻耐鹽種質(zhì)創(chuàng)新中。

本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)粳稻品種鹽豐47進(jìn)行耐鹽基因OsRR22的定點(diǎn)編輯，以期獲得具有育種利用價(jià)值的純合突變材料。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在獲得的16個(gè)To代轉(zhuǎn)基因株系中單個(gè)靶位點(diǎn)純合突變率最高為25％，以堿基插人為主（頻率為80％）：沒有發(fā)現(xiàn)兩個(gè)靶位點(diǎn)同時(shí)變異的純合株系：靶位點(diǎn)3沒有出現(xiàn)變異，可能是靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)不合理或該靶位點(diǎn)在鹽豐47基因組中與參考基因組存在序列差異，導(dǎo)致打靶失敗。選擇靶位點(diǎn)1純合突變的株系自交繁殖后獲得T1代群體，靶位點(diǎn)測序顯示是與To代靶位點(diǎn)突變一致的株系，說明CRISPR技術(shù)編輯產(chǎn)生的突變能夠穩(wěn)定遺傳給下一代。通過潮霉素標(biāo)記篩選，將無T-DNA插入且靶位點(diǎn)純合突變的3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行農(nóng)藝性狀分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了株高有降低外，抽穗期和產(chǎn)量相關(guān)性狀均沒有明顯差異。通過苗期鹽處理后存活率統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因后代的耐鹽性顯著提高（增幅超過30個(gè)百分點(diǎn)）。因此對(duì)OsRR22基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯，能在不影響水稻產(chǎn)量的同時(shí)顯著提高水稻的耐鹽性：同時(shí)CRISPR/Cas9技術(shù)為水稻抗逆種質(zhì)的創(chuàng)新提供了有利工具。