于宏璐,蘇東帥,馬韶澤,祁興順

于宏璐,蘇東帥,馬韶澤,祁興順,北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院消化內(nèi)科 遼寧省沈陽市 110840

于宏璐,大連醫(yī)科大學研究生院 遼寧省大連市 116044

蘇東帥,中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九六三醫(yī)院 黑龍江省佳木斯市 154000

0 引言

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是一種革蘭氏陰性桿菌,可經(jīng)口-口、糞-口等途徑在人與人之間傳播,其在全球感染率約為50%,在我國可達44.2%[1,2].H.pylori感染與胃炎、消化性潰瘍、胃癌、胃粘膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤等疾病密切相關(guān),因此,根除H.pylori對上述疾病防治具有重要意義[3].目前我國指南對于H.pylori的治療推薦鉍劑四聯(lián)療法,即1種質(zhì)子泵抑制劑+2種抗生素+1種鉍劑[4].然而,隨著抗生素的大量使用,克拉霉素(Clarithromycin,CLA)、甲硝唑(Metronidazole,MTZ)和左氧氟沙星(Levofloxacin,LVX)耐藥率均超過30%,MTZ甚至高達78%,使得經(jīng)驗性含鉍劑四聯(lián)方案的根除成功率很難達到90%[5,6].抗生素耐藥是導致H.pylori根除失敗的主要原因,常表現(xiàn)為三種模式,包括單藥耐藥、多重耐藥和異質(zhì)性耐藥[7].單藥耐藥指H.pylori僅對一種抗生素耐藥;多重耐藥指H.pylori同時對兩種或兩種以上抗生素耐藥;異質(zhì)性耐藥指同一亞群內(nèi)或不同亞群H.pylori對抗生素的敏感性不同.了解H.pylori對抗生素耐藥情況可幫助醫(yī)生合理化應用抗生素,進而提高H.pylori根除率.傳統(tǒng)檢測是H.pylori抗生素耐藥的常用檢測方法,即先細菌培養(yǎng)再行藥敏試驗.隨著分子生物學技術(shù)發(fā)展,各種新興技術(shù)不斷應用于H.pylori的耐藥檢測,方法選擇逐漸多樣化,包括聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)及其相關(guān)技術(shù)、DNA測序、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)、基因芯片等.本文旨在通過回顧相關(guān)文獻,介紹上述檢測方法優(yōu)缺點及應用現(xiàn)狀,為醫(yī)生在臨床實踐中選擇H.pylori抗生素耐藥檢測方法提供參考.

1 基于細菌培養(yǎng)的傳統(tǒng)檢測方法

H.pylori耐藥的傳統(tǒng)檢測方法是基于細菌培養(yǎng)進行的.藥敏試驗包括瓊脂稀釋法、濃度梯度(E-test)法、紙片擴散法和微量肉湯稀釋法.一項隨機對照研究將90例胃活檢H.pylori培養(yǎng)陽性的患者分為試驗組和對照組,試驗組根據(jù)E-test結(jié)果接受四聯(lián)治療,對照組采取經(jīng)驗四聯(lián)治療,發(fā)現(xiàn)試驗組根除率顯著高于對照組(意向性分析:91%vs73%,P=0.027;符合方案分析:95%vs79%,P=0.021)[8].一項前瞻性研究共納入200例單次或多次H.pylori根除失敗的患者,根據(jù)藥敏結(jié)果給予三聯(lián)或鉍劑四聯(lián)治療,研究發(fā)現(xiàn)H.pylori總體根除率可達94.5%[95%置信區(qū)間(confidence interval,CI): 90.4%-97.5%][9].由此可見,藥敏試驗指導的個體化治療可提高H.pylori根除率.目前,基于細菌培養(yǎng)的藥敏試驗是檢測H.pylori對所有常用抗生素耐藥性的唯一方法,對診斷H.pylori耐藥具有重要作用,但仍存在以下缺點: (1)H.pylori細菌培養(yǎng)需基于內(nèi)窺鏡檢查并取材,為侵入性檢查方法,且培養(yǎng)所需時間長,可達1 wk-2 wk;(2)細菌培養(yǎng)的陽性率易受保存、運輸方式及菌株接種濃度等因素影響[10];(3)藥敏試驗尚無標準的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)值,結(jié)果可因不同標準的MIC值產(chǎn)生差異;(4)瓊脂稀釋法耗材、耗時,E-test法耗材昂貴,紙片擴散法尚缺乏統(tǒng)一判斷標準,微量肉湯稀釋法技術(shù)難度大[11].綜上,傳統(tǒng)的基于細菌培養(yǎng)的耐藥檢測方法雖可指導個體化治療,但其不足之處限制了其在臨床的應用.

2 分子生物學檢測方法

2.1 PCR及其相關(guān)技術(shù)

2.1.1 PCR-限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP): PCR-RFLP是最早應用的一種常規(guī)PCR技術(shù),原理為先利用特定引物擴增H.pylori可能的基因突變片段,再使用限制性內(nèi)切酶對產(chǎn)物進行酶切,最后對酶切產(chǎn)物行電泳分析其長度,進而判斷有無突變.PCR-RFLP通過基于胃活檢的細菌培養(yǎng)及直接取材獲取H.pylori基因片段.Khashei等[12]在100株H.pylori臨床分離株中,共發(fā)現(xiàn)20株H.pylori發(fā)生23S rRNA突變,其中18(90%)株A2142G位點突變和2(10%)株A2143G位點突變,與E-test所得CLA耐藥結(jié)果一致;Hussein等[13]在38株耐CLA的H.pylori中檢測23S rRNA基因突變,發(fā)現(xiàn)10(26.3%)株A2143G位點突變、14(36.8%)株A2144G位點突變、9(23.7%)株A2143G和A2144G雙位點突變,其余5(13.2%)株無位點突變;Pourakbari等[14]在福爾馬林固定石蠟包埋胃活檢標本中分析H.pylori的23S rRNA基因突變情況,發(fā)現(xiàn)耐CLA菌株中A2143G位點突變率最高(50%),其次為A2142G位點突變(29%)和A2142C位點突變(21%).與傳統(tǒng)檢測方法相比,該技術(shù)可直接檢測耐藥基因突變位點,具有操作方便、靈敏度高及耗時短的優(yōu)勢.但該法結(jié)果依賴于已知的耐藥機制,若H.pylori發(fā)生耐藥進化,則無法檢測;該方法的準確性易受操作人員技術(shù)水平、取材方式、酶切產(chǎn)物等因素干擾.

2.1.2 雙啟動寡聚核苷酸(dual priming oligonucleotide,DPO)-PCR: DPO-PCR屬于多重PCR,無需限制性核酸內(nèi)切酶,可同時檢測H.pylori感染及其抗生素耐藥性.目前,商業(yè)化試劑盒Seeplex?ClaR-H.pyloriACE已成功用于評估H.pylori對CLA耐藥性.該試劑共包含3對特異性引物,分別用于擴增23S rRNA、檢測A2142G和A2143G位點突變.Ong等[15]同時應用瓊脂稀釋法和DPO-PCR檢測胃活檢標本H.pylori的CLA耐藥性,發(fā)現(xiàn)以藥敏結(jié)果為對照時,該技術(shù)的靈敏度是76.4%、特異性是90.1%;Kwon等[16]也使用瓊脂稀釋法和DPOPCR共同檢測胃活檢標本中H.pylori的CLA耐藥性,發(fā)現(xiàn)該技術(shù)的靈敏度和特異性分別是77.8%和95.5%.此外,Choi等[17]應用該技術(shù)在101例H.pylori感染患者中檢測CLA耐藥性,發(fā)現(xiàn)29例患者耐藥,其中25例A2143G位點突變、4例A2142G位點突變.總之,與常規(guī)PCR相比,該技術(shù)省去酶切步驟而更加簡便;與傳統(tǒng)檢測方法相比,該技術(shù)特異性強,無需細菌培養(yǎng)而更加快速.

2.1.3 實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR): qPCR已實現(xiàn)了定性到定量的飛躍,主要是在PCR體系中加入熒光標記物,利用隨PCR產(chǎn)物增加而熒光信號強度等比例增加的現(xiàn)象,進而實時檢測熒光信號強度并在指數(shù)期依據(jù)標準曲線進行分析,從而實現(xiàn)對起始模板的定量[18].目前,多種試劑盒已成功用于23S rRNA耐藥基因的檢測,適用于胃黏膜、胃液、糞便等多種標本,其靈敏度高、特異性強.van den Poel等[19]以瓊脂稀釋法為金標準,發(fā)現(xiàn)RIDA?GENE HP assay試劑盒檢測胃活檢標本中H.pylori對CLA耐藥的靈敏度為92%、特異性為97%.Pichon等[20]以E-test法為金標準,發(fā)現(xiàn)AmplidiagH.pyloriClariR試劑盒檢測糞便標本中H.pylori對CLA耐藥性的靈敏度和特異性分別為100%(95%CI: 88%-100%)和98.4%(95%CI:94%-99%).Redondo等[21]使用LightMix?RT-PCR試劑盒在糞便和胃活檢標本上檢測H.pylori的CLA耐藥性,發(fā)現(xiàn)該法結(jié)果與E-test法的符合率可達95%.因此,在糞便標本中應用qPCR可避免侵入性取材,且成本低,但需注意因糞便標本中血紅蛋白、多糖復合物及重金屬等物質(zhì)抑制PCR造成的假陰性結(jié)果[22].Binmaeil等[23]開發(fā)了一種多重qPCR技術(shù),包含擴增ureA、23S rRNA、GyrA基因的特異性引物和探針,可同時檢測H.pylori感染及CLA、LVX耐藥性;在571例胃活檢標本中,該技術(shù)檢測H.pylori感染的靈敏度為96.4%、特異性為88.5%,檢測CLA耐藥的靈敏度為100%、特異性為98.7%,檢測LVX耐藥的靈敏度為100%、特異性為99.8%;因此,多重qPCR技術(shù)尤其適用于低載量和多重耐藥情況下H.pylori的檢測.綜上,與傳統(tǒng)檢測方法相比,qPCR技術(shù)是一種簡便、快速、靈敏度高、特異性強、適用于多種標本的檢測方法;多重qPCR技術(shù)適用范圍更廣泛.

2.1.4 擴增阻滯突變系統(tǒng)(amplification refractory mutation system,ARMS)-實時熒光PCR: ARMS-實時熒光PCR通過設計ARMS引物的3’末端堿基落在突變基因位置,在擴增時,鏈延伸只在特定等位基因模板鏈上進行,從而實現(xiàn)對突變基因的特異性檢測[24].Zhang等[25]納入了150例H.pylori根除失敗的患者,分別用DNA測序、ARMS-實時熒光PCR和E-test法檢測胃粘膜標本中H.pylori的CLA耐藥性,發(fā)現(xiàn)DNA測序結(jié)果與該技術(shù)的符合率為98.7%;E-test結(jié)果與該技術(shù)的符合率為97.1%.此后,開發(fā)了多重ARMS-實時熒光PCR方法,其靈敏度和特異性高、價格成本低、從樣本接受到分析完成僅需2 h.Li等[26]應用多重ARMS-實時熒光PCR在192例H.pylori感染患者胃活檢標本中檢測H.pylori的CLA、LVX耐藥性,共發(fā)現(xiàn)耐藥患者74例,其中23例(31.1%)耐CLA、21例(28.4%)耐LVX、30例雙重耐藥(40.5%);以Sanger測序為金標準時,該技術(shù)診斷CLA耐藥的靈敏度、特異性均為100%;診斷LVX耐藥的靈敏度、特異性分別為98.04%和95.04%;診斷多重耐藥的靈敏度和特異性分別為100%和96.91%.Zhang等[27]也評估了該技術(shù)檢測H.pylori耐CLA、LVX的準確性;以Sanger測序為金標準時,該技術(shù)診斷CLA耐藥、LVX耐藥和多重耐藥的靈敏度分別為96%、95%和95%,特異性分別為93%、92%和95%.綜上,與傳統(tǒng)藥敏檢測相比,ARMS-實時熒光PCR技術(shù)大大縮短了檢測時間;與Sanger測序相比,其成本更低;但ARMS引物設計依賴于明確的耐藥機制.

2.1.5 數(shù)字PCR(digital PCR,dPCR): dPCR是一種絕對核酸定量分析法,通過在擴增過程終點觀測熒光信號并利用泊松分布計算基因擴增陽性分區(qū)的比例,從而實現(xiàn)對目標核酸的定量[28].與qPCR相比,dPCR無需使用標準曲線進行分析,進而節(jié)省時間[18].微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)目前已用于檢測H.pylori的23S rRNA基因.Talarico等[29]應用ddPCR技術(shù)檢測了102例患者福爾馬林固定石蠟包埋胃活檢組織標本中的23S rRNA基因,45例(44%)有CLA耐藥基因,其中12例有耐藥等位基因、33例同時存在野生和耐藥等位基因.Sun等[30]比較了在胃活檢標本中應用E-test法、ddPCR技術(shù)與在糞便標本中應用ddPCR技術(shù)檢測H.pylori感染者CLA耐藥性的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)三種檢測方法高度一致;并在49例H.pylori感染者中比較了在胃活檢與糞便標本中分別應用ddPCR技術(shù)檢測CLA耐藥的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)35例(71%)患者CLA耐藥基因型一致,兩種方法檢測結(jié)果不一致的原因可能是糞便標本中H.pylori載量低或假性混合基因型比例高.由此可見,ddPCR無需進行細菌培養(yǎng),可直接在胃活檢或糞便標本中檢測H.pylori的耐藥基因型,且檢測異質(zhì)性耐藥情況尤為方便,但在糞便中應用該技術(shù)應警惕假陰性結(jié)果.與傳統(tǒng)方法相比,ddPCR結(jié)果準確且更加迅速、簡便;與qPCR相比,其耗時短且結(jié)果準確,但仍需進一步研究證實其實用性.

2.2 DNA測序 DNA測序是檢測H.pylori耐藥基因的金標準,通過對H.pylori進行全基因組分析,可以檢測已知和未知耐藥基因突變,也可驗證其他分子檢測方法的性能.Sanger測序為一代測序技術(shù).Tian等[31]應用Sanger測序和瓊脂稀釋法檢測了160例H.pylori感染者胃活檢標本中的抗生素耐藥性,發(fā)現(xiàn)Sanger測序與瓊脂稀釋法檢測CLA、LVX與阿莫西林(amoxicillin,AMX)耐藥的一致性分別為84.8%、70.5%和72.7%.此后,開發(fā)了焦磷酸測序也已用于檢測H.pylori的23S rRNA基因突變.初等[32]建立了一種檢測CLA耐藥的焦磷酸測序方法,與Sanger測序相比,焦磷酸測序無需電泳、熒光標記,是一種快速、靈敏度高的檢測方法.近年來,新一代測序(next-generation sequencing,NGS)技術(shù)是繼Sanger測序后的一次革命性技術(shù)進展,已成為DNA測序的主要方法.與Sanger測序相比,NGS是一種強大的高通量方法,時間-成本效益比和測序產(chǎn)量極大增加;與傳統(tǒng)H.pylori耐藥性檢測方法相比,NGS結(jié)果更可靠[33,34].Subsomwong等[35]應用NGS技術(shù)發(fā)現(xiàn)H.pylori抗生素耐藥基因發(fā)生了新突變,如23S rRNA的T248C位點突變和GyrA的D210N、K230Q等位點突變;Azzaya等[36]發(fā)現(xiàn)了23S rRNA的新突變位點A1410G、C1707T、A2167G、C2248T、C2922T.總之,DNA測序檢測H.pylori耐藥基因快速、準確,但其制備過程嚴苛、檢測周期長及測序儀器昂貴,限制了臨床應用,故尚未在臨床上推廣.

2.3 FISH FISH的原理是先用半抗原或熒光素分子修飾的核苷酸分子標記DNA(或RNA)探針,再將探針與目標序列雜交,通過含熒光素分子的抗體與探針特異性結(jié)合,最后利用熒光顯微鏡直接觀察目標序列在細胞核、染色體或切片組織中的分布情況[37].Demiray-Gürbüz等[38]分別應用E-test法和FISH法在114例H.pylori培養(yǎng)陽性者中檢測CLA耐藥情況,研究發(fā)現(xiàn),E-test法檢測出耐藥患者23例(20.2%),FISH法檢測出耐藥患者32例(28.0%),兩種檢測方法一致性為89.5%.Vazirzadeh等[39]應用E-test法和FISH法檢測了83例H.pylori培養(yǎng)陽性患者的CLA耐藥性,研究發(fā)現(xiàn),兩種方法檢測結(jié)果一致性為95%.此外,FISH技術(shù)在檢測H.pylori異質(zhì)性耐藥時更加便捷,單個活檢標本上即可同時顯示敏感與耐藥菌群,直接獲得結(jié)果[40].由此可見,與傳統(tǒng)耐藥性檢測方法相比,FISH技術(shù)更加便捷、可靠及適用范圍更廣.此外,與PCR技術(shù)相比,FISH無需DNA制備,3 h即可獲得結(jié)果,可在熒光顯微鏡下直觀顯示CLA耐藥菌株,不易受DNA污染影響.總之,FISH檢測技術(shù)是一種快速、方便、準確的耐藥性檢測方法,但其所需儀器價格高、獲取標本方式單一、無法檢測除CLA外的抗生素耐藥性,故尚未廣泛用于臨床檢測.

2.4 基因芯片 基因芯片的原理是將含有大量不同DNA或寡核苷酸片段的探針按規(guī)律排列在載體上,同時用熒光素標記待測樣本核酸,然后將樣本與芯片探針雜交,通過計算機掃描分析芯片熒光信號強度,進而獲取樣本核酸基因序列和表達水平信息.Yin等[41]在267例兒童患者的胃活檢標本中應用了基因芯片技術(shù),發(fā)現(xiàn)與藥敏試驗相比,該技術(shù)診斷H.pylori的靈敏度、特異性和準確性分別是96.1%、85.0%和93.6%;檢測H.pylori耐藥性的結(jié)果表明,耐CLA的主要位點是2143A/G、耐LVX的主要位點是GyrA 91和GyrA 87;并對藥敏試驗和基因芯片結(jié)果不一致的25個樣本行DNA測序,發(fā)現(xiàn)該技術(shù)檢測CLA、LVX耐藥性與DNA測序一致率均高達95%.Song等[42]建立了一種可同時檢測CLA、LVX耐藥性和CYP2C19多態(tài)性的可視化基因芯片,以DNA測序為金標準時,發(fā)現(xiàn)該技術(shù)檢測CLA耐藥性的靈敏度、特異性及與DNA測序一致性分別為92.13%、93.75%和95.94%;當該技術(shù)檢測LVX耐藥性時,GyrA 87位點靈敏度、特異性及與DNA測序一致性分別為91.11%、98.20%和96.82%,GyrA 91位點靈敏度、特異性及與DNA測序一致性分別為91.23%、98.90%和98.26%.總之,基因芯片是一種靈敏度高、特異性強、準確、快速的檢測方法,單張芯片即可一次性同時分析H.pylori對多種抗生素的多個耐藥基因突變位點,但其價格昂貴、無法檢測到數(shù)目小于100拷貝的待測基因;因此,目前并不適用于臨床檢測.可視化基因芯片為芯片技術(shù)的未來發(fā)展提供了新思路,準確性與DNA測序相當,成本大幅下降,這為臨床推廣奠定了基礎.

3 結(jié)論

H.pylori對抗生素的耐藥形勢嚴峻,通過耐藥性檢測實施個體化治療的重要性日益突顯.隨著分子生物學技術(shù)發(fā)展,檢測方法選擇眾多.傳統(tǒng)檢測方法費時費力,未在臨床常規(guī)開展.分子生物學方法快速、準確,在臨床研究中備受關(guān)注,但也并非完美.PCR的酶切、電泳步驟較繁瑣;測序技術(shù)的儀器造價昂貴;FISH只可檢測CLA耐藥性;基因芯片技術(shù)的基因模板數(shù)目需達最低要求.因此,臨床醫(yī)生在選擇檢測抗生素耐藥性方法時,應結(jié)合不同檢測方法的優(yōu)缺點、患者經(jīng)濟狀況和臨床實際等因素綜合考量,選擇適宜耐藥性檢測方法,以期減少H.pylori耐藥性并提高根除率.目前仍需開發(fā)快速、簡便、準確、價廉的H.pylori抗生素耐藥性檢測方法.