范航，路衛(wèi)星，邵國賓

（遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧營口 115009）

禽流感病毒的亞型較多，這是其最為明顯的生物學(xué)特征，因為病毒類型變異頻繁，導(dǎo)致種類較多，目前已知的禽流感病毒就有多個NA 亞型和HA 亞型，而且從全世界的家禽、野生禽中，也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種不屬于亞型的禽流感病毒，此疾病在臨床上主要表現(xiàn)為感染、呼吸道疾病、蛋產(chǎn)量急劇下降等，并且在家禽、野生禽的群體中表現(xiàn)出了極高的致死性[1]。雖然H5N2 亞型禽流感病毒，是一種高致病性禽流感病毒，這種病毒對禽類的危害，比美國先前在其他4 個州發(fā)現(xiàn)的禽流感病毒更加嚴重，隨著禽流感病毒抗原的重組和突變，再加上動物與人類之間不可避免的接觸，這樣一來禽流感的暴發(fā)，不僅對養(yǎng)殖業(yè)帶來經(jīng)濟損傷，更威脅到了人類的生命安全[2]。因此，調(diào)查H5N2 亞型禽流感病毒的分離鑒定與雞致病性，能進一步推測此病毒在雞群中傳播危害，以此為有效防制H5N2 亞型禽流感病毒奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒株與動物選取

1.1.1 病毒株

4 株 分 離 株：DK/GX/240D16/18（H5N2）、DK/GX/228D15/18 （H5N2）、DK/GX/221D22/18（H5N2）、GS/GX/240G32/18（H5N2），由實驗室分離并進行保存。

1.1.2 動物選取

本研究中SPF 雞胚購物北京某公司，按照規(guī)定要求飼養(yǎng)在隔離器中，直到研究觀察結(jié)束[3]。

1.2 主要試劑

病毒DNA/RNA 試劑盒；pMD-18T 載體；RNA 酶抑制劑；M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶；SL-PAA 受體；TMB 底物顯色液；過氧化物酶；PNA 凝膠；dNTP；M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶[4]。

1.3 病毒的增殖及雞胚半數(shù)感染量（EID50）測定

1.3.1 病毒增值

樣品采集和處理：在活禽市場中采集不同幾種家禽的咽拭子和肛拭子，采用內(nèi)含抗生素的PBS 溶液，抗生素種類分別為青霉素、慶大霉素、硫酸鏈霉素等，將咽拭子和肛拭子充分浸泡其中，并進行反復(fù)的浸泡和擠壓，給予離心速率5000 轉(zhuǎn)/分鐘，離心時間為5 分鐘，得到上層清液，保存?zhèn)溆?。雞胚接種：將收集到的上層清液，接種于SPF 雞胚中，并另外選取未接種的雞胚作為對照，在接種后將SPF 雞胚放置于專業(yè)保溫箱中進行孵化，并在24 小時內(nèi)收集未死雞胚和已死雞胚的尿囊液，觀察并記錄好雞胚的生長情況。血凝試驗：對收集到的尿囊液進行血凝試驗，將血凝效價高于4 log2 的尿囊液鑒定為陽性樣品，并進行保存；而將低于此標準的尿囊液，繼續(xù)接種然后再保存；接種三次后仍然無血凝效價，則視為陰性樣本。

1.3.2 雞胚半數(shù)感染量（EID50）測定

對4 株H5N2 亞型禽流感病毒分離出來的尿囊液，使用含抗生素的PBS 溶液進行稀釋，并且每株分離株需要按照血凝效價進行接種胚胎，選取5 個稀釋度中，每個各接種5 枚，放置于保溫箱中孵化，每日定時觀察并記錄雞胚的死亡情況，并收集每個死亡雞胚的尿囊液進行血凝效價試驗，記錄每個稀釋度的感染情況，最后按照公式（lgEID50=稀釋系數(shù)對數(shù)×距離比例+高于病毒稀釋對數(shù)）來測定雞胚半數(shù)感染量[5]。

1.4 全基因組分析

根據(jù)病毒DNA/RNA 抽提與反轉(zhuǎn)錄法，抽取出了4 株分離株的RNA 模板，并將其進行反轉(zhuǎn)錄、PCR 擴增。擴增程序：NA、HA、PB 等基因選取PCR 擴增，擴增程序為高溫預(yù)變性、變性、退火、延伸、第二輪擴增循環(huán)、結(jié)束反應(yīng)。擴增程序：NS 基因采用常規(guī)擴增，擴增程序為高溫預(yù)變性、變性、退火、循環(huán)、結(jié)束。

1.5 對SPF 雞致病性試驗

在H5N2 亞型禽流感病毒分離株感染后，采集感染組和未感染組的SPF 雞胚，感染后第三天，隨機選取5 只雞給予安樂死后解剖，無菌環(huán)境下取各個器官來檢測病毒的復(fù)制情況。

2 結(jié)果

2.1 序列進化分析

NA 基因：分析NA 亞型的基因進化序列可知，DK/GX/228D15/18（H5N2）和DK/GX/240D16/18 （H5N2）處在同一個基因序列，同源性高達97.5%。HA 基因：通過對比4 株病毒的HA 基因序列，發(fā)現(xiàn)在分離株之間氨基酸同源性和核苷酸同源性為97.0%、96.2%。PB 基因：通過對比4 株病毒的PB 基因序列，發(fā)現(xiàn)在分離株之間氨基酸同源性為85.2%，核苷酸同源性為86.5%。NS 基因：通過對比4 株病毒的NS 基因序列，發(fā)現(xiàn)分離株之間氨基酸同源性和核苷酸同源性分別為99.8%和99.9%。

2.2 病毒對SPF 雞的感染性試驗

5 只雞的心肌組織小灶區(qū)域淋巴細胞和嗜酸性粒細胞浸潤，心外膜區(qū)域見小灶狀淋巴細胞浸潤；氣管黏膜層灶狀淋巴細胞浸潤，氣管黏膜上皮細胞脫落；肝臟肝細胞間隙變大，肝血竇輕度擴張充血，肝小葉內(nèi)見多個點狀壞死、灶狀壞死，部分匯管區(qū)有淋巴細胞浸潤。

3 討論

近些年來，有較多研究發(fā)現(xiàn)，在禽流感病毒的傳播過程中多是以豬作為中間媒介，這樣就加大了禽流感與人流感充足的危險性，且再加上H5N2 亞型禽流感病毒的傳染能力較強，給養(yǎng)殖戶帶來了一定的養(yǎng)殖風(fēng)險，更影響到了社會人群的公共衛(wèi)生安全。

本研究中，從禽類市場收集了400 余份家禽的咽拭子和肛拭子，其中共分離出了4 份H5N2亞型禽流感病毒，而在這4 株分離株對應(yīng)的家禽上，3 只未表現(xiàn)為明顯的臨床癥狀，僅有1 只癥狀明顯，說明H5N2 亞型禽流感病毒雖然具有高傳染性，但隱性感染的表現(xiàn)力更強，需要養(yǎng)殖戶進行警惕[6]。同時，病毒會對SPF 雞的心肌組織、肝臟組織、氣管組織等均造成感染影響。因此，加強我國禽類中禽流感病毒的監(jiān)測，并了解H5N2亞型禽流感病毒的感染情況和流行情況，能夠為有效防控H5N2 亞型禽流感病毒提供依據(jù)。