左 東，張 宇，朱懷宇，張 童

1 清華大學(xué)醫(yī)院外科，北京 100084 2 北京航天總醫(yī)院血管外科，北京 100076 3 北京清華長庚醫(yī)院血管外科，北京 102218

下肢動脈硬化閉塞癥（lower extremity arteriosclerosis obliteran，LEASO）是一種慢性下肢缺血性疾病，與動脈粥樣硬化形成的斑塊導(dǎo)致動脈膜變厚、血管阻塞有關(guān)[1]。由于人們生活方式的改變、人口老齡化的加劇等原因，LEASO 的發(fā)病率逐漸升高[2]。LEASO 患者的早期癥狀并不明顯，但在出現(xiàn)間歇性跛行、肢體缺血性潰瘍、靜息痛等癥狀時，病情已經(jīng)十分嚴(yán)重，繼續(xù)拖延可能會導(dǎo)致截肢，嚴(yán)重影響患者的身心健康[3]。目前，LEASO 的主要治療方法是血管移植術(shù)或介入手術(shù)，其中，血管移植術(shù)的創(chuàng)口較大，不適合中老年齡患者；介入手術(shù)具有創(chuàng)口小、恢復(fù)快的特點(diǎn)，臨床應(yīng)用較多[4]，但患者在介入手術(shù)后容易發(fā)生血管再狹窄，因此，尋找有效的生物標(biāo)志物對于早期評估患者的預(yù)后并及時給予干預(yù)措施尤為重要。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類高度保守的非編碼小分子單鏈RNA，由miRNA 本身及其靶基因形成復(fù)雜而精密的調(diào)控網(wǎng)，可參與調(diào)節(jié)多種重要的生物學(xué)功能[5]。miRNA-206屬于miRNA 家族的一員，在骨骼肌細(xì)胞的發(fā)育、生長、繁殖、凋亡中發(fā)揮重要的作用[6]。miRNA-206作為心臟生理活動的調(diào)控因子，在心血管疾病中發(fā)揮著重要的作用，既可以作為診斷標(biāo)志物，也可以通過靶向作用來治療疾病[7]。研究表明，冠狀動脈粥樣硬化患者的血清miRNA-206水平明顯高于健康者[8]。然而，目前關(guān)于LEASO 患者介入手術(shù)后miRNA-206水平變化情況及臨床意義方面的研究鮮有報道，因此，本研究對LEASO 患者介入手術(shù)后miRNA-206水平變化情況及臨床意義進(jìn)行探討，以期為臨床診斷和治療提供參考依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019年9月至2021年9月于北京清華長庚醫(yī)院接受手術(shù)治療的LEASO患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合關(guān)于LEASO的診療標(biāo)準(zhǔn)[9]；（2）臨床資料完整；（3）6個月前未使用激素類藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他免疫系統(tǒng)疾??；（2）妊娠期或哺乳期女性；（3）合并嚴(yán)重的肝腎功能障礙；（4）合并全身急慢性感染性疾?。唬?）合并凝血功能障礙；（6）合并惡性腫瘤。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，最終共納入83例LEASO患者作為LEASO組，其中，男性45例，女性38例；年齡43～72歲，平均（57.46±13.34）歲；體重指數(shù)20～25 kg/m2，平均（22.51±2.36）kg/m2；吸煙27例，飲酒31例；高血壓28例。同時選取同期80例健康體檢者作為對照組，其中，男性39例，女性41例；年齡43～71歲，平均（56.75±12.85）歲；體重指數(shù)19～25 kg/m2，平均（22.16±2.41）kg/m2；吸煙23例，飲酒25例；高血壓21例。兩組研究對象的臨床特征比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。根據(jù)預(yù)后的不同將LEASO組患者分為再狹窄組（n=39）和非再狹窄組（n=44）。

1.2 方法

1.2.1 miRNA-206水平檢測

采集LEASO組患者術(shù)前24 h、術(shù)后24 h、術(shù)后1個月、術(shù)后6個月的空腹靜脈血5 ml，采集對照組體檢時空腹靜脈血5 ml，均置于抗凝管中；以3500 r/min的速度離心20 min，提取上層血清液，置于-80℃冰箱中儲存待檢。按照Trizol試劑盒說明書的步驟操作，提取組織中的總RNA，并檢測其濃度和純度，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime-polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀檢測血清中miRNA-206水平。內(nèi)參為U6，引物經(jīng)設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)后由廣州輝駿生物科技股份有限公司合成。miRNA-206引物序列：正向引物為5'-GACTCTGGGAGTGACAAGGC-3'；反向引物為5'-AGATTGGTGGTTACCGCTGG-3'。U6引物序列：正向引物為5'-GCTGGACTCTAGGGTGCAAG-3'；反向引物為5'-GAGCATACCAGGTGGTAGTAG-3'。qRT-PCR反應(yīng)體系共20 μl：cDNA（50 ng/μl）2 μl，SYBR Green Master Mix（2×）10 μl，PCR上下游引物（10 μmol/L）各1 μl，加ddH2O至20 μl。條件為95℃預(yù)變性15 min，1個循環(huán)，然后在95℃變性15 s，65℃退火延伸45 s，共40個循環(huán)。為了減小實(shí)驗(yàn)誤差，各樣品重復(fù)3次，使用2-ΔΔCt方法分析miRNA-206水平。

1.2.2 觀察指標(biāo)

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測并比較LEASO組和對照組術(shù)前（入院時）血清血小板活化因子（platelet activating factor，PAF）、C 反應(yīng)蛋白（C reactive protein，CRP）、miRNA-206水平，比較再狹窄組和非再狹窄組患者術(shù)后6個月的臨床特征、不同時間（術(shù)前、術(shù)后24 h、術(shù)后1個月、術(shù)后6個月）miRNA-206水平，分析LEASO患者介入手術(shù)后發(fā)生再狹窄的危險因素，分析血清miRNA-206對LEASO 患者介入手術(shù)后1個月發(fā)生再狹窄的預(yù)測價值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；采用多因素Logistic回歸模型分析LEASO患者介入手術(shù)后發(fā)生再狹窄的影響因素；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線并計(jì)算曲線下面積（area under the curve，AUC），分析血清miRNA-206對LEASO患者介入手術(shù)后發(fā)生再狹窄的預(yù)測價值。AUC ＞0.9為較高預(yù)測價值，0.7＜AUC ≤0.9為中等預(yù)測價值，0.5≤AUC ≤0.7為較低預(yù)測價值，AUC ＜0.5為基本不具有預(yù)測價值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LEASO 組和對照組術(shù)前血清PAF、CRP、miRNA-206水平的比較

LEASO組的術(shù)前血清PAF、CRP、miRNA-206水平分別為（5.24±1.73）ng/ml、（4.12±1.36）mg/L、（1.87±0.54），均明顯高于對照組的（3.23±1.16）ng/ml、（2.51±0.85）mg/L、（1.01±0.29），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.680、9.020、12.600，P＜0.01）。

2.2 再狹窄組和非再狹窄組患者術(shù)后6 個月臨床特征的比較

術(shù)后6個月，再狹窄組患者血清PAF、CRP 水平均明顯高于非再狹窄組患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；兩組患者的年齡、性別、體重指數(shù)、吸煙情況、飲酒情況、高血壓情況、HDL-C水平、LDL-C水平、FPG水平、植入支架數(shù)量、eGFR水平、TG水平、TC水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

表1 再狹窄組和非再狹窄組患者術(shù)后6個月臨床特征的比較

2.3 手術(shù)前后再狹窄組與非再狹窄組患者miRNA-206 水平的比較

術(shù)后1、6個月，再狹窄組患者的miRNA-206水平均高于非再狹窄組患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；術(shù)前、術(shù)后24 h，再狹窄組與非再狹窄組患者的miRNA-206水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

表2 手術(shù)前后再狹窄組與非再狹窄組患者miRNA-206水平的比較（±s）

表2 手術(shù)前后再狹窄組與非再狹窄組患者miRNA-206水平的比較（±s）

組別術(shù)前 術(shù)后24 h 術(shù)后1個月術(shù)后6個月再狹窄組（n=39） 1.89±0.56 1.84±0.52 1.72±0.43 1.53±0.39非再狹窄組（n=44）1.85±0.53 1.81±0.51 1.52±0.40 1.32±0.21 t值0.3340.2652.1953.102 P值0.7390.7920.0310.003

2.4 LEASO 患者介入手術(shù)后發(fā)生再狹窄影響因素的多因素分析

以miRNA-206水平、術(shù)后6個月PAF 水平、術(shù)后6個月CRP 水平的實(shí)測值作為自變量，以LEASO患者是否發(fā)生再狹窄作為因變量（否=0，是=1），納入多因素Logistic回歸模型中進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，miRNA-206高表達(dá)、PAF 高表達(dá)、CRP 高表達(dá)均是LEASO患者介入手術(shù)后發(fā)生再狹窄的獨(dú)立危險因素（P＜0.05）。（表3）

表3 LEASO患者介入手術(shù)后發(fā)生再狹窄影響因素的多因素分析

2.5 miRNA-206 對LEASO 患者術(shù)后1 個月發(fā)生再狹窄的預(yù)測價值

ROC曲線分析結(jié)果顯示，miRNA-206診斷LEASO患者術(shù)后1個月發(fā)生再狹窄的AUC為0.831（95%CI：0.803～0.942），cut-off值為1.671，靈敏度為91.13%，特異度為76.08%。（圖1）

圖1 miRNA-206預(yù)測LEASO患者術(shù)后1個月發(fā)生再狹窄的ROC曲線

3 討論

LEASO是一種慢性疾病，其中，炎性反應(yīng)會引起細(xì)胞的脂質(zhì)沉積，從而引發(fā)動脈粥樣硬化，導(dǎo)致管腔閉塞，主要臨床表現(xiàn)為皮膚溫度降低、下肢潰瘍，若不及時處理，容易導(dǎo)致截肢等，嚴(yán)重影響患者的健康[10-11]。介入手術(shù)是一種微創(chuàng)手術(shù)，在臨床上廣泛應(yīng)用，但術(shù)后容易發(fā)生再狹窄，影響預(yù)后[12]，因此，尋找有效標(biāo)志物對LEASO患者的預(yù)后進(jìn)行評估對于改善患者的預(yù)后極為重要。

miRNA是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)水平的調(diào)節(jié)因子，通過與靶向miRNA 互補(bǔ)，從而在調(diào)控基因的表達(dá)中發(fā)揮重要的作用[13]。miRNA通過調(diào)控免疫細(xì)胞的分化功能在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用，其與很多疾病的發(fā)生、進(jìn)展有關(guān)，因此可以作為一些疾病的診斷標(biāo)志物[14]。miRNA-206是miRNA家族的一員，由21個核苷酸組成，位于6p12.2染色體上[15]。miRNA-206具有促進(jìn)炎癥反應(yīng)的作用，Ye等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-206在骨關(guān)節(jié)炎患者血清中的表達(dá)水平升高，可以通過調(diào)節(jié)Th17失衡促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展，推測miRNA-206抑制可能是治療骨關(guān)節(jié)炎的一種治療策略。有研究表明，miRNA-206作為炎癥功能的重要指標(biāo)，與對照組相比，冠狀動脈血流緩慢患者的miRNA-206的表達(dá)水平顯著升高[17]。Wang 和Bai[18]的研究表明，miRNA-206是環(huán)狀RNA跨膜7超家族成員3（circular RNA transmembrane 7 superfamily member 3，circTM7SF3）的下游靶向分子，而circTM7SF3可以通過上調(diào)miRNA-206的水平來增加β-羥化酶的表達(dá)，在動脈粥樣硬化細(xì)胞模型中促成氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)損傷。本研究中，LEASO患者手術(shù)前后的miRNA-206水平均較高，且術(shù)前miRNA-206水平明顯高于術(shù)后，另外，LEASO組術(shù)前的miRNA-206水平高于對照組，推測miRNA-206水平的升高促進(jìn)了動脈粥樣硬化斑塊的形成，導(dǎo)致LEASO發(fā)生；術(shù)后，miRNA-206水平逐漸降低，炎性反應(yīng)減少，且術(shù)后1、6個月，再狹窄組患者的miRNA-206水平均高于非再狹窄組患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明miRNA-206水平可能與LEASO患者的不良預(yù)后有關(guān)。本研究中，術(shù)前、術(shù)后24 h，再狹窄組與非再狹窄組患者的miRNA-206水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明患者未發(fā)生再狹窄時的miRNA-206水平無明顯差異。

介入手術(shù)后再狹窄的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，涉及炎性反應(yīng)等多種過程。炎性反應(yīng)在發(fā)生再狹窄的過程中發(fā)揮著重要的作用[19]。PAF 是一種血小板激活劑，具有促進(jìn)炎性反應(yīng)和促進(jìn)血栓形成的作用，在動脈粥樣硬化的形成過程中發(fā)揮著重要的作用[20]。CRP是一種炎癥因子，其水平升高可以損傷血管內(nèi)膜，導(dǎo)致動脈粥樣硬化形成[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后6個月，再狹窄組患者血清PAF、CRP水平均明顯高于非再狹窄組患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明PAF、CRP 也參與了動脈粥樣硬化的發(fā)病過程，參與了LEASO的發(fā)生、發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-206高表達(dá)、PAF 高表達(dá)、CRP 高表達(dá)均是LEASO患者介入手術(shù)后發(fā)生再狹窄的獨(dú)立危險因素，推測miRNA-206、PAF 和CRP 水平的升高共同促進(jìn)了動脈粥樣硬化的形成。本研究亦發(fā)現(xiàn)，miRNA-206表達(dá)水平對LEASO患者術(shù)后1個月發(fā)生再狹窄具有預(yù)測價值，可以將miRNA-206表達(dá)水平作為預(yù)測LEASO患者介入手術(shù)后發(fā)生再狹窄的標(biāo)志物，監(jiān)測其表達(dá)水平有助于降低患者預(yù)后不良的風(fēng)險。

綜上所述，miRNA-206表達(dá)水平的升高與LEASO 患者介入手術(shù)后發(fā)生再狹窄有關(guān)，可以作為預(yù)測LEASO 患者介入手術(shù)后發(fā)生再狹窄的標(biāo)志物。本研究選取的樣本量較少，可能導(dǎo)致研究結(jié)果出現(xiàn)一定的偏倚，后續(xù)會擴(kuò)大樣本量，對其作用機(jī)制進(jìn)一步深入研究，以期為臨床診斷和治療提供依據(jù)。