吳曉雯 王鐵桿 劉穎 張鵬

摘?要：為探究壇紫菜（Neoporphyra haitanensis）溫州洞頭傳統(tǒng)養(yǎng)殖品系與兩個新品系（SW-81，HR-5）的遺傳差異，利用CO I和rbcL基因片段對這3個品系共60株個體進行了遺傳多樣性分析研究。經過比對分析，得到398 bp的CO I基因序列和488 bp的rbcL基因序列等長同源序列，聯(lián)合分析長度為886 bp，所有獲得的序列中T、C、A、G 4種堿基的相對含量分別為35.100%、14.220%、34.320%和16.360%；變異位點共6個，其中單變異位點5個，簡約信息位點1個；3個品系的核苷酸多樣性為0.000 30±0.001，單倍型多樣性為0.249±0.074；60株個體定義了6個單倍型（Hap1～Hap6），其中Hap3是核心單倍型，占全部個體的88.600%；單倍型構建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹表明，各品系存在基因交流，尚未發(fā)生遺傳分化。研究結果表明，壇紫菜新品系的遺傳多樣性較低，因此應加大種質保護和選育范圍，防止種質退化。建議在壇紫菜育苗生產過程中采用多個品系聯(lián)合應用，以適應多變的海洋環(huán)境。

關鍵詞：壇紫菜；新品系；CO I基因；rbcL基因；遺傳多樣性

壇紫菜（Neoporphyra haitanensis）隸屬于紅藻門（Rhodophyta）、紅藻綱（Rhodophyceae）、紅毛菜科（Bangiaceae）、紫菜屬（Neoporphyra）［1］，其味美價廉，富含多種人體必需氨基酸、維生素和微量元素，是我國主要的經濟藻類，在浙江、福建等地大規(guī)模養(yǎng)殖。根據(jù)《2021中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》［2］，浙江省壇紫菜養(yǎng)殖面積已達1.5萬hm2，鮮紫菜產量在7.5萬t以上。壇紫菜產業(yè)的發(fā)展對浙江省水產品發(fā)展、近海岸環(huán)境改善和東海漁場振興有著積極的作用。

在育種技術的不斷進步與選育工作的逐步推進下，壇紫菜育種工作已卓有成效。SW-81是經過紫外人工誘變的野生型突變壇紫菜新品種，具有產量高、品質好、耐高溫且殼孢子放散量大等優(yōu)點。HR-5是紅色雜交品系，具有葉狀體薄、生長快等優(yōu)良特性。劉穎等［3］通過擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）分子標記技術對浙江省臺州市玉環(huán)市箬笠礁海域中的壇紫菜養(yǎng)殖品系與新品系“浙南3號”進行了比對，發(fā)現(xiàn)不同品系間存在一定的基因交流。測序技術的流行和成熟使提供更為準確的核苷酸序列結果成為可能，內轉錄間隔區(qū)ITS-5.8S rDNA和RUBISCO技術［4-6］均在藻類研究中有了應用。線粒體和葉綠體分子標記技術等也得到了應用。線粒體的細胞色素氧化酶亞基I基因（CO I基因）變異較大，是研究種群遺傳變異較好的標記；光合作用第一關鍵酶——核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（rubisco）的大亞基由葉綠體基因組編碼，簡稱rbcL基因。CO I基因和rbcL基因經常被作為分子條形碼標記，用于評估遺傳多樣性，揭示隱藏物種的多樣性或揭示藻類的種群結構［7-8］。

本研究采用CO I和rbcL基因對壇紫菜溫州洞頭地區(qū)傳統(tǒng)養(yǎng)殖品系和兩個新品系的遺傳多樣性進行分析，旨在了解目前該地區(qū)壇紫菜傳統(tǒng)養(yǎng)殖品系與兩個新品系的遺傳多樣性差異，并評估壇紫菜新品系的遺傳背景，為選育更優(yōu)的新品系和育苗生產提供理論依據(jù)。

1?材料和方法

1.1?試驗材料

于2020年分別采集溫州洞頭壇紫菜傳統(tǒng)養(yǎng)殖品系、新品系SW-81和HR-5的新鮮葉狀體17、18、25株，洗凈晾干后，密封保存于-20 ℃冰箱，備用。

1.2?試驗方法

1.2.1?壇紫菜DNA提取

用雙蒸水再次沖洗試驗用壇紫菜葉狀體后，用吸水紙吸干，按照操作說明用DN 14-植物基因組DNA快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司，DN 1401）提取總DNA，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，再利用微量分光光度計（Nano-400）測定DNA的質量濃度，于-20 ℃分管保存。

1.2.2?PCR擴增和測序

本試驗引物序列參考NCBI相關序列：CO I-F：GATGCTGTACCCGGTAGAT，CO I-R：GTTGTAATTGTTTAGCTGTTTTT，rbcL-F：GACTCCAACAGCAAACATCTAG，rbcL-R：TTAATAYCTAGCTCCTTCAGGC。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

本試驗PCR擴增反應選用25 μL反應體系，包括：超純水9.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，2×A8 FastHiFi PCR Master（北京艾德萊生物科技有限公司）12.5 μL。PCR反應程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性10 s，CO I基因引物49 ℃、rbcL基因引物52.5 ℃，退火15 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；最后72 ℃再延伸5 min。每次反應均設置陰性對照，以檢驗是否有污染。PCR產物經質量分數(shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定PCR產物為目的基因條帶后，送至杭州擎科生物科技有限公司進行純化及雙向測序，以確保序列的可靠性。

1.3?數(shù)據(jù)處理

將獲得的原始序列放在DNAstar 5.0軟件包中的Seqman軟件中進行拼接，并結合峰圖進行人工校對，確保每個位點都準確無誤。兩組數(shù)據(jù)（CO I和rbcL）經過NCBI的BLAST驗證，所得的序列均為目的基因。采用DnaSP 5.0［9］分析多態(tài)位點數(shù)、單倍型多樣性和核苷酸多樣性，統(tǒng)計單倍型［10］。采用MEGA 6.0［11］分析堿基組成，計算簡約信息位點數(shù)、單突變位點，根據(jù)K2P兩參數(shù)模型（Kimura-2-Parameter，K2P）［12］計算群體間的遺傳距離以及單倍型遺傳距離，采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)發(fā)育樹各個節(jié)點支持度計算采用bootstrap方法，進行1 000次自檢。利用PopART 1.7［13］構建單倍型網絡圖，探討本試驗研究的壇紫菜單倍型譜系關系。利用DnaSP 5.0中的Tajimas D值推斷物種基因序列的變異類型［14］。使用Arlequin 3.5［15］進行分子方差分析（analysis of molecular variance，AMOVA）。

2?結果

2.1?堿基組成

本試驗共獲得120條序列，經過比對去除測序起始兩端的部分序列，得到398 bp的CO I基因序列和488 bp的rbcL基因序列等長同源序列。3個群體CO I基因序列的T、C、A、G 4種堿基的相對含量分別為37.940%、13.570%、33.920%、14.570%，C+G含量為28.140%，符合線粒體組成特征。上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得的序列號為ON533891～ON533895。rbcL基因的T、C、A、G 4種堿基的相對含量分別為32.790%、14.760%、34.640%、17.810%，上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得的序列號為ON533896～ON533898。聯(lián)合分析長度為886 bp，所有獲得的序列中，T、C、A、G 4種堿基的相對含量分別為35.100%、14.220%、34.320%、16.360%（見表1）。

2.2?遺傳多樣性分析

CO I基因序列有394個保守位點，4個變異位點，其中單變異位點4個，簡約信息位點0個，定義了5個單倍型，單倍型多樣指數(shù)為0.130±0.059，核苷酸多樣性指數(shù)為0.000 34±0.002，平均核苷酸差異度為0.133，Tajimas D值為-1.844（P＜0.05）。

rbcL基因序列保守位點485個，變異位點2個，其中單變異位點1個，簡約信息位點1個，定義了3個單倍型，單倍型多樣性指數(shù)為0.128±0.057，核苷酸多樣性指數(shù)為0.000 27±0.001，平均核苷酸差異度為0.130，Tajimas D值為-1.191（P＞0.10）。

CO I和rbcL基因聯(lián)合遺傳多樣性分析結果見表1。由表1可見，壇紫菜洞頭傳統(tǒng)養(yǎng)殖品系的單倍型多樣性和核苷酸多樣性均高于兩個新品系，新品系HR-5的單倍型多樣性和核苷酸多樣性均最低。

2.3?遺傳距離分析

壇紫菜洞頭傳統(tǒng)養(yǎng)殖品系和兩個新品系的遺傳距離見表2。由表2可見，壇紫菜洞頭傳統(tǒng)養(yǎng)殖品系與新品系SW-81的遺傳距離大于與新品系HR-5的遺傳距離，SW-81和HR-5的遺傳距離較小。

2.4?群體遺傳結構

分子方差分析（AMOVA）的結果見表3。由表3可見，壇紫菜洞頭傳統(tǒng)養(yǎng)殖品系和新品系的遺傳變異大多來自群體內，表明研究的壇紫菜群體的遺傳分化主要表現(xiàn)為群體內分化（FST=0.017，P＞0.05）。群體間的遺傳分化見表2。

Tajimas D值通常用于推斷物種基因序列的變異類型。所有個體，無論是CO I基因（Tajimas D值為-1.844，P＜0.05）、rbcL基因（Tajimas D值為-1.191，P＞0.10），還是 CO I和rbcL基因的聯(lián)合分析（Tajimas D值為-1.954，P＜0.05），結果顯示，Tajimas D值均為負值（見表1），壇紫菜群體在進化過程中發(fā)生了瓶頸效應，說明環(huán)境的選擇作用對有害變異進行了清除。

6個變異位點定義了6個單倍型（Hap1～Hap6），其中Hap3為核心單倍型，占全部個體的88.600%。本地傳統(tǒng)養(yǎng)殖壇紫菜品系的單倍型數(shù)量多于其他兩個品系定義的單倍型數(shù)量（見表1）。單倍型網絡圖見圖1。其他單倍型均由Hap3衍生出來。單倍型網絡圖沒有出現(xiàn)明顯的地理譜系結構。

以條斑紫菜（Pyropia yezoensis）（CO I：KF561997.1；rbcL：AB818919.1）和紫菜（Pyropia fucicola）（CO I：KF561997.1；rbcL：KJ776837.1）為外群，構建壇紫菜單倍型NJ系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖2）。

由系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，3個品系的種群尚未形成明顯的譜系現(xiàn)象。

3?討論

3.1?堿基組成

線粒體DNA的一個突出特點是鳥嘌呤（G）和胞嘧啶（C）相對含量低。在已經測定的藻類線粒體DNA中，G+C的相對含量范圍為13.300%～53.200%，平均值為38%。但大多數(shù)藻類的G+C相對含量集中在20%～40%［16］。本研究中，3個壇紫菜群體的G+C相對含量為28.140%，該結果符合藻類線粒體DNA的組成特征，如紅毛菜綱中紅藻（Cyanidioschyzon merolaede）的G+C相對含量為27%，紅藻門中皺波角叉菜（Chondrus crispus）的G+C相對含量為27%，紫色紫菜（Porpgyra purpurea）的G+C相對含量為33%［16］。

3.2?遺傳多樣性

物種或種群的遺傳多樣性一般來源于長期進化過程中積累的豐富遺傳變異。一個物種的遺傳多樣性越豐富，其對生存環(huán)境的適應能力越強，而物種的適應能力越強，其進化潛力也會越大。遺傳多樣性不僅是生物多樣性的內在表現(xiàn)形式，還是物種保持進化潛能的基本條件，對生物多樣性的形成、發(fā)展或者維持有重要的意義［17-18］。單倍型多樣性是衡量群體遺傳變異的重要指標之一。本次檢測的60株壇紫菜個體只獲得了6個單倍型，表明3個壇紫菜養(yǎng)殖品系的遺傳多樣性水平較低。群體單倍型多樣度是評價該群體多態(tài)程度的重要指標之一，數(shù)值越大，群體遺傳多樣性越高。本研究3個群體的核苷酸多樣性為0.000 30±0.001，單倍型多樣性為0.249±0.074，出現(xiàn)了高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的現(xiàn)象，符合Grant等［19］提出的海洋類生物具有較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性的模式。溫州洞頭傳統(tǒng)養(yǎng)殖品系的單倍型多樣性和核苷酸多樣性最高，其次為新品系SW-81，新品系HR-5最低。劉穎等［3］利用AFLP技術研究發(fā)現(xiàn)，臺州玉環(huán)地區(qū)壇紫菜傳統(tǒng)養(yǎng)殖品系的多態(tài)位點比例高于新品系“浙南3號”，這可能是因為玉環(huán)本地傳統(tǒng)養(yǎng)殖品系的種菜來源多樣且范圍大，而新品系“浙南3號”選育品系的種菜來源范圍較小，所以玉環(huán)品系的遺傳多樣性較高。由此可見，本研究與之前的研究結果是相吻合的，即壇紫菜種群遺傳多樣性整體處于較低水平；人工培育新品系的遺傳多樣性低于本地傳統(tǒng)養(yǎng)殖品系，本地養(yǎng)殖品系的遺傳多樣性又低于野生品系［20］。

壇紫菜是一種喜浪海藻。野生壇紫菜大多分布于高潮帶，在受風浪沖擊的外海礁石上生長特別旺盛［21］。潮間帶受潮汐影響，微生境條件惡劣，該區(qū)域生物會受到溫度、鹽度和干露等條件的考驗，而野生壇紫菜的遺傳多樣性程度較高，可以更好地適應變化多樣的生存環(huán)境。壇紫菜新品系是選自于某株特殊材料，經過誘變、裂解、擴繁培養(yǎng)后得到的純系種質，該方法使得新品系的遺傳多樣性較低。在為農業(yè)生產選育優(yōu)良品種時，一方面需確保穩(wěn)定高產，另一方面則應擴大選育材料來源，以提高種質的遺傳多樣性，確保其適應性更強。

本研究發(fā)現(xiàn)，3個壇紫菜品系間的遺傳分化水平較低，這與劉穎等［3］的研究結果相吻合。壇紫菜大部分為雌雄異體，繁育類型主要為異交，而且生活史中的果孢子及殼孢子都可以通過海流的運動進行長距離傳播。我國沿海同時存在南向和北向兩種主要的洋流模式，一是黑潮的支流，沿我國臺灣北上入東海，即臺灣暖流；二是季節(jié)性的浙閩沿岸流，在冬季和夏季分別自北向南和自南向北流動，促使不同海區(qū)間的聯(lián)系加強［22］。溫州洞頭海域受江浙沿岸流、臺灣暖流、地表徑流等3大洋流的影響，使得壇紫菜果孢子和殼孢子可以隨著洋流漂流，促進壇紫菜不同養(yǎng)殖群體間發(fā)生基因交流，從而減少了群體間的遺傳分化［20］。另外，目前壇紫菜養(yǎng)殖品系間相互混雜，也增加了品種間基因交流的機會［3］。

4?結論

本研究使用線粒體CO I和葉綠體rbcL基因片段對壇紫菜溫州洞頭地區(qū)傳統(tǒng)養(yǎng)殖品系和兩個新品系（SW-81和HR-5）進行研究，發(fā)現(xiàn)新品系的遺傳多樣性較低。因此，應加大種質保護和選育范圍，防止種質退化。在壇紫菜育苗生產過程中，建議采用多個品系聯(lián)合應用，以適應多變的海洋環(huán)境。

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Abstract： In order to explore the genetic differences between the traditional and new strains（SW-81，HR-5） of Neoporphyra haitanensis in Dongtou district，Wenzhou，the genetic diversity of 60 individuals in these three strains was studied using CO?I and rbcL gene fragments.After comparative analysis，the 398 bp CO?I gene sequence and 488 bp rbcL gene sequence were obtained with an isologous sequence，the joint analysis length was 886 bp，and the content of T，C，A and G in all obtained sequences was 35.100%，14.220%，34.320% and 16.360%，respectively.There were 6 mutation sites，including 5 single mutation sites and 1 simple information site;The nucleotide diversity of the three strains was 0.000 30±0.001，and the haplotype diversity was 0.249±0.074.60 individuals defined 6 haplotypes，and Hap3 was the core haplotype，accounting for 88.600% of all individuals，respectively;The haplotype-constructed NJ phylogenetic tree showed that there was gene communication in each strain，and genetic differentiation had not yet occurred.The results showed that the genetic diversity of the new strain of N. haitanensis was low，so the scope of germplasm protection and breeding should be improved to prevent germplasm degradation.It is recommended to use multiple strains in the production process of seaweed seedlings to adapt to the changing marine environment.

Key words： Neoporphyra haitanensis; new strain; CO?I gene;?rbcL?gene; genetic diversity

作者簡介：吳曉雯（1993—），女，助理研究員，研究方向為海洋生物多樣性。E-mail：xwen0106@126.com

通信作者：張鵬（1982—），男，高級工程師，主要從事海洋生物生理生態(tài)研究。E-mail：zhangpeng20011918@163.com

項目資助：浙江省農業(yè)（水產新品種選育）新品種選育重大科技專項（2021C02069-9）；溫州市科研項目（S2020008）；農業(yè)農村部藻類產?業(yè)技術體系（CARS-50）。