譚煒富 ，晏麗君 ，楊麗玲， ，余景滔 ，盧子濱 ，周湘君 ，楊廣麗 ，李薇 ，余林中

1.暨南大學(xué)附屬東莞醫(yī)院，廣東 東莞 523900；2.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院國家中醫(yī)藥管理局科研三級實(shí)驗(yàn)室中藥藥理實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510515；3.廣東醫(yī)科大學(xué)廣東天然藥物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 東莞 523808

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是一種以急性低氧性呼吸衰竭、肺泡通透性增加和嚴(yán)重肺泡水腫為病理表現(xiàn)的呼吸道急癥，可進(jìn)一步發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）。據(jù)報(bào)道，美國ARDS年發(fā)病率為78.9/10萬例，病死率為40%[1]。上海的ICU監(jiān)護(hù)數(shù)據(jù)顯示，15歲以上患者ARDS發(fā)病率為2%，病死率為70%[2]。中國臺灣ARDS年患病率由1997年的2.53/10萬例增加到2011年的19.26/10萬例[3]。ALI的原因包括敗血癥、肺炎、多發(fā)創(chuàng)傷、溺水、胃內(nèi)容物誤吸、肺挫傷、藥物作用和休克等[4]，其基本病理機(jī)制是炎癥反應(yīng)失控，涉及PI3K/Akt、TLR4/NF-κB、AMPK-Nrf2等多條信號通路[5-7]。目前，ALI 尚無有效治療策略[8]。中醫(yī)藥調(diào)控炎癥反應(yīng)具有優(yōu)勢與特色，在膿毒癥、甲型流感、嚴(yán)重急性呼吸綜合征及新型冠狀病毒感染的治療中備受關(guān)注，對相關(guān)方藥的作用與機(jī)制研究已成為當(dāng)前關(guān)注的熱點(diǎn)。

涼膈散出自《太平惠民和劑局方》，由黃芩、連翹、梔子、薄荷、大黃、芒硝、淡竹葉和甘草組成。相關(guān)臨床研究[9-10]及本團(tuán)隊(duì)前期實(shí)驗(yàn)研究[11-12]均表明，以涼膈散作為主方治療嚴(yán)重感染致ALI療效確切，但其作用機(jī)制尚未完全闡明。前期網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析顯示，涼膈散的作用靶點(diǎn)主要富集于PI3K/Akt通路[13]?；诖?，本研究通過生物信息學(xué)方法從所富集的PI3K/Akt通路進(jìn)一步識別涼膈散治療ALI的關(guān)鍵作用靶分子，并通過建立ALI小鼠模型進(jìn)行驗(yàn)證，為涼膈散防治ALI的臨床應(yīng)用與開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 涼膈散-PI3K/Akt通路相關(guān)急性肺損傷疾病基因分析

檢索GEO數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）建庫至2022年11月1日收錄的ALI基因表達(dá)譜芯片： ①疾病為“Acute lung injury”“Sepsisassociated acute lung injury”“Sepsis-associated acute respiratory distress syndrome”；②組織來源為血液；③條目類型為“Sereies”；④研究類型為“Expression profiling by array”；⑤Top Organisms 選擇“Homo sapiens”；⑥樣本集包含疾病組與對照組。通過R語言ComBat包去除批次效應(yīng)后，用limma包進(jìn)行差異表達(dá)分析，篩選P＜0.05且|logFC|＞0.2的疾病基因，為ALI特征表達(dá)基因。

通過TCMSP（https://www.tcmsp-e.com/）和中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺（TCMIP，http://www.tcmip.cn/）檢索涼膈散組方藥物大黃、連翹、黃芩、甘草、梔子、薄荷、芒硝、淡竹葉的化學(xué)成分，以口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18為條件篩選活性成分，并提取其作用靶點(diǎn)。通過KEGG（https://www.kegg.jp/）檢索“PI3K-Akt”通路，提取通路相關(guān)基因。

將ALI 疾病特征表達(dá)基因、涼膈散潛在靶點(diǎn)及PI3K/Akt通路相關(guān)基因取交集，得到?jīng)鲭跎?PI3K/Akt通路相關(guān)ALI疾病基因，通過R語言Venn包生成交集圖。提取矯正后交集基因的表達(dá)量數(shù)據(jù)，采用RevMan5.3進(jìn)行單基因Meta分析并繪制森林圖。

1.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.1 動(dòng)物、試藥與儀器

清潔級雄性BALB/c小鼠，5～6周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SCXK（粵）2021-0041，動(dòng)物使用許可證號SYXK（粵）2021-0167。飼養(yǎng)于SPF級實(shí)驗(yàn)室，溫度22～26 ℃，濕度40%～70%，12 h/12 h晝夜循環(huán)，每籠4只，自由飲水進(jìn)食。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會批準(zhǔn)（L2021064），根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南進(jìn)行操作。

中藥飲片黃芩（批號211002401）、連翹（批號211201101）、梔子（批號211002521）、薄荷（批號211000191）、大黃（批號211100199）、芒硝（批號210902001）、甘草（210902241）、淡竹葉（批號211003072），廣東康美藥業(yè)有限公司（中國廣州）；TRIzol（批號15596018），Invitrogen 公司；TWS119（批號M2304）、Wortmannin（批號M2053），Abmole公司；PrimeScript Tyragent Kit with gDNA Eraser（批號AL62453A）、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（批號ALE2949A），日本Takara公司；3-(4,5-二甲基噻唑-2-yl)-2,5-二苯基四溴化銨（MTT，批號M5655）、脂多糖（大腸桿菌055:B5，批號110M4086V），Sigma-Aldrich公司；胎牛血清（批號2166451）、高糖培養(yǎng)基（批號8118328）、青霉素/鏈霉素（批號R001100、15070-054），GIBCO公司；小鼠輔助性T細(xì)胞（Th17，批號KTH217）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg，批號KTR201）檢測試劑盒、紅細(xì)胞裂解溶液（批號LSC01、LSC02），杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；小鼠白細(xì)胞介素-17（IL-17）ELISA試劑盒（批號CSB-E12819h）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）ELISA 試劑盒（批號CSBE04725h），武漢華美生物工程股份有限公司。

N-1200B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），DGX-9243BC-1型冷凍干燥器（中國上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），YP10002型分析天平（上海佑科儀器儀表有限公司），BA 110S 型電子天平（Sartorius公司），QL-901型渦旋振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），Thermo FC 型酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific公司），CytoFLEX型流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter公司），DS-11+型超微量分光光度計(jì)（Denovix公司），LightCycler?96型實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（Roche公司）。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.2.1 涼膈散藥液制備

按涼膈散原方比例稱取連翹24 g、梔子6 g、黃芩6 g、甘草12 g，加10倍體積蒸餾水浸泡30 min后加熱，煮沸20 min，然后加入大黃12 g、薄荷6 g、淡竹葉6 g，繼續(xù)煎煮，煮沸10 min后倒出煎煮液；向藥渣中加入6倍體積蒸餾水繼續(xù)煮沸10 min，合并2次煎液后3層紗布過濾，趁熱加入芒硝12 g，攪拌溶解后用3層濾紙抽濾得到藥液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮至稠液后，冷凍干燥12 h使其形成干粉。準(zhǔn)確稱取干粉，溶于PBS中，配制成20 mg/mL藥液，渦旋振蕩器上渦旋，微孔濾膜過濾除菌，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 分組、給藥及取材

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白組、模型組、涼膈散組、TWS119組、涼膈散+Wortmannin組，每組8只。涼膈散組予涼膈散藥液（60 g/kg）灌胃，每日分早晚2次；TWS119組予GSK-3β抑制劑TWS119（50 mg/kg）腹腔注射，每日1次；涼膈散+Wortmannin組予涼膈散藥液（60 g/kg）灌胃，每日分早晚2次，以及GSK-3β激動(dòng)劑Wortmannin（0.7 mg/kg）腹腔注射，每日1次；空白組和模型組予等量生理鹽水灌胃或腹腔注射。連續(xù)給藥7 d后，除空白組外，各組小鼠氣管滴注脂多糖（3 mg/kg）建立ALI模型，空白組小鼠氣管滴注等量生理鹽水。12 h后，各組小鼠用1.5%（W/V）戊巴比妥鈉溶液麻醉后心臟采血，脫頸處死，分離氣管，打開胸腔，采集肺組織。

1.2.2.3 指標(biāo)檢測

取新鮮肺組織，稱取濕重（W），于烤箱60 ℃烘干至質(zhì)量不再改變，稱取干重（D），計(jì)算肺濕/干重比值（W/D），評估肺水腫程度。

使用肝素鈉抗凝管收集血液，檢測全血Th17、Treg細(xì)胞含量。Th17細(xì)胞抗體標(biāo)記為FITC-抗CD4和PE-抗IL-17A，CD4+IL-17+為Th17細(xì)胞；Treg細(xì)胞抗體標(biāo)記為PE-抗CD25和APC-抗Foxp3，CD25+Foxp3+為Treg細(xì)胞，按試劑盒說明書步驟處理后，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

取小鼠肺組織，用眼科剪刀剪碎，組織勻漿后，2 000 r/min離心10 min，取上清液，采用ELISA試劑盒檢測IL-17、TGF-β含量。

取小鼠肺組織，用眼科剪刀剪碎，組織勻漿后，使用miRcute miRNA試劑盒提取總RNA后，采用超微量分光光度計(jì)檢測RNA 的質(zhì)量和濃度。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA 后，采用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）檢測GSK-3β表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對表達(dá)量。所用引物由華大基因公司提供，序列信息見表1。

表1 基因PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。采用標(biāo)準(zhǔn)化均數(shù)差（SMD）作為合并統(tǒng)計(jì)量進(jìn)行單基因Meta分析，分析前進(jìn)行異質(zhì)性檢驗(yàn)，不存在異質(zhì)性（P≥0.1，I2=0%）采用固定效應(yīng)模型分析數(shù)據(jù)，存在異質(zhì)性（P＜0.1，I2＞0%）采用隨機(jī)效應(yīng)模型。計(jì)量資料用±s表示。采用方差分析評估多組間差異，事后檢驗(yàn)采用圖基（Tukey）檢驗(yàn)法。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 涼膈散-PI3K/Akt通路相關(guān)ALI疾病基因篩選及單基因Meta分析

從GEO 數(shù)據(jù)庫得到3 個(gè)基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)集GSE10474、GSE2322和GSE32707，獲得189份樣品（包括50例ALI/ARDS患者和139例膿毒癥患者對照），行批次處理后樣本間批次效應(yīng)被消除，進(jìn)行基因表達(dá)差異分析，篩選出764個(gè)ALI疾病特征表達(dá)基因（見圖1A～圖1C）。通過TCMSP和TCMIP數(shù)據(jù)庫收集到?jīng)鲭跎⒔M方藥物候選活性化合物274個(gè)，其中來源于大黃81個(gè)、連翹23個(gè)、黃芩36個(gè)、甘草92個(gè)、梔子15個(gè)、薄荷22個(gè)、芒硝1個(gè)、淡竹葉4個(gè)，刪除重復(fù)成分并提取其相應(yīng)靶點(diǎn)共330 個(gè)。通過KEGG 檢索提取PI3K/Akt通路（ID：HSA04151）相關(guān)基因354個(gè)。將764個(gè)ALI特征表達(dá)基因、330個(gè)涼膈散作用靶點(diǎn)及354個(gè)PI3K/Akt通路相關(guān)基因取交集，得到?jīng)鲭跎?PI3K/Akt 通路相關(guān)ALI 疾病基因4 個(gè)，分別為GSK3β、CDKN1A、NFKB1和MCL1（見圖1D），多表達(dá)數(shù)據(jù)集差異分析結(jié)果見表2。單基因Meta 分析發(fā)現(xiàn)，CDKN1A、MCL1和GSK3β這3個(gè)基因表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。其中，CDKN1A基因在ALI患者體內(nèi)低表達(dá)（SMD=-0.80，P＜0.001），MCL1基因在ALI 患者體內(nèi)高表達(dá)（SMD=0.41，P=0.02），GSK3β基因在ALI患者體內(nèi)高表達(dá)（SMD=0.66，P＜0.001）。前期研究表明，涼膈散中多個(gè)有效成分與GSK-3β對接良好[12]，故選擇GSK-3β為作用靶點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

圖1 涼膈散-PI3K/Akt通路相關(guān)ALI疾病基因的生物信息學(xué)篩選

圖2 涼膈散-PI3K/Akt通路相關(guān)ALI疾病基因Meta分析森林圖

表2 涼膈散-PIK3/Akt通路相關(guān)ALI疾病基因多表達(dá)數(shù)據(jù)集差異分析

2.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

2.2.1 涼膈散通過抑制GSK-3β表達(dá)降低急性肺損傷小鼠肺濕/干重比值

涼膈散能顯著降低ALI小鼠肺W/D比值，減輕肺水腫；TWS119與涼膈散作用相似；加入Wortmannin處理后，小鼠肺W/D比值升高，提示W(wǎng)ortmannin可拮抗涼膈散降低肺組織毛細(xì)血管通透性以減輕肺水腫的作用。見圖3a。與空白組比較，模型組小鼠肺組織GSK-3β基因表達(dá)顯著升高，涼膈散或TWS119能顯著下調(diào)ALI小鼠GSK-3β基因表達(dá)，但Wortmannin處理可拮抗涼膈散對GSK-3β的下調(diào)作用。見圖3b。

圖3 各組小鼠肺W/D比值及肺組織GSK-3β表達(dá)比較（±s，每組8只）

2.2.2 涼膈散改善急性肺損傷小鼠Th17/Treg失衡

涼膈散和TWS119均能顯著降低ALI小鼠外周血Th17細(xì)胞比例和Th17/Treg比值，提高Treg細(xì)胞比例，表明涼膈散可改善Th17/Treg 比例失衡。加入Wortmannin處理后，Treg細(xì)胞比例顯著降低，Th17/Treg比值顯著升高，表明Wortmannin可抵消涼膈散改善Th17/Treg失衡的作用。見圖4。

圖4 各組小鼠外周血Th17、Treg細(xì)胞比例及Th7/Treg比值比較（±s，每組8只）

2.2.3 涼膈散降低急性肺損傷小鼠細(xì)胞因子含量

與空白組比較，模型組IL-17A 含量顯著升高，TGF-β含量下降。涼膈散和TWS119均能顯著升高ALI小鼠肺組織TGF-β含量，且涼膈散能顯著降低ALI小鼠IL-17A 含量。Wortmannin 處理可抑制涼膈散對IL-17A的下調(diào)及對TGF-β的上調(diào)作用。見圖5。

圖5 各組小鼠肺組織IL-17A、TGF-β含量比較（±s，每組8只）

3 討論

ALI/ARDS是危及生命的急重癥，由于無特效藥，病死率居高不下，成為重癥醫(yī)學(xué)難點(diǎn)[1，14]。臨床研究表明，以涼膈散為主方治療因嚴(yán)重感染及炎癥反應(yīng)失控所致的ALI具有確切療效，本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，涼膈散通過抑制NF-κB、p38MAPK等信號通路降低脂多糖溫?zé)岵〖彝醚獫{腫瘤壞死因子（TNF）-α水平，抑制內(nèi)毒素血癥小鼠炎癥因子TNF-α及IL-6表達(dá)，下調(diào)小鼠巨噬細(xì)胞CD14表達(dá)，減輕肺組織損傷，提示涼膈散可在血液、肺等多部位、多靶點(diǎn)、多機(jī)制發(fā)揮治療作用[10，15-17]。研究表明，PI3K/Akt 信號通路參與ALI/ARDS的發(fā)生發(fā)展過程[18]。本團(tuán)隊(duì)近期研究發(fā)現(xiàn)，涼膈散作用靶點(diǎn)主要富集于PI3K/Akt通路[11，13-14]。本研究利用基因表達(dá)譜芯片、單基因Meta分析進(jìn)一步預(yù)測涼膈散的具體作用靶點(diǎn)，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合基因表達(dá)譜芯片分析顯示，在PI3K/Akt通路相關(guān)的ALI疾病特征基因中，GSK3β、CDKN1A、NFKB1和MCL1可受涼膈散調(diào)節(jié)。研究表明，GSK-3β 作為炎癥反應(yīng)的中樞激酶，是NF-κB、p38等多條炎癥信號通路的共同靶分子，GSK-3β的激活是協(xié)同放大炎癥級聯(lián)反應(yīng)、推動(dòng)ALI向ARDS進(jìn)展的關(guān)鍵性因素。而CDKN1A則通過p53/p21途徑參與抵抗肺泡上皮凋亡[19]。研究表明，MCL1影響ALI的疾病進(jìn)程，下調(diào)MCL1水平可促使ALI小鼠中性粒細(xì)胞凋亡及巨噬細(xì)胞清除凋亡細(xì)胞，從而加速肺部炎癥的緩解[20]。對上述4個(gè)基因進(jìn)行單基因Meta分析以進(jìn)一步篩選最佳靶點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GSK-3β在ALI中表達(dá)顯著上調(diào)，推測涼膈散可能通過抑制GSK-3β表達(dá)而發(fā)揮抗ALI作用。

GSK-3β是一種絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，廣泛存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)，可調(diào)控多種生理病理功能，如糖原合成，細(xì)胞分化、增殖、死亡等。GSK-3β在肺部不僅可與TRIB3相互作用促進(jìn)炎癥纖維化，還可調(diào)控血液中T細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)[21]。近年研究發(fā)現(xiàn)，GSK-3β參與調(diào)控機(jī)體的獲得性免疫：生理狀態(tài)下，Th17細(xì)胞及Treg細(xì)胞在體內(nèi)處于動(dòng)態(tài)平衡，激活GSK-3β可促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞亞型分化、減少Treg細(xì)胞亞型分化，抑制Treg細(xì)胞活性，進(jìn)而影響Th17/Treg平衡。Th17/Treg保持平衡則內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，反之內(nèi)環(huán)境失衡，免疫功能紊亂，炎癥反應(yīng)失控，釋放過量炎癥因子導(dǎo)致肺泡毛細(xì)血管膜損傷、通透性增加，最終造成肺水腫、損傷[22-24]。

GSK-3β抑制劑在治療ALI/ARDS中表現(xiàn)出顯著抗炎作用，可通過抑制小鼠炎癥細(xì)胞浸潤和降低促炎癥細(xì)胞因子水平而減輕肺部急性炎癥損傷[25]。TWS119是一種GSK-3β抑制劑，可通過抑制GSK-3β的磷酸化而影響機(jī)體某些免疫細(xì)胞的增殖、分化和控制炎癥發(fā)展[26-27]。盡管目前尚無針對GSK-3β的特異性激活劑，但是可通過影響其他途徑而激活GSK-3β。Wortmannin是PI3K抑制劑，因其阻斷了MAPK和p90 S6激酶的級聯(lián)反應(yīng)過程而保護(hù)GSK-3β的活性不受抑制[28]。本研究利用脂多糖誘導(dǎo)小鼠ALI發(fā)現(xiàn)，模型組肺水腫明顯，GSK-3β基因表達(dá)顯著升高，經(jīng)涼膈散或TWS119治療后小鼠肺水腫顯著減輕，GSK-3β基因表達(dá)下調(diào)，但Wortmannin可逆轉(zhuǎn)涼膈散的上述作用，表明涼膈散可能通過GSK-3β抑制劑形式發(fā)揮抗ALI作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠外周血Th17細(xì)胞比例、Thl7/Treg比值明顯升高，Treg細(xì)胞明顯減少，提示存在Th17/Treg 失衡。涼膈散或TWS119 能明顯下調(diào)Th17細(xì)胞比例和Th17/Treg比值，增加Treg細(xì)胞比例，促使Th17/Treg 平衡從Th17 向Treg 側(cè)偏移。但Wortmannin可部分逆轉(zhuǎn)涼膈散改善Th17/Treg失衡作用，提示涼膈散具有類似GSK-3β抑制劑的效應(yīng)，可以調(diào)控Th17/Treg平衡。

相關(guān)研究表明，Th17細(xì)胞主要分泌促炎細(xì)胞因子IL-17A，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)或自身免疫性疾病，Treg細(xì)胞則主要分泌抗炎細(xì)胞因子TGF-β，以維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)[29]。本研究ELISA結(jié)果顯示，涼膈散或TWS119能明顯下調(diào)IL-17A水平，上調(diào)TGF-β水平，Wortmannin可逆轉(zhuǎn)涼膈散的上述作用，表明涼膈散可通過抑制GSK-3β表達(dá)調(diào)節(jié)IL-17A、TGF-β水平，從而發(fā)揮治療ALI作用。

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)分析預(yù)測GSK-3β是涼膈散治療ALI的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，并通過小鼠模型驗(yàn)證了涼膈散可通過抑制GSK-3β表達(dá)調(diào)控Th17/Treg平衡，調(diào)節(jié)IL-17A、TGF-β分泌，進(jìn)而發(fā)揮抗ALI的作用?？蔀橹兴幏乐蜛LI作用機(jī)理研究提供新思路，亦為涼膈散的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。