鄭 偉,薛 玲,鄭 敏,于 瀟,劉金星

(1. 山東青島中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,山東 青島 266002;2. 棗莊市中醫(yī)醫(yī)院,山東 棗莊 277000;3. 山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院,山東 濟南 250014)

卵巢是女性重要的生殖腺,卵巢內(nèi)原始卵泡的儲備反映了女性的生殖和內(nèi)分泌潛能,遺傳、年齡、社會心理、藥物及手術(shù)創(chuàng)傷等因素會引起卵巢儲備功能減退(diminished ovarian reserve,DOR)。DOR引起的月經(jīng)模式紊亂、生育能力降低及不良妊娠結(jié)局等問題嚴重困擾著育齡女性的生殖內(nèi)分泌功能。近年來本病低齡化趨勢顯著增加,其發(fā)病率約占卵巢疾病的20%[1]。隨著細胞自噬學說的深入研究,越來越多的學者認為DOR的發(fā)生與顆粒細胞(granulosa cells,GCs)自噬活性異常引起的卵泡異常募集和閉鎖相關(guān)[2-3]。以調(diào)節(jié)細胞自噬為基點,探討不同藥物治療DOR的藥效學研究是目前DOR實驗研究的熱點。多數(shù)中醫(yī)學者認為DOR的病機是腎虛,臨床辨治本病從補腎填精入手以平調(diào)腎中陰陽[4]。筆者研讀中醫(yī)基礎(chǔ)理論,認為細胞自噬的過程和DOR的發(fā)生符合精氣、陰陽學說的理論要點。本文擬以中醫(yī)基礎(chǔ)理論釋意細胞自噬為出發(fā)點,運用傳統(tǒng)的中醫(yī)學概念來解釋現(xiàn)代分子生物學的知識,且淺議中醫(yī)藥調(diào)控細胞自噬治療DOR的研究現(xiàn)況,以期為中醫(yī)藥治療DOR提供新的理論依據(jù)及參考思路。

1 細胞自噬對DOR發(fā)生的影響

DOR的發(fā)生以卵巢內(nèi)卵母細胞的數(shù)量減少和(或)質(zhì)量下降為主要特征,這與卵泡過度閉鎖和異常募集相關(guān)[5]。氧化應(yīng)激(oxidative stress,OS)條件下,GCs自噬活性的異常引起卵泡的異常募集和發(fā)育損傷,可能是引起DOR發(fā)生的機制之一[6]。

1.1GCS自噬對卵泡發(fā)育的影響 卵泡的生長發(fā)育是卵母細胞、GCs及卵泡膜細胞相互作用的結(jié)果。其中,GCs環(huán)繞著卵丘和卵泡膜內(nèi)壁,其形態(tài)和功能的變化影響著卵母細胞和卵泡膜細胞的生長和分裂。另外,GCs參與性激素的合成與分泌,調(diào)控卵巢內(nèi)細胞因子(如激活素A、抑制素B)的表達,對卵泡的生長發(fā)育起著重要的作用。GCS自噬對卵泡的發(fā)育有兩種作用機制:一是保護性自噬,即基礎(chǔ)的細胞自噬有助于維持原始卵泡的數(shù)量、生殖細胞的存活以及去除黃體殘留[3];二是死亡性自噬,即高水平的細胞自噬誘發(fā)原始卵泡的提前募集及生長卵泡的異常閉鎖。Delcour等[6]認為自噬相關(guān)蛋白(autophagy-related protein,ATG)ATG7和ATG9A的缺失會引起自噬體生物合成減少,進而出現(xiàn)自噬功能受損,影響原始卵泡的保存和卵巢儲備。邵童[7]通過mRNA表達芯片分析發(fā)現(xiàn)DOR患者GCs中存在著自噬缺陷,該缺陷一方面阻礙了GCs的分化進程,另一方面影響GCs損傷后的增殖和修復(fù)能力,引起GCs的過度衰老,導(dǎo)致卵泡的提前閉鎖。

1.2OS是GCs自噬的主要原因 OS是細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)大量累積后破壞機體的氧化還原平衡,引起脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子的氧化損傷。卵巢GCs中性類固醇的生物合成需要大量能量消耗,細胞內(nèi)會產(chǎn)生高水平的ROS,生殖過程中加速的代謝率也會產(chǎn)生大量的氧自由基,因此,有學者認為OS誘導(dǎo)的GCs過度自噬是引起卵泡異常閉鎖和DOR發(fā)生的主要驅(qū)動力[8]。生理環(huán)境下,ROS的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài),GCs分泌大量的始基卵泡活化抑制因子(如bFGF、GDF-9、BMPs、FOXOs),抑制卵泡的過度募集,使卵泡池內(nèi)原始卵泡數(shù)量維持在正常范圍[9]。然而發(fā)生OS時,生長卵泡不能進行成熟分裂而過度自噬或凋亡,會直接或間接損傷卵巢原始卵泡池的儲備。究其原因,一方面,始基卵泡缺少卵泡抑制因子調(diào)控,始基卵泡的激活和募集過度增加,另一方面過度的ROS活性會引起耐受力弱的始基卵泡直接凋亡[10]。高強氧化應(yīng)激狀態(tài)下,為了保護快速減少的始基卵泡,卵巢自噬活性過度增加,通過不同的信號途徑觸發(fā)細胞自噬性死亡。

1.3調(diào)節(jié)細胞自噬水平可以緩解GCs的異常凋亡目前研究證實褪黑素(melatonin,MT)、白藜蘆醇、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH )等制劑可以通過減輕OS引起的GCs自噬性損傷,減少GCs的異常凋亡。MT是一種強大的抗氧化劑,通過上調(diào)其他抗氧化酶的活性直接或間接地清除ROS。Xie等[11]實驗證實MT通過下調(diào)ERK途徑緩解了線粒體和卵巢儲備功能的損傷,防止過度自噬導(dǎo)致的抗苗勒管激素表達下降、細胞周期停滯和線粒體膜電位的損傷。李琰珉[12]實驗證實:通過血清饑餓法體外誘導(dǎo)GCs自噬,加入MT干預(yù)后可以通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制自噬相關(guān)蛋白的表達,繼而抑制GCs自噬,增加原始卵泡和生長卵泡的數(shù)量,減少閉鎖卵泡。Yong等[13]實驗結(jié)果顯示,有機磷農(nóng)藥馬拉硫磷(Malathion)暴露誘導(dǎo)的OS會引起卵巢生殖功能損傷,其中使卵巢組織中ROS增加,GCs自噬增加,小鼠動情周期明顯紊亂,而白藜蘆醇通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路活性減輕卵巢組織的毒性,激活下游抗氧化酶活性,降低GCs的氧化應(yīng)激,抑制卵泡GCs的過度自噬。Shen等[14]研究了FSH對小鼠GCs自噬的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)FSH可以抑制OS誘導(dǎo)的GCs自噬作用。FSH干預(yù)后可以阻斷缺氧誘導(dǎo)因子1-a減弱自噬信號,顯著抑制MAP1LC3B-Ⅰ向MAP1LC3B-Ⅱ的轉(zhuǎn)化、mTOR去磷酸化、SQSTM1降解和BECN1表達,進而改善體內(nèi)OS條件下的巨自噬/自噬的通量受損。

2 中醫(yī)基礎(chǔ)理論釋議DOR與細胞自噬

中醫(yī)學認為宇宙的一切事物都是由精或氣構(gòu)成的,而相互關(guān)聯(lián)的事物或同一事物內(nèi)部又存在著陰、陽兩個相互對立又相關(guān)的方面。用中醫(yī)基礎(chǔ)理論釋議DOR與細胞自噬,一方面細胞自噬符合中醫(yī)學精氣學說及陰陽學說的基本內(nèi)容,另一方面DOR的發(fā)生存在著精氣、陰陽失調(diào)的基本病機。

2.1中醫(yī)基礎(chǔ)理論釋議自噬

2.1.1精氣學說與自噬 精氣學說是研究宇宙生成及世界本原的學術(shù)思想,認為世界萬物的生成皆是精氣自身運動的結(jié)果;精氣通過不停的升、降、聚、散的運動,使得自然界在無形之氣及有形之體之間不斷地變化;精氣維系著天地萬物的相互聯(lián)系,使事物之間相互感動,相互作用?！吨芤住酚涊d“精氣為物”;《管子》記載“一氣能變曰精”;《素問·六微旨大論》記載“非升降則無以壯老矣,非出入則無以化收藏”。

自噬起源于希臘文“autophagy”,原意是“自己吃掉自己”。自噬雖然需要通過熒光顯微鏡或透射電鏡來驗證,但縱觀其全過程,在不同方面都體現(xiàn)著精氣的特性。①物質(zhì)性:精氣是占有一定空間的精微物質(zhì);自噬以一定物質(zhì)結(jié)構(gòu)存在于細胞內(nèi);如透射電鏡下吞噬泡呈雙層或多層膜結(jié)構(gòu)的新月狀或杯狀,有包繞胞漿成分的趨勢;自噬小體是雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu),內(nèi)含胞漿成分;自噬溶酶體為單層膜結(jié)構(gòu),胞漿成分已降解。②彌散性:精氣彌散連續(xù)、無處不在;自噬作為Ⅱ型程序性死亡的方式廣泛地存在于真核細胞內(nèi),依賴溶酶體途徑自我清除受損的、衰老的細胞器和不需要的大分子物質(zhì),以實現(xiàn)細胞自身的代謝需求。③能動性:精氣處于永恒的自發(fā)運動中;自噬也是一個動態(tài)的過程;自吞噬體(雙層膜結(jié)構(gòu))包裹待降解的細胞器(線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)),與胞內(nèi)體融合形成自體吞噬泡,由溶酶體降解吞噬泡轉(zhuǎn)運的內(nèi)容物,變成可溶性的小分子物質(zhì)進入細胞質(zhì)基因繼續(xù)參與細胞的物質(zhì)代謝[15]。④關(guān)聯(lián)性:精氣是天地萬物相互聯(lián)系的中介;自噬與凋亡、焦亡等其他細胞死亡方式共同存在,相互調(diào)控并參與疾病的發(fā)生發(fā)展。如實驗證實:大腦中動脈閉塞模型大鼠腦缺血再灌注后12 h內(nèi)細胞自噬和凋亡同時被激活,而在2 d后可能存在從細胞凋亡到自噬的轉(zhuǎn)換[16];H9C2心肌細胞在缺氧復(fù)氧損傷過程中細胞自噬、焦亡、凋亡同時存在,其中自噬被抑制,細胞焦亡及凋亡增加[17]。

2.1.2陰陽學說與自噬 陰陽學說是用“陰”和“陽”兩個對立且相關(guān)的屬性概括自然界相互關(guān)聯(lián)的事物或現(xiàn)象,并闡釋事物發(fā)生、發(fā)展、變化的思維方法。陰陽兩個方面既對立制約又相互為用,在消長變化中可以相互轉(zhuǎn)化,在不斷運動中相互作用維持著自然界的協(xié)調(diào)平衡。《素問·陰陽應(yīng)象大論》記載:“陰陽者,天地之道也,萬物之綱紀,變化之父母,生殺之本始,神明之府也。”

用陰陽學說釋議細胞自噬,源于細胞內(nèi)環(huán)境與細胞自噬之間,以及自噬運動本身都不是靜態(tài)不變的,而是屬陰和屬陽的兩個方面相互制約、相互為用、相互消長的結(jié)果。①對立制約:筆者認為細胞自噬與細胞內(nèi)環(huán)境是相互對立、相互約束的,表現(xiàn)出陽勝陰退、陰強陽弱的動態(tài)聯(lián)系。其中,細胞內(nèi)環(huán)境是有形的、短期內(nèi)相對靜止和內(nèi)守的,屬陰;而自噬的發(fā)生是無形的、運動的、興奮的,屬陽。自噬本身是個推陳出新的過程,其中降解廢棄的蛋白質(zhì)和受損的細胞器的過程相對衰退、下降、抑制屬陰,而產(chǎn)生氨基酸、核苷糖酸的過程相對亢進、上升、興奮屬陽。②互根互用:自噬以細胞內(nèi)環(huán)境為載體,是細胞自身防御和應(yīng)激的調(diào)控機制;自噬通過消除、降解或消化受損、變性、衰老的細胞器及變性蛋白質(zhì),可以實現(xiàn)細胞器自我更新,維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性。生理狀態(tài)下,細胞內(nèi)存在著低水平的基礎(chǔ)性自噬,以維持細胞自身結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。當機體受到外源性刺激或機械損傷時,細胞自吞噬活性增加,誘發(fā)保護性自噬。③消長平衡:細胞的自噬水平是隨著機體的動靜狀態(tài)及細胞因子調(diào)控水平而消長變化,代謝后大分子物質(zhì)生成氨基酸、核苷糖酸被細胞重新利用,為細胞的功能活動提供能量,使細胞內(nèi)環(huán)境及自噬進程均保持著相對的動態(tài)平衡,即“陰平陽秘”。然而當細胞受到持久或過強的刺激,細胞自噬水平過度增高或相對不足時,或者調(diào)節(jié)信號因子調(diào)控細胞自噬相對異常時,破壞了細胞內(nèi)環(huán)境及細胞自噬的動態(tài)平衡,則出現(xiàn)“陰陽失調(diào)”的病理變化。如卵巢GCs自噬缺陷可能會造成GCs基礎(chǔ)狀態(tài)異?；驊?yīng)激損傷后細胞穩(wěn)態(tài)維持障礙,引起了DOR、PCOS等疾病的發(fā)生[18]。邵童[7]研究發(fā)現(xiàn)DOR患者不僅存在GCs自噬缺陷,而且GCs的自噬水平較低。馬智等[19]通過皮下注射脫氫表雄酮制備PCOS模型大鼠,通過透射電鏡及細胞學檢測證實:PCOS 模型大鼠卵巢GCs中同時存在細胞增殖率降低和過度自噬的現(xiàn)象。張光云等[20]研究發(fā)現(xiàn)卵巢過度刺激后,通過誘導(dǎo)ROS的累積而引起保護性自噬的發(fā)生,自噬和Nrf2蛋白可以同時發(fā)揮抗氧化作用、抑制GCs的凋亡。

2.2DOR的中醫(yī)學病因病機 中醫(yī)學沒有“卵巢儲備功能減退”的記載,但此證符合清·傅山《傅青主女科》“年未老經(jīng)水斷”的論述 。此外,該病引起的月經(jīng)異常、生育能力下降的表現(xiàn)歸屬于中醫(yī)學“血枯”“血滯”“經(jīng)閉”“無子”等范疇?，F(xiàn)代學者多認為DOR的發(fā)生與腎中精氣虧虛密切相關(guān),存在腎陰、腎陽的虛衰,病位在沖任胞宮,變化在氣血,表現(xiàn)為經(jīng)水漸斷,胎孕難成[21]。

腎中所藏的精氣,不僅是構(gòu)成和維持人體生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ),也是月經(jīng)的產(chǎn)生和胎孕進程的關(guān)鍵因素。古代醫(yī)家多認為“經(jīng)水出諸腎”(《傅青主女科》),“經(jīng)候不調(diào),病皆在腎經(jīng)”(《婦人規(guī)》),“腎者,主蟄,封藏之本,精之處也”(《素問·六節(jié)藏象論》)。女性生殖機能的盛衰以腎為主導(dǎo),若腎精充盛,天癸成熟,沖任氣血滿溢胞宮,則“月事以時下,故有子”;然腎精虛衰,天癸枯竭,沖任氣血衰少,經(jīng)斷其流,則“地道不通,形壞而無子”。

腎藏精,精化氣,氣分陰陽,腎中精氣陰陽對于卵子的發(fā)育成熟起著重要的作用。卵泡是腎中所藏之“陰精”,腎陰是其生長發(fā)育的物質(zhì)基礎(chǔ),腎陽是其充盛排出的動力。腎中精氣充盛,腎陰濡潤卵泡使其不斷地生長發(fā)育至成熟,腎陽溫煦卵泡并鼓動推進其排卵,施泄為生殖之精。然先天不足、后天失養(yǎng)、房事不節(jié)、大病失養(yǎng)或經(jīng)產(chǎn)不慎等因素消耗腎中精氣。腎虛精虧,沖任虛衰,女性年未至七七而出現(xiàn)月水不行、胎孕不成,甚至早絕經(jīng)癥狀。

因此,中醫(yī)藥辨治DOR多在補腎填精的基礎(chǔ)上兼以辛溫祛寒、滋陰清熱,調(diào)補腎中陰陽,促進卵泡的生長發(fā)育和順利排出。陸海美等[22]崇“女子陰常不足”的理論,認為DOR系腎陰不足,天癸乏源所致,沖任氣血虧虛,則難以化生經(jīng)血,卵泡生長發(fā)育遲緩,而致月經(jīng)過少、稀發(fā)甚至閉經(jīng)。李善霞等[23]認為DOR的病機是腎陰涸乏、氣血虧虛,治宜補腎養(yǎng)陰、益氣養(yǎng)血,以左歸丸為基礎(chǔ)方加減治療本癥,可以顯著改善DOR患者腎陰虛的臨床癥狀和卵巢儲備功能,降低FSH和E2水平,增加竇卵泡數(shù)量,改善生育功能。王娜娜等[24]認為本病系腎中陽氣虧虛,下焦虛寒所致,無法溫煦沖任氣血,陽虛不能鼓動腎中精氣蒸騰氣化,影響卵母細胞的質(zhì)量,阻礙卵泡順利排出。江涵等[25]認為DOR的發(fā)生與腎陽不足、沖任衰少相關(guān),毓麟珠能補腎助陽益精,連續(xù)給藥6個月可以有效降低血清FSH和FSH/LH水平,提高E2水平,恢復(fù)患者的月經(jīng)周期。

3 中醫(yī)藥調(diào)節(jié)細胞自噬治療DOR的研究進展

近年來,許多學者將細胞自噬與中醫(yī)學相聯(lián)系,從不同的角度探究中醫(yī)藥干預(yù)對細胞自噬的調(diào)節(jié)作用和對疾病發(fā)生的影響。以細胞自噬調(diào)控卵泡發(fā)育為切入點,是目前探討中醫(yī)藥治療DOR的新的研究方向。孫曉彤[26]實驗證實:二仙湯溫腎陽、瀉腎火,通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因的表達干預(yù)GCs的自噬過程,進而有效減少環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的DOR模型大鼠的卵泡閉鎖,增加各級卵泡數(shù)量,并改善黃體發(fā)育。朱芳芳等[27]研究發(fā)現(xiàn):麒麟丸可以保護環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的DOR模型小鼠的卵巢儲備,抑制始基卵泡的過度激活,減少卵泡閉鎖,該藥補腎健脾,益氣養(yǎng)血,負向調(diào)節(jié)細胞的自噬水平,抑制卵巢內(nèi)細胞的過度自噬。孫曉峰等[28]探討左歸丸對磷酰胺氮芥(phosphoramide mustard,PM)誘導(dǎo)損傷的卵巢GCs影響及作用機制。實驗中發(fā)現(xiàn),大鼠卵巢GCs被30 μmol/L的PM干預(yù)后,GCs的自噬水平顯著升高,進而誘導(dǎo)GCs的凋亡,而10%左歸丸含藥血清可以通過抑制GCs自噬/溶酶體降解途徑,減輕GCs的凋亡。白俊等[29]研究雷公藤甲素(triptolide,TP)誘導(dǎo)卵巢GCs自噬所需的濃度、時間,結(jié)果顯示:濃度為100 nmol/L的TP作用GCs 8 h后產(chǎn)生自噬現(xiàn)象,作用12 h后成功誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。該過程是通過抑制PI3/AKT/m TOR信號通路調(diào)控自噬相關(guān)基因的表達實現(xiàn)的。復(fù)方新加歸腎丸可以通過激活 PI3K/AKT/m TOR 通路,下調(diào)自噬效應(yīng)分子Beclin1、 LC3 的表達并減少 p62 的消耗來修復(fù) TP導(dǎo)致的大鼠卵巢 GCs 的自噬損傷[30]?，F(xiàn)代藥理學研究也充分證實:杜仲總黃酮可能通過激活PI3K/AKT/mTOR通路參與卵巢組織細胞自噬,降低PCOS大鼠GCs的自噬水平,進而減少囊狀擴張卵泡,降低血清AMH、LH、T的水平,增加黃體,升高FSH水平[31]。淫羊藿素亦通過激活PI3K/Akt通路抑制PCOS大鼠GCs的凋亡和自噬,提高Gs的增殖率,細胞增殖活性與藥物濃度成正比[32]。

從腎論治DOR不僅可以使腎中精氣充盛,促進生殖功能的恢復(fù),還可以和調(diào)五臟氣血,從多系統(tǒng)、多靶點、多環(huán)節(jié)調(diào)節(jié)整體功能[33]。縱觀細胞自噬的功能活動,亦是通過細胞內(nèi)的物質(zhì)交換和自我更新實現(xiàn)機體陰陽氣血的平衡協(xié)調(diào),根據(jù)感邪輕重及屬性,治以扶正祛邪、調(diào)整陰陽。《素問·至真要大論》謂“客者除之,勞者溫之……損者溫之”,補腎填精有助于提高DOR患者腎-天癸-沖任-胞宮的生殖功能,改善卵巢儲備,以至“正勝邪退”。補腎的同時,亦應(yīng)注重調(diào)整機體陰陽的盛衰及氣血的失調(diào)?！爸敳礻庩査诙{(diào)之,以之平期”,從調(diào)補腎陰腎陽著手,陽生陰長,則腎精自足。調(diào)理氣血要明辨疾病在氣、在血、屬虛、屬實的不平衡狀態(tài),使氣血和順,沖任調(diào)達。

4 小 結(jié)

細胞自噬廣泛存在于真核細胞內(nèi),可以通過溶酶體途徑實現(xiàn)細胞內(nèi)的自我更新,對于卵泡的發(fā)育和閉鎖有著重要的作用。本文首次從中醫(yī)基礎(chǔ)理論釋意細胞自噬為出發(fā)點,探討細胞自噬與DOR發(fā)生發(fā)展的聯(lián)系。筆者認為自噬過程體現(xiàn)著精氣學說及陰陽學說的主要內(nèi)容,而且DOR的發(fā)生也存在著精氣陰陽的失調(diào)。然而,目前相關(guān)中醫(yī)藥通過調(diào)控細胞自噬治療DOR的作用機制和中醫(yī)檢測指標尚不完全明確,還缺乏清晰的臨床研究資料。因此,正確理解細胞自噬與中醫(yī)學的聯(lián)系,有利于開展中醫(yī)藥通過細胞自噬參與卵泡發(fā)育及卵巢儲備功能的調(diào)節(jié),對于中醫(yī)藥治療DOR提供新的研究方向。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。