溫壯飛,李發(fā)龍,蔡青桐,林 野,朱 彬,邰先韜

(1.海口市婦幼保健院兒童康復(fù)科,海南 ?？?570000;2.昆明中醫(yī)學(xué)院康復(fù)教研室,云南 昆明 650000)

腦癱(cerebral palsy,CP)是一種異質(zhì)性疾病,也是兒童殘疾常見(jiàn)的原因,具體表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)和姿勢(shì)發(fā)展的永久性障礙導(dǎo)致的活動(dòng)受限。CP是患兒在胎兒或嬰兒期大腦發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)的非進(jìn)行性腦損傷[1-3]。CP通常伴隨其他并發(fā)癥,如感覺(jué)、知覺(jué)、認(rèn)知、交流和行為障礙,以及癲癇和繼發(fā)性肌肉、骨骼等問(wèn)題。癲癇和CP之間存在著密切的關(guān)系。CP患兒中癲癇發(fā)生率為25%～45%,遠(yuǎn)高于新生兒中0.1%～0.3%的發(fā)病率[4-5]。腦癱共患癲癇(cerebral palsy and epilepsy,CPE)會(huì)顯著加重CP患兒的腦損傷。臨床上通常選用抗癲癇藥物或飲食方案(如生酮飲食)對(duì)CPE患兒進(jìn)行治療[6]。然而有研究表明,在使用抗癲癇藥物治療后,患兒出現(xiàn)了嚴(yán)重的認(rèn)知發(fā)育障礙,包括注意力[7]、記憶力[8]、語(yǔ)言功能障礙[9]等;生酮飲食則會(huì)因患兒個(gè)體差異而表現(xiàn)出不同的療效[10]。

腸道菌群(gut microbiota,GM)在人類健康中發(fā)揮著核心作用,其能夠刺激免疫系統(tǒng)并對(duì)潛在病原體表現(xiàn)出定植抗性。GM包含的基因是人類基因組的150倍[11],參與了多種酶促反應(yīng),產(chǎn)生了如維生素和短鏈脂肪酸類促進(jìn)健康的代謝物。近年來(lái),微生物-腸-腦軸的概念與研究在生物醫(yī)學(xué)界受到了極大的關(guān)注。GM與大腦可以通過(guò)中樞和腸道神經(jīng)系統(tǒng)及內(nèi)分泌、免疫、代謝途徑進(jìn)行雙向交流[12]。已有研究表明,GM會(huì)影響中樞神經(jīng)系統(tǒng),從而影響人的行為、認(rèn)知、情緒及焦慮和抑郁狀態(tài)。GM失調(diào)與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān),例如自閉癥[13]、多發(fā)性硬化癥[14]、帕金森病[15]和阿爾茨海默病[16]。GM為治療CPE提供了一條全新的思路[17]。

目前,雖然有GM治療各種單一神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究,但鮮見(jiàn)其在CPE患兒中的特征調(diào)查及深度研究。本文對(duì)27名CPE患兒和21名健康兒童進(jìn)行對(duì)照研究,探討CPE患兒的GM特征,以期提高對(duì)GM在CPE發(fā)病及進(jìn)展機(jī)制中作用的認(rèn)識(shí),并為CPE患兒的GM干預(yù)治療提供理論鋪墊。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

于2021年11月至2022年5月在?？谑袐D幼保健院招募27名3～18歲CPE患兒為實(shí)驗(yàn)組,選取同期在院進(jìn)行體檢后無(wú)任何異常的21名3～18歲健康兒童為對(duì)照組。

納入標(biāo)準(zhǔn):

實(shí)驗(yàn)組:①年齡為3～18歲;②根據(jù)《新診斷患兒癲癇的初始單藥治療專家共識(shí)》[18]和《國(guó)際專家建議:需立即轉(zhuǎn)診進(jìn)行腦性癱瘓?jiān)\斷評(píng)估的臨床特征》[19]診斷為CPE;③患兒有明確的CPE臨床表現(xiàn)。對(duì)照組:①年齡為3～18歲;②體檢后無(wú)任何異常。

排除標(biāo)準(zhǔn):

①有過(guò)敏史,如食物過(guò)敏、特應(yīng)性皮炎和哮喘;②有遺傳性疾病,如地中海貧血、遺傳性耳聾和苯丙酮尿癥;③有代謝性疾病,如肥胖癥、糖尿病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎;④在收集糞便樣本時(shí)的前2個(gè)月內(nèi)曾接觸過(guò)抗生素、益生菌或質(zhì)子泵抑制劑。

本文屬于橫斷面調(diào)查研究,經(jīng)?？谑袐D幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(注冊(cè)號(hào)為院[2021]01011)。所有入組兒童家屬均提供書(shū)面知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 樣本的采集和檢測(cè)

參考有關(guān)臨床指南[20],在臨床檢查中,使用樣本拭子收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兒童的新鮮糞便樣本,并將其保存在消毒管中;確保在30分鐘內(nèi)將糞便樣本轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱中進(jìn)行長(zhǎng)期儲(chǔ)存。嚴(yán)格按糞便DNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,從糞便樣本中分離DNA。

將DNA樣本送到廣東美格基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序,使用PCR擴(kuò)增試劑盒,用338F和806R引物擴(kuò)增16S rRNA的超變異V3～V4區(qū)域;然后,將PCR產(chǎn)物制備成測(cè)序文庫(kù),并由MiSeq平臺(tái)(Illumina,San Diego CA,U.S.A.)測(cè)序?yàn)?00(nt)配對(duì)端讀數(shù)。剩余的DNA和糞便樣本保存在-80℃的冰箱中。

1.2.2 測(cè)序注釋和質(zhì)控

參照有關(guān)參考文獻(xiàn)[21]的方法,按照以往描述對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾?；谥辽?0個(gè)堿基的重疊,過(guò)濾后樣品的reads進(jìn)行拼接,得到的拼接序列為原始Tag數(shù)據(jù)。經(jīng)過(guò)過(guò)濾去除低質(zhì)量和不符合長(zhǎng)度的Tag后得到高質(zhì)量的Tag數(shù)據(jù)(clean tags);并通過(guò)USEARCH(v7.0.1090)軟件將clean tags聚類為相似度97%的操作分類單位(operational taxonomic units,OTU)。通過(guò)將OTU的序列與核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)計(jì)劃(ribosomal database project,RDP)數(shù)據(jù)庫(kù)16S rRNA(trainset 16/release 11.5)進(jìn)行比對(duì),得到OTU的分類學(xué)位置。對(duì)所有樣本的GM組成進(jìn)行多元方差分析,以評(píng)估物理指標(biāo)的影響。應(yīng)用R語(yǔ)言中的vegan包進(jìn)行排列組合和歐氏距離檢測(cè)。

1.2.3 功能預(yù)測(cè)和富集

通過(guò)16S rRNA OTU分析,用PICRUST軟件在默認(rèn)設(shè)置下獲得GM的功能分布。對(duì)于每個(gè)樣本,通過(guò)京都基因與基因組百科全書(shū)數(shù)據(jù)庫(kù)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)的直系同源系統(tǒng)(the KEGG Orthology System,KO)計(jì)算微生物豐度,并檢測(cè)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)的富集功能類別。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組兒童的一般情況

本研究采集了27名CPE患兒和21名健康兒童的糞便樣本。在實(shí)驗(yàn)組27名CPE患兒中,痙攣型CP有21例(77.78%),不隨意運(yùn)動(dòng)型CP有5例(18.52%),共濟(jì)失調(diào)型CP有1例(3.70%)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組兒童的心率、收縮壓、舒張壓、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)比較差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。通常臨床認(rèn)為上述差異源于CPE患兒運(yùn)動(dòng)能力不足導(dǎo)致的體質(zhì)較弱,與GM關(guān)系不大,因此仍然具有比較意義。

表1 兩組兒童一般資料的比較

2.2 樣本特征和數(shù)據(jù)輸出情況

通過(guò)16S rRNA測(cè)序的讀數(shù)連接成2 187 113個(gè)Tag;實(shí)驗(yàn)組有135～1 057個(gè)OTU,平均為(543.37±265.49)個(gè);對(duì)照組有105～243個(gè)OTU,平均為(159.86±41.62)個(gè),實(shí)驗(yàn)組的OTU數(shù)量明顯高于對(duì)照組(t=6.542,P<0.001)。

經(jīng)過(guò)RDP數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),所有樣本中GM共有20個(gè)門中307個(gè)屬;實(shí)驗(yàn)組有48～248個(gè)屬,平均為(156.56±48.50)個(gè)屬;對(duì)照組有38～78個(gè)屬,平均為(54.38±9.09)個(gè)屬,實(shí)驗(yàn)組的GM屬數(shù)量明顯高于對(duì)照組(t=9.502,P<0.001)。

2.3 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組兒童GM的相關(guān)性

2.3.1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組兒童GM多樣性的分析

通過(guò)PCA分析結(jié)果的坐標(biāo)數(shù)值和原始變量顯示,兩組兒童的GM主要以擬桿菌屬(Bacteroides)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、普拉梭菌屬(Faecalibacterium)、副桿菌屬(Parabacteroides)為主;其中,實(shí)驗(yàn)組以Bacteroides、Bifidobacterium、Parabacteroides為主,對(duì)照組以Bacteroides、Prevotella、Faecalibacterium為主,見(jiàn)圖1A;通過(guò)計(jì)算香農(nóng)指數(shù)(Shannon index)判斷GM的多樣性,實(shí)驗(yàn)組的香農(nóng)指數(shù)(1.87±0.23)明顯高于對(duì)照組(1.29±0.31),兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.450,P<0.001),表明實(shí)驗(yàn)組微生物多樣性更高,見(jiàn)圖1B。

注:A圖為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組糞便樣本GM的PCA分析結(jié)果(PC1=34.27%,PC2=16.33%);B圖為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組GM多樣性分析結(jié)果。

2.3.2 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組兒童GM差異的分析

從實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組GM中各選取了前15個(gè)最豐富的屬,其中23個(gè)屬在兩組之間有不同程度的富集,見(jiàn)圖2A。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,含有較多Bifidobacterium、鏈球菌屬(Streptococcus)、阿克曼氏菌屬(Akkermansia)、腸球菌屬(Enterococcus)、Prevotella、韋榮氏球菌屬(Veillonella)、羅氏菌屬(Rothia)、梭菌屬Ⅳ(ClostridiumⅣ),而B(niǎo)acteroides、Faecalibacterium、布勞特氏菌屬(Blautia)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、羅斯氏菌屬(Roseburia)、厭氧棒桿菌屬(Anaerostipes)、副薩特氏菌屬(Parasutterella)明顯較少。

注:A圖為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組兒童GM差異富集情況;B圖為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組兒童GM共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組GM間不同的富集菌屬,構(gòu)建了GM共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò),見(jiàn)圖2B。通過(guò)Spearman相關(guān)性評(píng)估顯示,Bacteroides與乳桿菌屬(Lactobacillus)和Prevotella均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.627,P<0.05;r=-0.711,P<0.05),腸桿菌屬(Intestinibacter)與Bifidobacterium和Enterococcus均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.705,P<0.05;r=-0.713,P<0.05),而Streptococcus與放線菌屬(Actinomyces)(r=0.793,P<0.05)、Actinomyces與Veillonella(r=0.818,P<0.05)、Veillonella與葡萄球菌屬(Staphylococcus)(r=0.741,P<0.05)、Staphylococcus與鏈型桿菌屬(Catenibacterium)(r=0.697,P<0.05)均呈正相關(guān)。

2.4 GM功能的改變與菌群生態(tài)失調(diào)的關(guān)系

實(shí)驗(yàn)組兒童神經(jīng)退行性疾病風(fēng)險(xiǎn)的增加可能歸因于Streptococcus、Parabacteroides和Bacteroides。在對(duì)照組GM中,Faecalibacterium、Blautia與“神經(jīng)系統(tǒng)”相應(yīng)作用,但其在實(shí)驗(yàn)組中卻減少,在實(shí)驗(yàn)組GM中Streptococcus明顯富集。此外,實(shí)驗(yàn)組中豐富的Akkermansia和Streptococcus可能是導(dǎo)致免疫系統(tǒng)疾病風(fēng)險(xiǎn)增加的主要原因,因?yàn)槌苏{(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)外,Akkermansia和Streptococcus重點(diǎn)還參與了其宿主的大部分營(yíng)養(yǎng)代謝。

通過(guò)PICRUST軟件和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)照分析,結(jié)果顯示,從所有樣本中獲得了5 887個(gè)KOs,所有的途徑在KEGGⅡ級(jí)折疊成35個(gè)功能類別,其中22個(gè)在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間有不同程度的富集,見(jiàn)圖3。實(shí)驗(yàn)組富集的功能類別包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)通路和外源性物質(zhì)降解與代謝(xenobiotics biodegradation and metabolism)通路;與對(duì)照組相比,其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成(biosynthesis of other secondary metabolites)通路和神經(jīng)系統(tǒng)(nervous system)通路在實(shí)驗(yàn)組中有所減少。

注:上半部分熱圖為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組兒童GM中前10個(gè)屬對(duì)35個(gè)KEGGⅡ級(jí)功能類別的貢獻(xiàn),較深的綠色方塊表示該屬對(duì)功能類別的貢獻(xiàn)很重要,而較深的粉色方塊表示該屬對(duì)功能類別的貢獻(xiàn)較小;下半部分箱線圖為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的富集途徑,KEGGⅠ級(jí)功能類別中紫色表示細(xì)胞過(guò)程(cellular processes),綠色表示環(huán)境信息處理(environmental information processing),橙色表示遺傳信息處理(genetic information processing),粉色表示人類疾病(human diseases),藍(lán)綠色表示新陳代謝(metabolism),黃綠色表示生物體系統(tǒng)(organismal systems),黑色表示藥物開(kāi)發(fā)(drug development)。

3 討論

CPE患兒的CP和癲癇兩種疾病相互影響且關(guān)系密切,超過(guò)25%的CP患兒具有癲癇癥狀[23],而癲癇會(huì)加重CP患兒的運(yùn)動(dòng)和神經(jīng)損傷[24]。關(guān)于腸道-大腦軸的諸多研究表明,GM對(duì)各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病存在顯著的影響[25]。本研究重點(diǎn)探索了CPE患兒的GM特征及其在CPE發(fā)病機(jī)制中可能存在的潛在作用。

3.1 CPE患兒與健康兒童在GM結(jié)構(gòu)方面的差異分析

本研究顯示,與對(duì)照組的健康兒童相比,CPE患兒表現(xiàn)出較低比例的Faecalibacterium和Bacteroides。Joseph等[26]研究顯示,Faecalibacterium可以用乙酸鹽生產(chǎn)丁酸鹽,而丁酸鹽可以刺激調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞的分化,緩解神經(jīng)炎癥的負(fù)擔(dān)。然而,大量的乙酸鹽會(huì)在丁酸弧菌屬(Butyricimonas)和Faecalibacterium豐度低的CPE患兒中積累,這可能會(huì)激活副交感神經(jīng)系統(tǒng)并引發(fā)癲癇發(fā)作。此外,Faecalibacterium的減少也會(huì)減少丁酸鹽的分泌,減弱其對(duì)CPE患兒的神經(jīng)保護(hù)作用。本研究在實(shí)驗(yàn)組患兒體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了較多的Enterococcus、Bifidobacterium、ClostridiumⅣ和Akkermansia的含量。Enterococcus可以刺激絨毛膜細(xì)胞產(chǎn)生5-羥色胺,通過(guò)神經(jīng)調(diào)節(jié)改善自閉癥行為。盡管Bifidobacterium因其執(zhí)行上皮屏障的能力而被認(rèn)為是一種有益的微生物,但其較高的豐度也表明患兒的微生物群尚未成熟。此外,ClostridiumⅣ的豐度較高,其作為一種潛在的致病菌,會(huì)加重CPE患兒的腸道微環(huán)境失調(diào),出現(xiàn)腹痛腹瀉的情況[27]。本研究顯示,隨著非主導(dǎo)菌屬的增加,CPE患兒的GM表現(xiàn)出比健康兒童更高的微生物多樣性。由于GM內(nèi)部存在復(fù)雜的競(jìng)爭(zhēng)和協(xié)同關(guān)系,本研究進(jìn)一步構(gòu)建了菌屬共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò),以加深對(duì)CPE患兒GM特征的進(jìn)一步了解。

3.2 CPE患兒GM功能的改變與其失調(diào)的相關(guān)分析

本研究中共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)顯示,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組多種菌屬之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。這些拮抗關(guān)系表明,具有穩(wěn)定GM的健康個(gè)體體內(nèi),Bacteroides的優(yōu)勢(shì)將抑制Bifidobacterium和Lactobacillu的過(guò)度生長(zhǎng)?？赡苡捎谄涓叨鹊亩鄻有院拓S度,Bacteroides參與了多種代謝途徑,包括氨基酸代謝、能量代謝和脂質(zhì)代謝,其豐度也反映出Bacteroides可以適應(yīng)成人的多樣化飲食,并為宿主及其他腸道共生動(dòng)物提供能量和底物。

本研究對(duì)GM功能的進(jìn)一步分析顯示,實(shí)驗(yàn)組患兒的免疫系統(tǒng)疾病和神經(jīng)退行性疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加,神經(jīng)炎癥可能在實(shí)驗(yàn)組的病理中起關(guān)鍵作用。免疫系統(tǒng)疾病風(fēng)險(xiǎn)的升高主要?dú)w因于實(shí)驗(yàn)組患兒Akkermansia比例較高。據(jù)以往研究顯示,Akkermansia的過(guò)度生長(zhǎng)會(huì)降解黏膜層中的黏蛋白,增加黏膜的通透性,這使得更多的細(xì)菌抗原暴露在宿主的免疫系統(tǒng)中,引發(fā)CPE患兒的系統(tǒng)免疫反應(yīng)[28]。此外,Streptococcus的增長(zhǎng)會(huì)提高白介素(IL)-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α的水平,并通過(guò)誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥誘發(fā)神經(jīng)退行性疾病。結(jié)合菌屬之間的共存關(guān)系,推測(cè)成熟穩(wěn)定的GM對(duì)患兒神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育至關(guān)重要。因此,CPE患兒的臨床癥狀可能會(huì)通過(guò)GM的干預(yù)得到緩解。本研究中通過(guò)PICRUST軟件和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的對(duì)照分析顯示,從所有樣本中獲得了5 887個(gè)KOs;所有的途徑在KEGGⅡ級(jí)折疊成35個(gè)功能類別,其中22個(gè)在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間有不同程度的富集。實(shí)驗(yàn)組富集功能類別的表現(xiàn)與免疫系統(tǒng)疾病通路和神經(jīng)退行性疾病通路的風(fēng)險(xiǎn)增加相一致。

有研究表明,GM與各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病,如孤獨(dú)癥譜系障礙(autism spectrum disorders,ASD)、帕金森病、阿爾茨海默病等的發(fā)病及進(jìn)展存在密切關(guān)系[29]。GM通過(guò)分泌次級(jí)代謝物進(jìn)入血液循環(huán),可以刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng),進(jìn)而影響宿主的壓力、認(rèn)知和情緒[30]。Vacca等[31]和De Angelis等[32]研究顯示,ASD患兒中梭狀芽孢桿菌屬(Clostridiumsp.)可能會(huì)壓制腸鉻素細(xì)胞的激活和5-羥色胺的分泌;此外,在神經(jīng)退行性疾病患兒的GM中發(fā)現(xiàn)Prevotella減少、Lactobacillus增加,這與神經(jīng)炎癥有關(guān)。另有研究顯示,在癲癇患兒中發(fā)現(xiàn)了變形桿菌(Proteobacteria)和克羅諾桿菌(Cronobacter)的增加,證實(shí)了GM在控制癲癇發(fā)作中的作用[33]。

目前本研究的一個(gè)局限是入組例數(shù)有限,如果提高入組患兒的數(shù)量并進(jìn)一步開(kāi)展癲癇患兒與健康兒童GM的比較,可深入探討GM在CPE發(fā)病機(jī)制中的作用,這將提高對(duì)腸道-大腦軸的理解。在后續(xù)的研究中,將重點(diǎn)進(jìn)行大隊(duì)列研究以驗(yàn)證目前的發(fā)現(xiàn),并且探索實(shí)驗(yàn)組患兒腸道代謝物的改變情況及其與微生物群的關(guān)系,以及CPE患兒治療后的臨床改善狀況。

綜上所述,本研究介紹了CPE患兒的GM特征,說(shuō)明了GM內(nèi)菌屬的關(guān)系,并檢測(cè)了CPE患兒GM的功能分布。這些研究結(jié)果提示了GM在CPE發(fā)病機(jī)制中的作用,并為CPE治療中的菌屬靶標(biāo)輔助干預(yù)提供了數(shù)據(jù)參考和理論支持。