杜海旭,洪春霞,喻 彤

杜海旭,洪春霞,喻彤,浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金華醫(yī)院藥學(xué)部 浙江省金華市 321000

0 引言

結(jié)直腸癌早期癥狀較為隱匿導(dǎo)致其確診時(shí)已處于晚期(相當(dāng)一部分病人確診時(shí)已屬進(jìn)展期).臨床常采用化療進(jìn)行治療,對(duì)于化療約有50%患者存在原發(fā)性耐藥,且治療難度較大[1,2].目前臨床常采用的奧沙利鉑聯(lián)合卡培他濱聯(lián)合治療晚期結(jié)直腸癌,雖一定程度上可殺傷腫瘤細(xì)胞、淋巴免疫細(xì)胞,但也會(huì)損害機(jī)體免疫功能[3,4].因而尋找新型干預(yù)方案成為臨床研究重點(diǎn).卡瑞利珠單抗屬于程序性細(xì)胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1,PD-1)單克隆抗體,可靶向結(jié)合T細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞,阻斷其與癌細(xì)胞之間的相互作用,抑制PD-1介導(dǎo)的T細(xì)胞免疫抑制作用,進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用[5].PD-1/程序性死亡配體1(programmed death ligand 1,PD-L1)信號(hào)通路可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視[6].目前卡瑞利珠單抗調(diào)節(jié)晚期結(jié)直腸癌患者免疫功能的作用機(jī)制尚未完全明確,基于此,本研究主要探討注射用卡瑞利珠單抗對(duì)PD-1/PD-L1信號(hào)通路的調(diào)控作用,分析其對(duì)營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)指標(biāo)、腫瘤標(biāo)志物及生存狀況的影響,為臨床治療提供科學(xué)指導(dǎo).

1 材料和方法

1.1 材料 采用前瞻性隨機(jī)對(duì)照組研究,選取2019-01/2021-10本院收治的127例晚期結(jié)直腸癌患者為研究對(duì)象,采用電腦隨機(jī)數(shù)字法分為對(duì)照組63例、研究組64例.對(duì)照組: 男44例、女19例,年齡54-63(58.64±1.36)歲,體質(zhì)量指數(shù)(身體質(zhì)量指數(shù))21-24(22.28±0.28) kg/m2,原發(fā)部位: 左半結(jié)直腸25例、右半結(jié)直腸38例;病理分化程度: 低分化27例、中分化26例、高分化10例.研究組:男46例、女18例,年齡54-64(59.01±1.45)歲,體質(zhì)量指數(shù)20-24(22.19±0.42) kg/m2,原發(fā)部位: 左半結(jié)直腸28例、右半結(jié)直腸36例;病理分化程度: 低分化32例、中分化21例、高分化11例.兩組臨床資料均衡可比(P>0.05).本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn).

納入標(biāo)準(zhǔn): 符合結(jié)直腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[7],初診者且經(jīng)病理檢查確診;TNM分期為Ⅳ期[8];初診者;既往接受奧沙利鉑聯(lián)合卡培他濱化療方案+西妥昔單抗;存在MSI-H;Karnofsky功能狀態(tài)評(píng)分≥70分;預(yù)期生存時(shí)間≥6 mo;鄰近組織器官無(wú)受累;體能狀態(tài)量表(ECOG)體質(zhì)狀況評(píng)分為0-1分;心電圖無(wú)明顯異常;簽署知情同意書(shū).排除標(biāo)準(zhǔn): 合并血液循環(huán)系統(tǒng)功能障礙者;合并嚴(yán)重感染性疾病、自身免疫性疾病者;既往接受抗PD-1/PD-L1單抗治療;既往遺傳性或獲得性出血病史者;需長(zhǎng)期服用皮質(zhì)類(lèi)激素治療者;伴有胃腸道出血、胸腔積液者.

1.2 方法 對(duì)照組予以?shī)W沙利鉑(哈藥集團(tuán)生物工程有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H20133094)+卡培他濱(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H20133365)治療: 第1 d靜脈滴注奧沙利鉑130 mg/m2,于2 h內(nèi)滴注完畢;第1-14 d口服卡培他濱1000 mg/m2,2次/d,以3 wk為1個(gè)周期,共治療4個(gè)周期[9].研究組予以?shī)W沙利鉑+卡培他濱+注射用卡瑞利珠單抗(蘇州盛迪亞生物醫(yī)藥有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字S20190027)治療.注射用卡瑞利珠單抗200 mg/次,首次間隔4 wk后,隨后每2 wk給藥1次,以3 wk為1個(gè)周期,共治療4個(gè)周期,奧沙利鉑+卡培他濱治療方案同對(duì)照組.治療4個(gè)周期結(jié)束后,兩組均采用注射用卡瑞利珠單抗維持治療,直至疾病進(jìn)展或出現(xiàn)不可耐受毒性.

1.3 主要觀(guān)察指標(biāo)

1.3.1 臨床療效[10]: 治療4個(gè)周期后評(píng)價(jià)療效,完全緩解(complete slow release,CR): 靶病灶消失、無(wú)新靶病灶出現(xiàn),維持時(shí)間≥4 wk;部分緩解(partial remission,PR): 靶病灶最大徑之和減少≥30%,維持時(shí)間≥4 wk;疾病穩(wěn)定(disease stability,SD): 靶病灶最大徑之和減少<30%或增加<20%;疾病進(jìn)展(disease progression,PD): 不符合上述標(biāo)準(zhǔn);疾病控制率(disease control rate,DCR)為CR、PR、SD比例之和.客觀(guān)緩解率(objective remission rate,ORR)為CR、PR比例之和.以DCR作為療效判定依據(jù).

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)血清PD-1、PD-L1 mRNA表達(dá)水平: 采集治療前、治療4個(gè)周期后兩組研究對(duì)象外肘靜脈血5 mL,采用淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞,參照Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)提取細(xì)胞總RNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京天根生化公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,采用SYBR Green染料法進(jìn)行定量(北京天根生化公司),以GAPDH為內(nèi)參,使用StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)檢測(cè)PD-1、PD-L1 mRNA表達(dá)水平.PD-1正向引物5’-ATCTCACCGCTCGTTTCCT-3’,反向引物5’-CACTGCAAACCT CGGTGATG-3’;PD-L1正向引物5’-GGTAATCCGTTTCCCTTGA-3’,反向引物5’-CCTAAT TTATGAGCCTATC-3’;GAPDH正向引物5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAA T-3’,反向引物5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’,引物購(gòu)自上海生工公司.

1.3.3 免疫組化法檢測(cè)PD-1、PD-L1蛋白水平: 采用活檢技術(shù)取癌組織標(biāo)本并制備石蠟切片,脫水后在檸檬酸鹽溶液中20 min,滴加3%過(guò)氧化氫溶液后反應(yīng)25 min(37 ℃),滴加山羊血清反應(yīng)15 min,分別加入PD-1(稀釋比1:150)、PD-L1一抗(稀釋比1:200),4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜,加入二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG,37 ℃下反應(yīng)2 h,滴加DAB顯色液,清洗后采用蘇木素復(fù)染,滴加二甲苯進(jìn)行透明處理,用中性樹(shù)脂進(jìn)行封片,顯微鏡下觀(guān)察陽(yáng)性細(xì)胞(棕色圓圈狀),采用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件分析陽(yáng)性部位,采用光密度值作為蛋白表達(dá)水平,所有抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司.

1.4 次要觀(guān)察指標(biāo)

1.4.1 比較兩組治療前后營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)指標(biāo): 分別于治療前、治療4個(gè)周期后采集兩組研究對(duì)象空腹靜脈血10 mL,分為2份(5 mL/份),3300 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min分離上清液,采用酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked immunoassay,ELISA)檢測(cè)血清白蛋白(albumin,ALB)、血紅蛋白(hemoglobin,HGB)、前白蛋白(prealbumin,PA)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin,TF)水平,美國(guó)Epitope Diagnostics公司提供檢測(cè)試劑盒.主觀(guān)全面評(píng)定量表(patient-generated subjective global assessment,PG-SGA)包括自評(píng)內(nèi)容(0-5分)、醫(yī)療測(cè)評(píng)(0-9分),分值與營(yíng)養(yǎng)狀況呈負(fù)相關(guān)[11].

1.4.2 比較兩組治療前后腫瘤標(biāo)志物水平: 采用化學(xué)發(fā)光免疫法檢測(cè)兩組治療前、治療4個(gè)周期后血清糖類(lèi)抗原125(carbohydrate antigen 125,CA125)、糖類(lèi)抗原242(carbohydrate antigen 242,CA242)、胸苷激酶1(thymidine kinase 1,TK1)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)水平(上海酶聯(lián)生物).

1.4.3 比較兩組治療后毒副反應(yīng): 比較兩組治療毒副反應(yīng)[12],依據(jù)毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)毒副反應(yīng),分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí),級(jí)別與毒副反應(yīng)嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[13].

1.4.4 比較兩組生存情況: 兩組治療結(jié)束后均接受為期1年門(mén)診或電話(huà)隨訪(fǎng),統(tǒng)計(jì)兩組生存情況.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料采用(mean±SD)表示,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用n(%)表示,采用χ2檢驗(yàn);采用Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)進(jìn)行生存分析,組間比較采用Log-rank檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 兩組療效 治療4個(gè)周期后,研究組DCR高于對(duì)照組(P<0.05).見(jiàn)表1.

表1 兩組療效比較n(%)

2.2 兩組PD-1/PD-L1信號(hào)通路(PD-1/PD-L1 mRNA及蛋白表達(dá)情況) 治療前兩組PD-1/PD-L1信號(hào)通路比較mRNA及蛋白表達(dá)情況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;治療4個(gè)周期后研究組PD-1、PD-L1 mRNA和蛋白均低于對(duì)照組(P<0.05).見(jiàn)表2.

表2 兩組PD-1/PD-L1信號(hào)通路(PD-1/PD-L1 mRNA及蛋白表達(dá)情況)比較

2.3 兩組營(yíng)養(yǎng)狀態(tài) 治療4個(gè)周期后研究組血清ALB、TF、PA水平及PG-SGA評(píng)分高于對(duì)照組(P<0.05).見(jiàn)表3.

表3 兩組營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)

2.4 兩組腫瘤標(biāo)志物 治療4個(gè)周期后研究組血清CA125、CA242、TK1、CEA均低于對(duì)照組(P<0.05).見(jiàn)表4.

表4 兩組腫瘤標(biāo)志物

2.5 兩組毒副反應(yīng) 兩組毒副反應(yīng)發(fā)生率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.見(jiàn)表5.

表5 兩組毒副反應(yīng)

2.6 兩組生存率 兩組均接受為期1年門(mén)診或電話(huà)隨訪(fǎng),研究組和對(duì)照組分別失訪(fǎng)4例、3例,生存率分別為90.00%(54/60)、86.67%(52/60),組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.323,P=0.570).見(jiàn)圖1.

圖1 兩組生存情況.

3 討論

結(jié)直腸癌發(fā)生機(jī)制可能與機(jī)體免疫功能失調(diào)有關(guān),化療可殺傷腫瘤細(xì)胞,還可殺傷淋巴細(xì)胞,以此降低機(jī)體免疫功能,而免疫系統(tǒng)的狀況與治療獲益、預(yù)后密切相關(guān)[14,15].

奧沙利鉑可促使烷化結(jié)合物生成,破壞DNA復(fù)制過(guò)程,引起DNA損傷,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,進(jìn)而殺滅腫瘤細(xì)胞,并可刺激T細(xì)胞產(chǎn)生,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞免疫原性表達(dá);卡培他濱可干擾蛋白質(zhì)合成,抑制細(xì)胞分化,增強(qiáng)T細(xì)胞,但單藥化療存在較大局限性[16,17].卡瑞利珠單抗可進(jìn)腫瘤組織微環(huán)境、抗腫瘤效應(yīng)改善,并可增強(qiáng)對(duì)PD-1/PD-L1抑制劑的免疫應(yīng)答,調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能[18-20].但關(guān)于其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究.本研究結(jié)果顯示,治療4個(gè)周期后研究組DCR高于對(duì)照組,提示在奧沙利鉑+卡培他濱基礎(chǔ)上聯(lián)合注射用卡瑞利珠單抗,可提高臨床療效.分析原因?yàn)閵W沙利鉑、卡培他濱可誘導(dǎo)免疫原性細(xì)胞凋亡,卡瑞利珠單抗可通過(guò)調(diào)節(jié)免疫機(jī)制,抑制腫瘤生長(zhǎng),增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫功能,聯(lián)合應(yīng)用可發(fā)揮協(xié)同增效作用.PD-1、PD-L1在腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá),可降低機(jī)體免疫應(yīng)答,激活T細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答,阻斷腫瘤細(xì)胞免疫逃逸,抑制PD-1可提高化療敏感性[21,22].PD-1、PD-L1可降低T淋巴細(xì)胞免疫殺傷功能,降低機(jī)體免疫水平,促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和侵襲,可能作為抗腫瘤免疫應(yīng)答的潛在機(jī)制[23,24].本研究結(jié)果顯示,研究組治療4個(gè)周期后PD-1、PD-L1 mRNA和蛋白均低于對(duì)照組,提示奧沙利鉑+卡培他濱+注射用卡瑞利珠單抗聯(lián)合治療可能通過(guò)抑制PD-1/PD-L1信號(hào)通路活化,改善機(jī)體免疫功能.由此推測(cè)卡瑞利珠單抗可作用于PD-1/PD-L1信號(hào)通路,啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞免疫監(jiān)視,維持T細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡、免疫微環(huán)境穩(wěn)態(tài),恢復(fù)免疫細(xì)胞抗腫瘤作用,減弱結(jié)直腸癌免疫逃逸,抑制癌細(xì)胞增殖,增強(qiáng)淋巴細(xì)胞免疫活性,進(jìn)而提高免疫功能.

晚期結(jié)直腸癌患者惡病質(zhì)消耗、胃腸功能減退,可引起營(yíng)養(yǎng)不良,而ALB、TF、PA水平及PG-SGA評(píng)分屬于營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)指標(biāo),且與免疫功能密切相關(guān)[25,26].本研究結(jié)果顯示,研究組治療4個(gè)周期后血清ALB、TF、PA水平及PG-SGA評(píng)分高于對(duì)照組,提示卡瑞利珠單抗對(duì)機(jī)體營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的影響較小.分析其可能為奧沙利鉑+卡培他濱治療后各指標(biāo)較治療前變化更為異常,加用注射用卡瑞利珠單抗可調(diào)節(jié)腸道功能,促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收,減弱化療藥物對(duì)機(jī)體營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的不利作用.CA125、CA242、TK1、CEA屬于腫瘤標(biāo)志物,其在結(jié)直腸癌中呈高表達(dá),且與腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)[27-29].本研究結(jié)果顯示,研究組治療4個(gè)周期后血清CA125、CA242、TK1、CEA水平低于對(duì)照組,提示卡瑞利珠單抗聯(lián)合奧沙利鉑+卡培他濱協(xié)同抗腫瘤作用更顯著,可減少腫瘤負(fù)荷,因而治療后腫瘤標(biāo)志物水平下降程度更為明顯.既往研究顯示卡瑞利珠單抗治療后可能發(fā)生不良反應(yīng),但大部分具有可逆性[30].本研究分析不同治療方案安全性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組毒副反應(yīng)發(fā)生率、生存率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示在奧沙利鉑+卡培他濱基礎(chǔ)上,加用卡瑞利珠單抗治療后,生存率并未提高,不良反應(yīng)并未增加,這可能與本研究納入樣本量較少有關(guān).

4 結(jié)論

綜上所述,注射用卡瑞利珠單抗聯(lián)合奧沙利鉑、卡培他濱治療晚期結(jié)直腸癌近期臨床療效確切,可能通過(guò)與抑制PD-1/PD-L1信號(hào)通路活化,減小化療藥物對(duì)營(yíng).

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

晚期結(jié)直腸癌是常見(jiàn)癌癥,化療是一線(xiàn)治療方案,但會(huì)對(duì)患者免疫功能造成不良影響.卡瑞利珠單抗是程序性死亡受體1(programmed cell death protein 1,PD-1)抑制劑中的一種,其聯(lián)合化療的方案是目前新型治療方案之一.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

關(guān)于聯(lián)合卡瑞利珠單抗治療是否能通過(guò)調(diào)節(jié)通路改善晚期結(jié)直腸患者的治療效果及身體狀態(tài)的研究報(bào)道較少.本研究結(jié)果有助于為卡瑞利珠單抗治療方案的選擇提供數(shù)據(jù)支持.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

證實(shí)卡瑞利珠單抗可通過(guò)調(diào)控PD-1/程序性死亡配體1(programmed death ligand 1,PD-L1)通路影響機(jī)體免疫功能,進(jìn)而對(duì)患者病情及身體狀態(tài)產(chǎn)生積極影響,以期為卡瑞利珠單抗的臨床應(yīng)用提出理論依據(jù).

實(shí)驗(yàn)方法

本研究區(qū)以本院收治的127例晚期結(jié)直腸癌患者為研究對(duì)象,通過(guò)觀(guān)察并記錄治療前、治療后患者病灶改善情況、毒副反應(yīng)、全面評(píng)定量表評(píng)分,并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定PD-1、PD-L1 mRNA表達(dá)水平,采用免疫組化法檢測(cè)PD-1、PD-L1蛋白水平,采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清白蛋白、血紅蛋白、前白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白水平,采用化學(xué)發(fā)光免疫法檢測(cè)糖類(lèi)抗原125、糖類(lèi)抗原242、胸苷激酶、癌胚抗原水平,同時(shí)門(mén)診或電話(huà)隨訪(fǎng)1年,證實(shí)化療聯(lián)合卡瑞利珠單抗的應(yīng)用效果.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)卡瑞利珠單抗聯(lián)合化療治療后,患者腫瘤標(biāo)志物水平得以降低,營(yíng)養(yǎng)水平得以提升,生理狀態(tài)得以改善.明確卡瑞利珠單抗聯(lián)合化療方案的良好治療效果.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

本研究證實(shí)了聯(lián)合卡瑞利珠單抗治療可提升疾病控制率,闡明了卡瑞利珠單抗可通過(guò)影響PD-1/PD-L1通路發(fā)揮改善機(jī)體免疫及影響狀態(tài)的作用.

展望前景

未來(lái)還需開(kāi)展大樣本量研究,并進(jìn)行長(zhǎng)期乃至終生隨訪(fǎng)機(jī)制明確聯(lián)合治療的遠(yuǎn)期療效,觀(guān)察該方案是否能顯著延長(zhǎng)患者生活期限、改善生活質(zhì)量.此外,今后可繼續(xù)開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)深入探究免疫功能與毒副反應(yīng)及癌細(xì)胞增殖的具體調(diào)控機(jī)制.