陳芬蘭 程計(jì)林 林文 陳麗萍

作者單位：350300 福建醫(yī)科大學(xué)附屬福清市醫(yī)院感染科(陳芬蘭,林文);復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心消化科(程計(jì)林,陳麗萍);上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院消化科(陳麗萍)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的慢性感染可導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化,甚至肝癌的發(fā)生。共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)在肝臟細(xì)胞內(nèi)的持續(xù)存在是HBV難以清除進(jìn)而持續(xù)性感染的主要原因。另外,作為最關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制中間體,HBV cccDNA的存在和轉(zhuǎn)錄活性也是評價(jià)抗病毒治療效果最直接有效的指標(biāo)。但是,檢測cccDNA需要通過肝穿刺活組織檢查,在臨床實(shí)踐中不便廣泛開展,進(jìn)一步探究可以代替的血清學(xué)指標(biāo)尤為關(guān)鍵。前基因組RNA(pregenomic RNA,pgRNA)作為cccDNA的直接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,可以反映cccDNA轉(zhuǎn)錄活性,同時(shí)它作為病毒逆轉(zhuǎn)錄的模板,是目前唯一一種可以在外周血中檢測出來的HBV RNA。眾多研究表明[1-3],即使在HBV DNA低于檢測下限、甚至乙肝表面抗原(HBsAg)轉(zhuǎn)陰后的HBV感染者血清中HBV RNA仍存在。因此,相較于HBV DNA等指標(biāo),HBV RNA在評估抗乙肝病毒療效、選擇停藥時(shí)機(jī)及預(yù)測停藥后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)等方面均具有較高的臨床價(jià)值。近年來,不同于以血清HBsAg丟失為特征的“功能性治療”[4],基于血清HBV RNA的持續(xù)丟失與cccDNA的消除或轉(zhuǎn)錄沉默相關(guān)的“超功能治療”得到越來越多的關(guān)注[5]?，F(xiàn)就目前HBV RNA與臨床指標(biāo)相關(guān)性、評估抗病毒療效、指導(dǎo)臨床用藥等相關(guān)研究進(jìn)展作一綜述。

一、HBV的復(fù)制機(jī)制及血清HBV RNA的來源

HBV侵入正常肝臟細(xì)胞后脫去核衣殼成為松弛環(huán)狀雙鏈DNA(relaxed circular DNA,rcDNA),rcDNA進(jìn)入肝細(xì)胞核后,在DNA聚合酶作用下填補(bǔ)缺口,進(jìn)行扭轉(zhuǎn)、折疊等過程,成為具有超螺旋結(jié)構(gòu)的HBV cccDNA;接著以HBV cccDNA為模板,分別轉(zhuǎn)錄出0.7、2.1、2.4、3.5kb四種不同長度的mRNA,再合成多種病毒蛋白。其中3.5kb的RNA有兩種表達(dá)模式[6],一種為可編碼乙肝e抗原(HBeAg)相關(guān)蛋白的pre-CmRNA,另一種即為逆轉(zhuǎn)錄模板的pgRNA。pgRNA主要有兩個(gè)去處:一部分可利用逆轉(zhuǎn)錄酶再逆轉(zhuǎn)錄合成rcDNA中的負(fù)鏈,后者在DNA聚合酶(P蛋白,也是由pgRNA翻譯而成)引導(dǎo)下合成正鏈DNA,然后正、負(fù)鏈DNA重新組合成為新的HBV rcDNA。新合成的HBV rcDNA可以再次進(jìn)入肝細(xì)胞核轉(zhuǎn)化成為新的HBV cccDNA,還可以與病毒蛋白重新組裝后釋放到肝細(xì)胞外,成為有完整病毒顆粒的HBV DNA,再感染新的正常肝細(xì)胞。另一部分pgRNA經(jīng)過衣殼組裝和病毒包膜蛋白包被釋放入血,研究已證實(shí)有包膜的血清HBV RNA主要由pgRNA組成[1, 2, 7],表達(dá)于HBV相關(guān)性肝病患者的血清中,故常規(guī)提及的血清HBV RNA實(shí)際上指的就是血清中的pgRNA,作為直接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及逆轉(zhuǎn)錄的模板的新型血清學(xué)標(biāo)志物,pgRNA特殊性被日益重視。

二、與臨床指標(biāo)的相關(guān)性

Wang等[1]認(rèn)為血清HBV pgRNA與轉(zhuǎn)氨酶、血清HBV DNA、HBsAg、乙型肝炎核心相關(guān)抗原(HBcrAg)有一定相關(guān)性,但其相關(guān)性受HBeAg狀態(tài)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平的影響;Gu等[8]發(fā)現(xiàn),與ALT正?；颊?≤40 IU/mL)相比,ALT升高(>40 IU/mL)患者血清HBV pgRNA水平明顯升高。

Butler等[9]發(fā)現(xiàn)在對慢乙肝患者進(jìn)行核苷(酸)類似物(NA(s))治療期間,血清中HBV DNA與pgRNA水平關(guān)聯(lián)性低,血清pgRNA濃度普遍高于HBV DNA濃度;而沒有應(yīng)用NA(s)治療時(shí),HBV DNA與pgRNA水平相關(guān)性高,血清pgRNA濃度大約比HBV DNA低2logIU/mL。

Chan等[10]的研究發(fā)現(xiàn),HBsAg<100 IU/mL的患者血清HBV pgRNA檢出率低,Huang等[11]認(rèn)為在HBeAg(+)患者中,血清HBV pgRNA與HBsAg呈正相關(guān),而在HBeAg(-)患者中血清HBV pgRNA與HBsAg無相關(guān)性。然而,另一項(xiàng)來自北美的隊(duì)列研究[12]發(fā)現(xiàn)未治療的慢乙肝患者中,無論是HBeAg(+)或是HBeAg(-),HBV RNA 與HBcrAg、HBV DNA呈中度相關(guān)聯(lián),并且在HBeAg(-)患者中,HBV RNA、HBcrAg與ALT、肝纖維化指標(biāo)水平呈高度正相關(guān)。

有研究發(fā)現(xiàn)[13],經(jīng)過 3 年的抗病毒治療后,即使血清 HBV DNA 保持陰性,但分別有近1/3的患者血清可檢測到HBcrAg和 HBV RNA,甚至在HBV DNA、HBsAg均為陰性時(shí),患者血清HBV pgRNA均存在陽性[5]。Wang等[1]的研究還發(fā)現(xiàn),血清HBcrAg水平是HBV pgRNA低于檢測下限的獨(dú)立預(yù)測因子,最佳截?cái)嘀禐?.6log10U/mL。Wang等[14]的研究發(fā)現(xiàn),基線時(shí)肝內(nèi)cccDNA和血清中RNA水平呈正相關(guān),但是NA(s)治療48周發(fā)生HBeAg轉(zhuǎn)換后,血清中RNA與cccDNA水平再無相關(guān)性,這可能與NA(s)的作用機(jī)制相關(guān),抗病毒后干擾了HBV正常生命周期所導(dǎo)致。

三、評估抗病毒藥物療效及血清學(xué)轉(zhuǎn)換

抗HBV治療過程中,常規(guī)說來血清HBV DNA水平的下降代表了病毒被有效抑制,DNA水平很快下降至低于檢測下限即實(shí)現(xiàn)了病毒學(xué)應(yīng)答,但DNA水平無法準(zhǔn)確反應(yīng)HBV cccDNA狀態(tài)。有觀點(diǎn)認(rèn)為,NA(s)治療可降低HBV DNA,但是HBV RNA卻升高[15];然而,也有觀點(diǎn)認(rèn)為,NA(s)也可以降低血清HBV RNA[16],只不過RNA下降較DNA慢[14]。所以對于評估抗病毒藥物療效,結(jié)合血清HBV RNA的測定具有更好的指導(dǎo)作用[17]。慢乙肝患者經(jīng)長期NA(s)抗病毒治療后的血清學(xué)抗原狀態(tài)可能與血清HBV pgRNA的存在及表達(dá)量有關(guān),HBV pgRNA的持續(xù)存在可能是導(dǎo)致HBsAg持續(xù)高水平及HBeAg血清轉(zhuǎn)換率低的原因。Chan等[10]發(fā)現(xiàn)HBsAg<100 IU/mL且HBeAg發(fā)生血清學(xué)轉(zhuǎn)換的患者,其血清HBV pgRNA檢出率很低,表明這類患者肝內(nèi)HBV cccDNA轉(zhuǎn)錄活性處于抑制狀態(tài),因此這部分人群是實(shí)現(xiàn)HBV功能性治愈的最佳優(yōu)勢人群。Luo等[18]的研究表明,慢乙肝患者在NA(s)治療前血清HBV RNA水平低于4.12log10copies/mL時(shí),可實(shí)現(xiàn)HBeAg血清轉(zhuǎn)化,且HBV pgRNA的高載量與實(shí)現(xiàn)HBeAg清除失敗的高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān),NA(s)治療48周后HBV pgRNA仍為陽性的患者,HBeAg轉(zhuǎn)陰失敗的概率高,這些患者需要更長的時(shí)間實(shí)現(xiàn)HBeAg轉(zhuǎn)陰及HBV DNA轉(zhuǎn)陰[18]。Van等[19]研究發(fā)現(xiàn),在抗病毒治療后出現(xiàn)血清HBeAg陰轉(zhuǎn)的患者中,血清HBV RNA水平在治療的第12周、24周均下降明顯,且相比于HBV DNA、HBsAg等標(biāo)志物變化,治療后第12周、24周血清HBV RNA水平的下降對于預(yù)測HBeAg的血清學(xué)轉(zhuǎn)換具有更好的預(yù)測價(jià)值。HBeAg陰性和基線較低的HBV pgRNA水平是ETV治療后早期病毒學(xué)應(yīng)答的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)[20]。

在評價(jià)干擾素治療效果方面,血清HBV RNA可能更好地反映干擾素抑制病毒復(fù)制的情況,同時(shí)對免疫學(xué)應(yīng)答有預(yù)測作用[21]。Jia等[22]的研究表明,對于初治HBeAg陽性的患者基線時(shí)HBV RNA>200000拷貝/mL,干擾素治療12周后HBV RNA>3000拷貝/mL,在治療24周時(shí)很難實(shí)現(xiàn)血清學(xué)轉(zhuǎn)換,以此來預(yù)測干擾素治療獲益。

另外,HBV RNA可以聯(lián)合其他指標(biāo)來評估HBeAg(+)乙肝患者抗病毒療效。Huang等[23]認(rèn)為在HBeAg陽性的慢性HBV感染者中,血清HBV DNA聯(lián)合RNA比單獨(dú)血清HBV RNA或DNA能更好地反映肝內(nèi)cccDNA活性,這可能與HBeAg陽性患者的cccDNA轉(zhuǎn)錄活性較高、HBV基因型、HBV基礎(chǔ)核心啟動(dòng)子突變、HbeAg陰性患者病毒的增殖力受損等有關(guān)[20]?？傊?檢測HBV RNA水平有助于治療效果的判斷,從而優(yōu)化抗HBV治療選擇。

四、預(yù)測停藥后病毒反彈風(fēng)險(xiǎn)

慢乙肝患者經(jīng)治療達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)停藥后易出現(xiàn)病毒反彈,多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)[6],HBV pgRNA水平、ALT水平、停藥時(shí)HBsAg水平、HBV DNA水平均為慢性乙型肝炎患者停藥復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素,而HBV pgRNA水平與停藥復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)呈顯著非線性關(guān)系。Chen等[24]認(rèn)為,對于高水平HBsAg的慢乙肝患者,即使發(fā)生HBeAg血清轉(zhuǎn)換, HBV pgRNA檢出率仍然較高,表明其肝內(nèi)HBV cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性仍比較活躍,HBV復(fù)制仍在進(jìn)行。這就解釋了僅HBeAg血清轉(zhuǎn)換發(fā)生而HBsAg水平仍較高的患者,一旦停藥后復(fù)發(fā)率仍比較高的問題。有研究認(rèn)為[13, 15], NA(s) 能夠通過抑制逆轉(zhuǎn)錄降低HBV DNA,但是卻使得RNA升高,這就導(dǎo)致了治療停藥后的病毒學(xué)反彈率和疾病復(fù)發(fā)率仍居高不下。

Huang等[11]對接受NA(s)治療的患者血清HBV pgRNA的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了研究分析,發(fā)現(xiàn)血清HBV pgRNA水平可反映NA(s)的抗病毒效能。由于ETV比LAM能更有效地抑制反轉(zhuǎn)錄酶及HBV DNA的合成,所以接受ETV治療的患者血清HBV pgRNA峰值水平和檢出概率都顯著高于接受拉米夫定(LAM)治療的患者。Wang等[15]對33例治療結(jié)束時(shí)HBV DNA未檢出的慢乙肝患者血清HBV pgRNA進(jìn)行檢測,其中21例CHB患者血清中HBV pgRNA仍呈陽性,且這些患者均在治療后24周出現(xiàn)病毒反彈,而另外12例HBV pgRNA檢測不到的患者中,僅3例患者出現(xiàn)病毒反彈。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),在ETV治療結(jié)束時(shí),HBsAg≥2logIU/mL或HBV pgRNA≥1466拷貝/mL為停藥后病毒學(xué)復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測因子[20]。另外,聯(lián)合指標(biāo)作為預(yù)測因子的研究也日益增多,GUT刊文就RNA聯(lián)合HBsAg來確定是否可以停用ETV,研究顯示[25]血清RNA ≥44.6 U/mL的患者在停藥48周后93.25%會(huì)出現(xiàn)HBV DNA的反彈,而HBV RNA定量少到接近不可測且HBsAg <10 IU/mL 的患者僅有9.1%出現(xiàn)HBV DNA反彈。這都提示HBV pgRNA的高載量與停止NA(s)治療后病毒反彈的高風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián),應(yīng)該作為指導(dǎo)NA(s)治療安全停藥的指標(biāo)。

最近的研究結(jié)果[26, 27]顯示,由于HBV基因可整合到宿主基因組,整合的HBV DNA易發(fā)生突變、缺失、插入和重排,喪失轉(zhuǎn)錄成HBV pgRNA的能力,且某些整合的HBV基因片段仍可產(chǎn)生HBsAg,因此少數(shù)CHB患者在按照停藥標(biāo)準(zhǔn)停藥時(shí),其血清HBsAg水平不能很好地反映肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA的狀態(tài)。血清HBsAg定量水平對NA(s)的治療結(jié)果預(yù)測價(jià)值不高,HBV pgRNA必須經(jīng)過完整的cccDNA轉(zhuǎn)錄才能產(chǎn)生,所以理論上講,血清HBV pgRNA應(yīng)作為指導(dǎo)臨床抗病毒用藥的指標(biāo),可在NA(s)停藥前檢測血清中的HBV pgRNA水平,對患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行預(yù)判,將有助于甄別出那些已達(dá)到病毒學(xué)應(yīng)答并在停藥后能維持病毒學(xué)應(yīng)答的“部分治愈”患者,從而實(shí)現(xiàn)安全停藥。

五、抗HBV藥物的選擇及新藥研發(fā)

目前臨床常用的NA(s)[15]雖然可以阻斷HBV DNA聚合酶參與的逆轉(zhuǎn)錄過程,但卻能夠?qū)е翲BV pgRNA水平升高。干擾素除了可以通過抑制HBV pgRNA的轉(zhuǎn)錄來抑制HBV復(fù)制,還可以介導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌外泌體,并攜帶miRNA-574-5p進(jìn)入感染HBV的肝細(xì)胞[28],從而抑制HBV pgRNA的轉(zhuǎn)錄,降低肝細(xì)胞HBV cccDNA含量和HBsAg水平,所以近年來聯(lián)合兩者的治療方案也是不錯(cuò)的選擇。

靶向作用于HBV復(fù)制周期的抗病毒藥物近來得到關(guān)注[29, 30],目前直接作用核心組裝調(diào)節(jié)劑(CAMs)的新型抗HBV藥物,對HBV復(fù)制周期有重要影響,可以干擾HBV復(fù)制周期的幾個(gè)步驟,包括cccDNA的形成、衣殼組裝、pgRNA和聚合酶包裝。目前,根據(jù)分子結(jié)構(gòu)的不同,CAMs有三種類型,分別是雜芳基二氫嘧啶(HAP)、苯丙烯酰胺(PPA)和磺胺酰基苯甲酰胺(SBA)衍生物,相關(guān)研究正在開展。除此之外,現(xiàn)在有多種siRNA分子抑制劑可以降低病毒mRNA和pgRNA的表達(dá)。然而,將HBV特異性siRNA在體內(nèi)傳遞給所有感染的肝細(xì)胞仍然是個(gè)挑戰(zhàn)[31]。

六、展望

既往評估慢乙肝病情指標(biāo)主要局限于HBV DNA、HBeAg、ALT、HBsAg、肝組織學(xué)等的改變,雖然經(jīng)抗病毒治療后部分指標(biāo)可恢復(fù)正常,但停藥后易出現(xiàn)病毒反彈;HBsAg發(fā)生血清學(xué)轉(zhuǎn)換后,并不意味著病情完全緩解, 患者肝內(nèi)仍殘留cccDNA,進(jìn)一步導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生病變。因此,血清HBV RNA水平可作為HBV cccDNA水平的替代檢測,綜合評估抗病毒療效和預(yù)測治療終點(diǎn),并為臨床抗HBV治療、選擇合適的停藥時(shí)機(jī)及分析預(yù)后提供有意義的個(gè)體化指導(dǎo)。另外,針對包括HBV pgRNA在內(nèi)的HBV復(fù)制機(jī)制的新藥設(shè)計(jì),即研發(fā)針對HBcAg生成和核衣殼裝配的抗病毒藥物可能會(huì)為未來HBV的治愈帶來曙光。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。