盧旭，李玲，張寧, *

1.貴州中醫(yī)藥大學 藥學院，貴州 貴陽 550025

2.貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001

功能失調性子宮出血（DUB）又稱功能性子宮出血或功血，是由于下丘腦–垂體–卵巢軸異常引起神經內分泌功能失調，影響體內雌孕激素水平，導致的非正常子宮出血[1]。DUB 是一種臨床常見婦科疾病，占10%～15%，50%發(fā)生在更年期，30%發(fā)生在生育期，20%發(fā)生在青春期。目前臨床治療DUB 以止血為主要目標，常用的辦法是刮宮加激素治療，通過刮宮達到快速止血的目的[2]，輔以對患者內分泌的調理，在療效和康復方面不能令人滿意，只能暫時性地壓制臨床癥狀的發(fā)展或者惡化，常因防治不徹底導致復發(fā)，因此亟需療效確切的治療藥物。

苗藥土大黃為蓼科植物尼泊爾酸模Rumex nepalensisSpreng.、齒果酸模Rumex dentatusL.或羊蹄Rumex japonicusHoutt.的新鮮或干燥根及根莖，苗藥名“銳馬欲”。藥用始載于《神農本草經》：“味苦，寒；主頭禿疥瘙，除熱女子陰蝕”。貴州少數民族及民間應用較多，2022 年7 月被收載于貴州苗族等少數民族藥材目錄（第一批）。苗藥土大黃味苦，性寒，具有清熱解毒、止血收斂、殺菌止癢的功效，臨床用于防治熱型痰、黃疸、便秘、疥瘡、疥癬和多種出血癥等疾病[3-4]，對DUB 有獨特的防治作用[5]。土大黃主要化合物包括蒽醌類、黃酮類、二苯乙烯類、萘及萘醌類成分[4]。目前，對于土大黃防治DUB研究及作用機制研究比較欠缺。本研究采用網絡藥理學結合分子對接技術初步探索土大黃對DUB 的防治作用和可能的作用機制，篩選并獲得土大黃防治DUB 的有效活性成分及作用靶點，為其后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 土大黃活性成分及靶點篩選

由于中藥系統(tǒng)藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）數據庫未收錄“土大黃”，查閱相關文獻收集土大黃化學成分，將化學成分通過PubChem 數據庫（https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索土大黃化學成分的Canonical SMILES 號，導入Swiss Target Prediction 平臺（http://www.swisstargetprediction.ch/）進行“Predict targets”，點擊“send to Swiss ADME”鏈接通過 Swiss ADME（http://www.swissadme.ch）了解成分的胃腸道吸收性、類藥性以及能否穿透血腦屏障；其他Pubchem 數據庫未收錄的化學成分，將其化學結構式錄入Swiss Target Prediction 平臺下的Swiss ADME 功能項，得到其SMILES 號，再進行“run”胃腸道吸收性和類藥性等分析。Pharmacokinetics 項下GI absorption 滿足High，同時Druglikeness 項下Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge 5 項特性中3 項為Yes[6]，篩選出成分作為候選活性成分，將候選活性成分的Canonical SMILES 結構導入 Swiss Target Prediction 平臺（http://www.swisstargetprediction.ch/），選擇物種為“Homo sapiens”，查找活性成分所對應的藥物靶點。對所得到的全部靶點進行篩選，去除P＝0 的靶點和重復靶點。利用UniProt 數據庫對所有靶基因名稱進行校正，獲得靶點信息。

1.2 疾病DUB 靶點檢索及共有靶點篩選

以“dysfunctional uterine bleeding”為檢索詞，利用GeneCards 數據庫（https://www.genecards.org）獲取DUB 相關靶點，依據“Relevance score≥10”進行篩選，在OMIM 數據庫（https://www.omim.org/）、DisGeNet 數據庫（http://www.disgenet.org/）、DrugBank 數據庫（https://go.drugbank.com）中再次搜索DUB 獲得與其相關的靶點；將挖掘得到的DUB 相關靶點與土大黃靶點導入 Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）中進行匹配映射，獲得兩者交集靶點即土大黃防治DUB 的關鍵作用靶點。將交集靶點導入String 數據庫（https://string-db.org/ cgi/input.pl）中，構建蛋白相互作用網絡（PPI），蛋白物種設置為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設置為“high confidence ＞0.900”，并隱藏游離的靶標，其余參數保持默認設置，進而得到土大黃防治DUB 的PPI 網絡。

1.3 核心靶點的篩選

將 PPI 網絡圖下載 TSV 格式并上傳至Cytoscape 3.8.2 軟件，利用“Analyze Network”功能拓撲分析，使用度值、介值中心度、緊密中心度3 個拓撲參數同時滿足排名前10 作為篩選條件，篩選出核心靶點。

1.4 “土大黃–活性成分–共有靶點”的網絡構建

將預測的土大黃靶點、藥物活性成分、土大黃–DUB 交集靶點導入Cytoscape3.8.2 軟件中，繪制“土大黃–活性成分–共有靶點”網絡。利用“Analyze Network”功能進行拓撲分析，使用度值、介值中心度、緊密中心度3 個拓撲參數同時滿足排名前10 作為篩選條件，篩選出核心活性成分。

1.5 基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析

使用DAVID 數據庫（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）對共有靶點核心靶點進行GO 和KEGG富集分析，GO 生物功能分析主要包括生物過程（BP）、細胞組分（CC）以及分子功能（MF），將這3組數據以P＜0.01 的條件分別進行篩選，并各取前10 個條目，即組成30 個條目在“微生信”在線繪圖工具中制成柱狀圖進行可視化；KEGG 富集分析篩選出P＜0.01 的條目，將前20 條通路制成氣泡圖進行可視化。

1.6 核心成分與核心靶點的分子對接

在PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫中下載關鍵活性成分3D 結構的SDF 格式，然后使用openbabel 軟件將化合物的SDF 格式轉化為PDB 格式，導入Autodock Tools 1.5.7 軟件中加氫后導出為pdbqt 文件。在PBD（https://www.rcsb.org/）數據庫中下載核心靶點蛋白文件，使用Pymol 軟件去除水分子與配體，使用AutoDock TOOLs 1.5.7 軟件進行加氫后導出pdbqt 文件。最后，將所得到的配體小分子和受體大分子一起導入Autodock Tools 1.5.7 軟件中，計算得到相應的結合能數據。使用Pymol 軟件繪制土大黃關鍵活性成分與核心靶點蛋白之間的模式圖，將關鍵活性成分與各自對應打分最高的核心靶點分子對接進行可視化。

2 結果

2.1 土大黃有效成分與靶點的篩選

查閱文獻獲得土大黃相關活性成分45 個，通過Swiss ADME 和Swiss Target Prediction 平臺預測后得到符合條件的活性成分26 個，見表1。共1 173個靶點，去除重復值得到392 個潛在靶點。

表1 土大黃活性成分Table 1 Active ingredients of Rumei Radix et Rhizoma

2.2 疾病靶點及共有靶點的篩選

通過DisGeNet 數據庫、DrugBank 數據庫、GeneCard 數據庫和OMIM 數據庫搜索DUB 相關的疾病基因，最后得出DisGeNet 數據庫17 個基因，DrugBank 數據庫52 個基因，GeneCard 數據庫348基因、OMIM 數據庫50 個基因，共得到467 個基因疾病靶點，刪除重復值，獲得DUB 相關基因疾病靶點436 個。使用Venny 2.1.0 平臺對392 個土大黃藥物靶點與436 個疾病靶點進行互相映射，共獲得交集靶點74 個。

2.3 PPI 網絡圖的構建及核心靶點的篩選

將得到的土大黃與DUB 74 個共有基因導入STRING 數據庫進行蛋白相互作用分析，結果顯示，網絡共包含74 個節(jié)點，206 條邊，平均節(jié)點度值為5.57。保存其TSV 格式導入到Cystoscape

3.8.2 中進行拓撲分析，見圖1。共獲得62 個節(jié)點和218 條節(jié)點之間的連線（剔除4 個游離靶點）。圖中節(jié)點的大小和顏色根據度值來顯示，度值越大，節(jié)點越大顏色越深，即靶點的作用越重要。根據度值、介值中心度、緊密中心度同時排名前10位，篩選出7 個核心靶點，分別為STAT3、SRC、PIK3R1、PIK3CA、ESR1、AKT1、RELA，其拓撲分析結果見表2。

圖1 交集靶點PPI 網絡圖Fig.1 PPI network diagram of intersection targets

表2 土大黃防治DUB 核心靶點基因的拓撲學分析結果Table 2 Topological analysis results of core target genes of Rumei Radix et Rhizoma prevention and control of DUB

2.4 “土大黃–活性成分–共有靶點”網絡的構建

將土大黃及26 個活性成分，74 個關鍵靶點導入Cytoscape 3.8.2 軟件中構建“土大黃–活性成分–共有靶點”網絡圖，見圖2。圖中共包括101 個節(jié)點（74 個圓形節(jié)點為核心靶點，26 個菱形節(jié)點活性成分，1 個六邊形節(jié)點為苗藥土大黃），278 條邊。利用“Analyze Network”功能進行拓撲分析，度值、介值中心度、緊密中心度同時排名前10 位的核心活性成分有9 個，分別為槲皮素、阿魏酸、豆蔻酸、羥基大黃素、決明柯酮、大黃素甲醚、委陵菜酸、大黃酚、3,4-二羥基苯甲酸乙酯，其拓撲分析結果見表3。

圖2 “土大黃–活性成分–共有靶點”網絡圖Fig.2 Network diagram of “Rumei Radix et Rhizoma-active ingredients-common targets”

表3 土大黃防治DUB 核心成分的拓撲學分析結果Table 3 Topology analysis results of core components of Rumei Radix et Rhizoma prevention and control of DUB

2.5 GO 功能富集分析

通過David 數據平臺進行GO 功能富集分析，得顯著性GO 條目303 個（P＜0.01），其中BP 217個條目，CC 30 個條目，MF 56 個條目，各選取前10 個條目，共組成30 個條目在“微生信”在線繪圖工具中繪制GO 功能注釋分析柱狀圖，見圖3。結果顯示，在土大黃有效成分防治DUB 的潛在靶點中，BP 主要集中在信號傳導（signal transduction）、RNA 聚合酶II 啟動子轉錄的正調控（positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter）和對外源性刺激的反應（response to xenobiotic stimulus）等；CC 主要集中在質膜（plasma membrane）、胞漿（cytosol）和細胞質（cytoplasm）等；MF 主要集中在蛋白結合（protein binding）、相同蛋白結合（identical protein binding）和ATP 結合（ATP binding）等。

圖3 土大黃防治DUB 的潛在靶點GO 功能富集分析（前10）Fig.3 GO Function enrichment analysis of potential targets of Rumei Radix et Rhizoma prevention and control of DUB(top 10)

2.6 KEGG 通路富集分析

通過David 數據平臺進行KEGG 富集分析，得到122 條信號通路（P＜0.01），選取排名前20 的通路進行可視化處理，繪制KEGG 信號通路氣泡圖，見圖4。結果顯示，土大黃有效成分防治DUB 的潛在靶點主要涉及HIF-1、PI3K-Akt 等信號通路。

圖4 土大黃防治DUB 的核心靶點KEGG 富集分析（前20）Fig.4 KEGG enrichment analysis of core targets of Rumei Radix et Rhizoma prevention and control of DUB(top 20)

2.7 活性成分–核心靶點分子對接

將土大黃防治DUB 的9 個關鍵核心活性成分槲皮素、阿魏酸、豆蔻酸、羥基大黃素、決明柯酮、大黃素甲醚、委陵菜酸、大黃酚、3,4-二羥基苯甲酸乙酯分別與7 個核心靶點STAT3、SRC、PIK3R1、PIK3CA、ESR1、AKT1、RELA 進行分子對接，其結合能均小于0，說明這9 種活性成分均能與7 種核心靶點自發(fā)相互結合，見表4，其中大黃酚與SRC結合能最低，結合能為?31.13 kJ/mol。委陵菜酸與PIK3CA 結合能為?30.33 kJ/mol；羥基大黃素與RELA 結合能為?28.24 kJ/mol；大黃素甲醚與AKT1結合能為?28.16 kJ/mol；決明柯酮與AKT1 結合能為?27.57 kJ/mol；豆蔻酸與SRC 結合能為?26.15 kJ/mol；阿魏酸與STAT3 結合能為?20.50 kJ/mol；槲皮素與SRC 結合能為?20.13 kJ/mol；3,4-二羥基苯甲酸乙酯與AKT1 結合能為?18.37 kJ/mol。選取9 個關鍵活性成分與各自對應打分最高的核心蛋白可視化，其結合模式見圖5。

圖5 關鍵活性成分與各自對應打分最高的核心靶點分子對接Fig.5 Docking of key active ingredients with their respective core target molecules with the highest scores

表4 苗藥土大黃防治DUB 的關鍵活性成分與核心蛋白結合能Table 4 Binding energy of key active ingredients and core protein of Rumei Radix et Rhizoma prevention and control of DUB

3 討論

近年來，DUB 患者逐漸增多，不僅會影響患者的生活與工作，重者還會由于出血過多導致休克危及生命安全，引起了社會和臨床的廣泛關注，且目前DUB 的病因和發(fā)病機制尚未完全明確?，F代醫(yī)學認為DUB 主要與患者精神過度緊張、勞累、營養(yǎng)不良或代謝紊亂、環(huán)境及氣候改變有關，或與卵巢或黃體等因素所導致的內分泌紊亂有關，進而引起子宮出血的癥狀[7]?，F在常用手術加激素治療，存在子宮內膜會變薄和藥物不良反應多等缺點，不能從根本上消除導致子宮異常出血的病因[8]。中醫(yī)學認為，DUB 屬于“崩漏”的范疇，《諸病源候論》指出“沖任之脈虛損，不能約制其經血，故血非時而下”，其主要病機是沖任不固，不能制約經血，使子宮藏瀉失常[9]，特點多為虛實夾雜，血熱、血虛、血瘀并存，故治法當涼血、補血、活血并用，才能沖任得固，血海得充，達到血歸其經的目的[10]。土大黃屬于清熱藥，其主要用于因血分中有熱而致的多種出血癥，經過民間多年應用及臨床研究證明苗藥土大黃防治DUB 有特效[11]，但其作用機制尚無系統(tǒng)性研究。

經文獻查閱并進行篩選后得到土大黃防治DUB 主要活性成分26 種，最后篩選出大黃酚和槲皮素等9 種土大黃防治DUB 關鍵活性成分。有學者研究發(fā)現，大黃酚口服或皮下注射，可縮短血液凝固時間，具有止血作用，降低毛細血管的通透性，改善血管脆性，縮短凝血時間等[12]；大黃酚及大黃素通過干擾三磷酸肌醇（IP3）誘導的鈣釋放機制，對激動劑誘導的血管收縮均有明顯的抑制作用[13]。槲皮素是一種具有多種生物活性的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌等藥理活性[14]，可以通過改變細胞周期進程、抑制細胞增殖、促進細胞凋亡、抑制血管擴張，發(fā)揮抗腫瘤作用[15]。研究表明，槲皮素止血作用的增強與含量的增加有關[16]，還能靶向抑制核因子-κB 信號通路轉導作用于SRC，發(fā)揮抗炎活性[17]。此外，槲皮素還能通過激活蛋白激酶B（Akt）磷酸化，作用于磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt 信號通路，減少氧化應激，實現對血管內皮細胞的修復和保護作用[18]。由此進一步探討土大黃主要活性成分防治DUB 的作用機制，PPI 分析顯示，土大黃可能與 STAT3、SRC、PIK3R1、PIK3CA、ESR1、AKT1、RELA 等多個靶點產生協(xié)同作用，這些靶點分別通過調控炎癥反應、激素合成、增殖與凋亡來有效控制子宮出血[19]。其中，AKT1 是PI3K-Akt 信號通路的下游蛋白，在血小板的活化中起關鍵作用，其作為Akt 的亞型，可參與代謝、增殖、細胞存活、生長和血管生成等多種生物學過程。實驗研究表明，AKT1 基因缺陷小鼠與正常鼠相比，其出血時間增加，凝血時間延長，且血小板聚集、分泌和擴散受損[20]。STAT3 屬于STAT家族成員之一，在細胞增殖、分化、凋亡等過程中起著關鍵作用，可促進促血管生成的關鍵調節(jié)信號的生成，介導細胞的生長、凋亡等過程[21]，是一種參與腫瘤發(fā)生和組織損傷的常見信號傳導機制，能夠參與調節(jié)傷口愈合和癌癥，包括細胞侵襲和遷移、血管生成、凝血調節(jié)和干擾素誘導基因的抑制[22]。研究表明，STAT3 表達與外周血中的下肢深層靜脈血栓形成有關[23]。SRC 基因是SRC 家族的的成員之一，它是一種非受體酪氨酸激酶，SRC 異?；罨梢酝ㄟ^多種途徑刺激腫瘤細胞的生長、浸潤、轉移，從而誘導體內新的血管生成。SRC 家族激酶在介導血小板對血管損傷的快速反應中起核心作用[24]，磷酸化的SRC 參與血小板黏附和聚集過程，并通過激活下游黏著斑信號通路等，參與黏著斑和血栓的形成，進而調節(jié)止血過程[25]。以上研究表明，土大黃可能通過大黃酚和槲皮素等作用于AKT1、STAT3、SRC 等靶點發(fā)揮止血的作用。

GO 功能富集結果顯示苗藥土大黃作用于DUB的核心靶點影響生物過程主要包括信號轉導、RNA聚合酶II 啟動子轉錄的正調控、基因表達的正向調節(jié)等，表明這些生物過程可能在DUB 的發(fā)生和發(fā)展中體現了重要作用。KEGG 通路富集分析表明土大黃主要是通過調控HIF-1、PI3K-Akt 信號通路治療出血。低氧誘導因子-1α（HIF-1α）是HIF-1 的活性亞基，又是調節(jié)亞基，與雌激素產生、血管生成、細胞增殖和炎癥等相關基因表關系密切。在低氧狀態(tài)下，機體可通過調節(jié)HIF-1 信號通路來維持內環(huán)境的氧穩(wěn)態(tài)，抑制血管生成[19]。研究發(fā)現，HIF-1α可調控多種血管生成因子的表達，達到修復血管和止血作用[26]。通過降低HIF-1α 的表達，降低模型大鼠炎癥水平，并減緩血管的擴張及新生，能改變缺氧狀態(tài)從而抑制血管新生[27]。PI3K 為細胞內磷脂酰肌醇激酶，Akt 是PI3K 信號傳導中重要的下游效應器，通過調控PI3K-Akt 通路可以阻止血小板對纖維蛋白原的激活和黏附，抗血小板聚集，增強親環(huán)素A 的黏附，促進凝血因子的形成，從而發(fā)揮止血作用[28-31]。徐薇等[32]研究發(fā)現，通過調節(jié)子宮內膜組織PI3K 信號通路的磷酸化水平促進組織細胞的抗炎作用和增殖作用，恢復血管功能，從而治療子宮異常出血癥。Zhang 等[33]研究發(fā)現，小劑量脂多糖能夠激活 PI3K-AKT 信號通路，增加糖胺聚糖顆粒分泌到子宮腔，以增加黏液層的厚度，從而保護子宮。以上結果表明土大黃可能通過槲皮素和大黃酚等活性成分作用于AKT1、STAT3、SRC 等靶點，調控HIF-1、PI3K-Akt 信號通路的信號表達從而介導血小板聚集、血栓形成，達到止血的目的。

綜上所述，本研究通過應用網絡藥理學及分子對接技術的方法對土大黃活性成分、靶點和作用通路進行分析，表明土大黃防治DUB 的是多成分、多靶點、多通路協(xié)同的結果。土大黃可能通過AKT1、STAT3、SRC 等靶點主要作用于HIF-1、PI3K-Akt 信號通路發(fā)揮防治DUB 作用，為其后續(xù)進一步深入研究提供了基礎和參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突