孫玉鳳,黃亞濤,劉佳萌,貫東艷,范 蓓,王鳳忠
(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全收貯運(yùn)管控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100193)
大豆是豆科、蝶形花亞科、大豆屬植物,古代稱“菽”,在我國(guó)已有5 000 多年的栽培歷史。大豆在我國(guó)各地均有栽培,品種豐富,至今為止資源庫(kù)中已保有30 000 多個(gè)大豆種質(zhì)[1]。大豆富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及功能因子,是我國(guó)重要的糧食、油料及飼料來(lái)源。大豆中同時(shí)存在天然毒素嘌呤化合物,它是一種含氮雜環(huán)類有機(jī)化合物,由鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤、次黃嘌呤和黃嘌呤組成。嘌呤化合物代謝的最終產(chǎn)物為尿酸,由腸黏膜吸收進(jìn)入體液后隨尿液排出,人體中尿酸過(guò)高可誘發(fā)痛風(fēng)[2]。醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)為痛風(fēng)病人不宜攝入大豆食品。一項(xiàng)對(duì)亞太地區(qū)的醫(yī)學(xué)工作者的調(diào)查顯示,48%的醫(yī)學(xué)工作者認(rèn)為攝入大豆會(huì)導(dǎo)致痛風(fēng)[3]。明確大豆中嘌呤化合物的含量,可為大豆加工及消費(fèi)提供科學(xué)指導(dǎo)。
目前研究人員采用多種前處理方法和檢測(cè)手段對(duì)嘌呤化合物進(jìn)行定量研究,嘌呤檢測(cè)中樣品前處理方法主要有酸解提取法、溶劑提取法、柱萃取、膜萃取、離子交換柱純化法和超聲提取法等[4]。常用的檢測(cè)方法為反相離子對(duì)色譜法[5]、高效液相色譜法[6-9]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[10]等。在對(duì)大豆嘌呤化合物的檢測(cè)中,大多數(shù)只針對(duì)某一品種,尚未對(duì)多種大豆資源的嘌呤化合物進(jìn)行比較研究。本研究探討大豆中嘌呤化合物的色譜分離條件及提取條件,建立大豆中嘌呤化合物含量檢測(cè)的超高效液相色譜法,以完善我國(guó)不同大豆主栽品種的嘌呤化合物數(shù)據(jù),為大豆加工的品種選用及合理膳食提供參考。
大豆樣品:58 種大豆樣品均由大豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系試驗(yàn)站提供,樣品經(jīng)過(guò)粉碎機(jī)粉碎后,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
標(biāo)準(zhǔn)品:腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤(色譜純,純度≥99.0%),上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;甲醇、甲酸、磷酸二氫鉀、磷酸、高氯酸、三氟乙酸(均為色譜純),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲酸銨(色譜純),Sigma-Aldrich 公司。
超高效液相色譜儀(Acquity UPLC)、色譜柱(Acquity UPLCHSS T3)(2.1 mm×100 mm,1.8 μm),美國(guó)沃特世公司;電子分天平(MS105DU)、pH 計(jì)(Mettler Toledo),瑞士梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;超純水系統(tǒng)(Milli-QAdvantageA10),香港力康生物醫(yī)療技術(shù)控股集團(tuán);超聲波清洗器(KQ-600DE),昆山超聲儀器有限公司;恒溫水浴鍋(DK-8D 型),上海一恒科技有限公司;SHB-III 型循環(huán)水式真空抽濾裝置,鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;氮吹儀(TTL-DC II 型),北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司;0.22 μm 微孔濾膜,天津市科億隆實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。
1.3.1 色譜條件的優(yōu)化
1.3.1.1 流動(dòng)相的選擇 色譜柱為Acquity UPLCHSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm),流動(dòng)相分別為0.02 mol/L 的磷酸二氫鉀(pH=3.40)和0.01 mol/L 的甲酸銨(pH=3.40),進(jìn)樣量1 μL,柱溫為30 ℃,流速為0.1 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm,探究磷酸二氫鉀流動(dòng)相和甲酸銨流動(dòng)相對(duì)4 種嘌呤化合物的分離效果。
1.3.1.2 pH 值的選擇 確定流動(dòng)相為0.01 mol/L甲酸銨后,分別設(shè)置pH=3.30,3.40,3.50,3.60 4個(gè)組,進(jìn)樣量1 μL,柱溫為30 ℃,流速為0.1 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm,探究不同pH 值對(duì)4 種嘌呤化合物的分離效果。
1.3.2 嘌呤化合物提取條件的優(yōu)化
1.3.2.1 提取溶劑的選擇 選取以下兩種提取溶液,探究不同提取溶劑對(duì)4 種嘌呤化合物的提取效果。
A:三氟乙酸∶甲酸(V∶V=1∶1)混合溶液。
按以下步驟操作:準(zhǔn)確稱取冀豆16 號(hào)、冀黑豆1 號(hào)大豆粉末0.100 g,分別置于10 mL 玻璃試管中,向其中加入1 mL 水混勻,再加入1 mL 酸液,混勻后置于沸水浴水解30 min,立即冷卻,氮吹至體積約為0.5 mL,加水4 mL 后,用15 mol/L KOH 溶液調(diào)節(jié)pH 值至3.4,以5 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心20 min,取上清定容至5 mL,過(guò)0.22 μm 微孔濾膜,備用。
B:6%高氯酸溶液。
按以下步驟操作:準(zhǔn)確稱取冀豆16、冀黑豆1號(hào)大豆粉末0.100 g,分別置于10 mL 玻璃試管中,向其中加入2 mL 6%高氯酸,混勻,沸水浴水解30 min,立即冷卻,用15 mol/L 氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH 值至3.4,以5 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心20 min,取上清定容至5 mL,過(guò)0.22 μm 微孔濾膜,備用。
1.3.2.2 水解時(shí)間的選擇 以冀豆16 號(hào)和冀黑豆1 號(hào)為對(duì)象,操作步驟同1.3.2.1 節(jié)A,沸水浴中水解時(shí)間分別調(diào)整為15,30,60 min,探究不同水解時(shí)間對(duì)4 種嘌呤化合物的提取效果。
1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 配制250 mg/L 鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤和次黃嘌呤單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,吸取各嘌呤單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 mL 于5 mL 容量瓶中,用純水定容至刻度,配制成50 mg/L 的混合中間液。準(zhǔn)確移取0.04,0.08,0.2,0.4,0.8,2 mL 混合中間液至6 個(gè)10 mL 棕色容量瓶,用超純水定容至刻度,配制為0.2,0.4,1.0,2.0,4.0,10 mg/L 的系列梯度溶液,過(guò)0.22 μm 微孔濾膜,用已確定的最佳色譜方法進(jìn)行超高效液相色譜分析。以峰面積(Y)及樣品質(zhì)量濃度(X)作標(biāo)準(zhǔn)曲線,以3 倍信噪比(S/N)所對(duì)應(yīng)的濃度為檢出限(LOD)。
1.3.4 方法性能研究
1.3.4.1 精密性檢驗(yàn) 按照1.3.3 節(jié)所述方法,選取一個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品(4.0 mg/L)用已確定的最佳色譜方法連續(xù)進(jìn)樣5 次,分別對(duì)鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤和次黃嘌呤的峰面積進(jìn)行測(cè)定,然后計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值(RSD)。
1.3.4.2 重復(fù)性檢驗(yàn) 選取冀豆16 大豆粉末樣品6 份,分別稱取0.100 g,按照確定的最佳嘌呤提取方法處理,將6 份處理的樣品進(jìn)行超高效液相色譜分析,色譜條件同1.3.1 節(jié)所述,根據(jù)測(cè)定量計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。
1.3.4.3 加標(biāo)回收率檢驗(yàn) 分別稱取冀豆16 大豆粉末樣品12 份,每份0.100 g,按照確定的最佳嘌呤提取方法處理,將12 份處理的樣品進(jìn)行超高效液相色譜分析,色譜條件同1.3.1 節(jié)所述。之后,按每種嘌呤含量的0.5,1,2 倍加入嘌呤標(biāo)品,配制成低、中、高3 個(gè)濃度,上機(jī)檢測(cè)。每個(gè)樣品測(cè)定3 次,計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。
1.3.4.4 58 種大豆中4 種嘌呤化合物含量的測(cè)定準(zhǔn)確稱58 種大豆粉末0.100 g,按照確定的最佳嘌呤提取方法處理,將處理的樣品進(jìn)行超高效液相色譜分析,色譜條件同1.3.1 節(jié)所述,每個(gè)樣品測(cè)定3 次,分析58 種大豆樣品中嘌呤化合物的含量。
采用0.02 mol/L 磷酸二氫鉀(pH=3.40)和0.01 mol/L 甲酸銨(pH=3.40)分別作為流動(dòng)相,探究流動(dòng)相種類對(duì)4 種嘌呤化合物的分離效果。當(dāng)以0.02 mol/L 磷酸二氫鉀(pH=3.40)為流動(dòng)相時(shí),結(jié)果如圖1a 所示,無(wú)法分離4 種嘌呤化合物,鳥(niǎo)嘌呤與腺嘌呤出峰時(shí)間重疊。當(dāng)以0.01 mol/L 甲酸銨(pH=3.40)為流動(dòng)相時(shí),結(jié)果如圖1b 所示,4種嘌呤化合物都能得到較好的分離,峰形也比較好,沒(méi)有拖尾現(xiàn)象,因此,判定此流動(dòng)相適合多組分嘌呤化合物的分離。
圖1 流動(dòng)相的種類對(duì)4 種嘌呤分離效果的影響Fig.1 Influence of mobile phase types on purine separation effect of four kinds
采用pH 值分別為3.30,3.40,3.50,3.60 的0.01 mol/L 甲酸銨為流動(dòng)相,探究不同pH 值對(duì)4種嘌呤化合物的分離效果,結(jié)果如圖2 所示。試驗(yàn)表明,流動(dòng)相的pH 值對(duì)4 種嘌呤化合物的分離度和峰形均存在較大影響,流動(dòng)相的pH 值過(guò)高或過(guò)低均不利于4 種嘌呤化合物的分離。當(dāng)pH值為3.30 時(shí),鳥(niǎo)嘌呤和腺嘌呤分離度小于0(圖2a)。當(dāng)pH 值為3.40 時(shí),鳥(niǎo)嘌呤和腺嘌呤分離度達(dá)到1.78(圖2b),分離度較好,4 種嘌呤分離度均符合要求。當(dāng)pH 值繼續(xù)升高達(dá)到3.50 時(shí),黃嘌呤出現(xiàn)異峰(圖2c)。繼續(xù)調(diào)節(jié)pH 值至3.60 時(shí),只分離出3 個(gè)峰,腺嘌呤和次黃嘌呤未被分開(kāi),合并成一個(gè)峰,且黃嘌呤峰形呈現(xiàn)前沿峰(圖2d)。綜上所述,本研究選用pH 值為3.40 的0.01 mol/L 甲酸銨溶液作為最佳流動(dòng)相。
圖2 流動(dòng)相pH 值對(duì)4 種嘌呤分離效果的影響Fig.2 Influence of pH value of mobile phase on the separation effect of four purines
2.2.1 選擇的提取溶劑 嘌呤化合物在食物中主要以結(jié)合態(tài)形式存在,在測(cè)定嘌呤化合物含量時(shí)要將其水解成4 種游離嘌呤堿基再測(cè)定[11]。提取嘌呤的方法主要有酸解提取法、柱萃取、膜萃取法等,其中最常用的是酸解提取法,而酸解提取法中最常用的酸主要是高氯酸[12]和三氟乙酸甲酸混合溶液[13]兩種。不同酸解提取法對(duì)嘌呤含量測(cè)定的影響如何,至今少有報(bào)道。本研究選用三氟乙酸∶甲酸(V ∶V=1 ∶1)混合溶液及6%高氯酸溶液作為提取溶劑,分別對(duì)冀豆16 號(hào)和冀黑豆1 號(hào)進(jìn)行嘌呤化合物提取,并通過(guò)超高效液相色譜進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如表1 所示。
表1 不同提取溶劑測(cè)定結(jié)果(n=3)Table 1 Determination results of different extraction solvents(n=3)
由表1 可知,用三氟乙酸∶甲酸(V∶V=1∶1)混合溶液作為提取溶劑時(shí),冀豆16 號(hào)和冀黑豆1 號(hào)中4 種嘌呤化合物含量測(cè)定值顯著高于6%高氯酸溶液提取組,其中,次黃嘌呤使用前者條件提取后的測(cè)定值是后者的4 倍以上,鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤使用前者條件提取后的測(cè)定值是后者的1.21~1.35 倍,總嘌呤使用前者條件提取后的測(cè)定值是后者的1.22~1.27 倍。雖然高氯酸水解法操作簡(jiǎn)單、成本低,但是高濃度的高氯酸會(huì)降解嘌呤化合物,造成測(cè)定結(jié)果偏低[14]。三氟乙酸和甲酸易揮發(fā),經(jīng)過(guò)氮吹后可除去大部分酸,降低樣液中鹽濃度,水解效果好,嘌呤損失小[12]。因此,本研究選擇三氟乙酸∶甲酸(V ∶V=1 ∶1)混合溶液作為最佳提取溶劑。
2.2.2 選擇的水解時(shí)間 在樣品前處理方法中,前人對(duì)嘌呤化合物的水解溫度做了大量研究,結(jié)果表明嘌呤化合物的最佳水解溫度為100 ℃[15-17],在水解時(shí)間上,劉鎮(zhèn)等[15]選用30 min 水解釀造黃酒用糧食原料中的嘌呤,毛玉濤等[18]選用60 min水解豆?jié){中嘌呤。為確定嘌呤化合物最佳水解時(shí)間,本研究以冀豆16 號(hào)和冀黑豆1 號(hào)為對(duì)象,分別設(shè)置了15,30 和60 min 進(jìn)行水解處理,其它操作步驟按照1.3.1 節(jié)所述進(jìn)行,并通過(guò)超高效液相色譜進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如表2 所示。
表2 不同水解時(shí)間測(cè)定結(jié)果(n=3)Table 2 Determination results of different water bath times(n=3)
由表2 可知,水解時(shí)間為30 min 時(shí),冀豆16號(hào)和冀黑豆1 號(hào)中4 種嘌呤化合物含量測(cè)定值顯著高于15 min 組和60 min 組,表明水解時(shí)間在15~60 min 之內(nèi),隨著時(shí)間的延長(zhǎng),樣品中鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤、次黃嘌呤和黃嘌呤的含量均隨水解時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)低-高-低的趨勢(shì),說(shuō)明水解時(shí)間過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)都會(huì)對(duì)大豆中嘌化合物含量測(cè)定值產(chǎn)生影響。水解時(shí)間過(guò)短會(huì)導(dǎo)致嘌呤化合物從結(jié)合態(tài)向游離態(tài)轉(zhuǎn)化不徹底或未轉(zhuǎn)化,水解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)引起游離態(tài)的嘌呤化合物發(fā)生降解,導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏低。因此,本研究選擇30 min 作為嘌呤化合物最佳水解時(shí)間。
按照確定的最佳超高效液相色譜條件,將配置好的嘌呤混合標(biāo)準(zhǔn)梯度溶液檢測(cè),以峰面積(Y)及樣品質(zhì)量濃度(X)作標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性關(guān)系及檢出限結(jié)果見(jiàn)表3。4 種嘌呤化合物在0.2~10 mg/L 質(zhì)量濃度范圍線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(R2)均在0.9995 以上。檢出限在0.0412~0.1001 mg/L 之間,靈敏度較高,可以滿足試驗(yàn)的要求。
表3 嘌呤化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果Table 3 Result of purine standard curve
2.4.1 方法精密性 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見(jiàn)表4,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.6000%,表明本研究建立的超高效液相色譜檢測(cè)方法精密度良好,重現(xiàn)性高,可應(yīng)用于樣品檢測(cè)。
表4 精密性結(jié)果Table 4 Result of precision
2.4.2 方法重復(fù)性 按照確定的最佳提取條件及色譜條件對(duì)冀豆16 大豆粉末樣品中的嘌呤化合物進(jìn)行提取和測(cè)定,結(jié)果顯示:鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.1103%,1.0728%,1.3762%,0.9457%,表明重復(fù)性較好。
2.4.3 加標(biāo)回收率 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5,鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤平均回收率分別為96.6225%,100.1373%,93.4343%,92.5926%,說(shuō)明采用本研究確定的最佳提取條件可有效保留嘌呤化合物,減少樣品中嘌呤化合物的損失。
表5 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 5 Recovery rates of samples with added specimen(n=3)
按照確定的最佳提取條件及色譜條件,對(duì)我國(guó)不同主栽品種共計(jì)58 種大豆中嘌呤化合物進(jìn)行提取和測(cè)定,每種樣品平行測(cè)定3 次,結(jié)果見(jiàn)表6。
表6 大豆樣品中4 種嘌呤化合物的含量(mg/kg)Table 6 The contents of four kinds of purine in soybean samples(mg/kg)
由表6 可知,所有大豆樣品嘌呤含量中,鳥(niǎo)嘌呤含量最高,其次為腺嘌呤,黃嘌呤及次黃嘌呤在有的大豆品種未檢出,這與劉少林等[19]的研究結(jié)果一致。不同品種大豆中嘌呤含量差異較大,嘌呤含量在1 745.88~2 824.54 mg/kg 之間,高蛋白大豆品種中嘌呤含量高于2 300 mg/kg,其中冀豆23 嘌呤含量高達(dá)2 548.34 mg/kg;常規(guī)大豆品種中嘌呤含量在2 000~2 300 mg/kg 之間;高油、蛋脂雙高大豆品種中嘌呤含量低于2 000 mg/kg,其中中黃76嘌呤含量最低,為1 745.88 mg/kg;無(wú)腥大豆品種中嘌呤含量差異較大,綏無(wú)腥豆、五星1 號(hào)、五星2 號(hào)、五星3 號(hào)嘌呤含量分別為2 013.06,2 162.31,2 274.36,2 824.54 mg/kg。
Kaneko 等[8]測(cè)定了包括豆類及豆制品在內(nèi)的270 種食品中嘌呤含量,根據(jù)嘌呤含量將食品劃分為5 組,即極低組(<500 mg/kg)、低組(500~1 000 mg/kg)、中組(1 000~2 000 mg/kg)、高組(2 000~3 000 mg/kg)、超高組(>3 000 mg/kg),由此判斷,大豆介于嘌呤含量中組和高組。在明確大豆品種嘌呤含量的基礎(chǔ)上,選擇適當(dāng)類型的大豆品種,結(jié)合加工工藝[20-23],可以更好地生產(chǎn)出適宜不同人群的大豆制品。
超高效液相色譜法具有靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點(diǎn),本文建立了檢測(cè)大豆中4 種嘌呤化合物的超高效液相色譜法,選用Acquity UPLCHSS T3(2.1×100 mm,1.8 μm)為色譜柱,以00.01 mol/L pH 值為3.40 的甲酸銨溶液為流動(dòng)相,流速為0.1 mL/min,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量1 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm,檢測(cè)大豆中腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證,此方法在線性范圍(0.2~10 mg/L)線性關(guān)系良好(R2>0.9995),方法檢出限為0.0412~0.1001 mg/L,方法精密度RSD 小于0.6000%,重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤RSD 值依次為1.1103%,1.0728%,1.376%,0.9457%。4 種嘌呤化合物加標(biāo)回收率在92.5926%~-100.1373%之間,適用于大豆中4 種嘌呤化合物的測(cè)定。本文還研究比較確定了理想的提取溶劑為三氟乙酸∶甲酸(V∶V=1∶1)混合溶液,理想的水解時(shí)間為30 min。應(yīng)用此方法測(cè)定的我國(guó)部分大豆主栽品種中嘌呤化合物含量數(shù)據(jù)顯示,不同大豆品種中嘌呤含量:高蛋白品種>常規(guī)品種>高油、蛋脂雙高品種,無(wú)腥大豆品種中嘌呤含量差異較大,該研究結(jié)論可為大豆加工及消費(fèi)提供科學(xué)指導(dǎo)。