其布勒，吉日木圖，2，明 亮，2*

（1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 呼和浩特 010018 2 內(nèi)蒙古駱駝研究院 內(nèi)蒙古阿拉善 750306）

肝臟是人體最重要的代謝器官，也是酒精代謝的中心，超過(guò)80%的攝入酒精在肝臟代謝[1]。隨著酒精消費(fèi)的增加，酒精性肝病（ALD）的發(fā)病率越來(lái)越高，已成為一個(gè)嚴(yán)重的健康問(wèn)題，引起了全世界的關(guān)注[2]。根據(jù)肝損傷的嚴(yán)重程度，酒精性肝病包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化、酒精性肝硬化和酒精性肝癌[3]。研究ALD 的發(fā)病機(jī)制對(duì)治療及干預(yù)病情的發(fā)展具有重大意義[4]。

駱駝是荒漠地帶的一種特有畜種，對(duì)荒涼、貧瘠、嚴(yán)酷的荒漠環(huán)境具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，也造就了駝乳“沙漠白金”的美稱；其營(yíng)養(yǎng)成分獨(dú)特，含有豐富的蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸以及磷、鈣、鉀等礦物質(zhì)元素和維生素B、C、E 等營(yíng)養(yǎng)成分，易于消化吸收，是有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和食療保健作用的飲品[5-8]。此外，駝乳還含有高水平的生物活性物質(zhì)，如乳過(guò)氧化物酶、免疫球蛋白G（IgG）、分泌性免疫球蛋白A（SIgA）、乳鐵蛋白、溶菌酶、胰島素、類胰島素生長(zhǎng)因子等，使其具有優(yōu)異的抗氧化和抗菌活性[9-10]。有研究表明，駝乳及其成分還具有其它潛在的功能特性，如抗致癌[11-12]、抗糖尿病[13]、抗高血壓[14]和腎保護(hù)潛力[15-16]。

目前，駝乳的功用價(jià)值已引起世界各地研究人員的極大關(guān)注。為進(jìn)一步探索駝乳對(duì)酒精所致肝損傷的改善作用，本研究以ICR 小鼠建立急性酒精肝損傷的動(dòng)物模型，通過(guò)給酒精性肝損傷小鼠灌胃駝乳，研究其對(duì)肝損傷的預(yù)防作用。采用比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)探究駝乳對(duì)急性酒精性肝損傷的分子調(diào)控機(jī)制，旨在為利用駝乳開(kāi)發(fā)保肝功能食品或膳食補(bǔ)充劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

清潔級(jí)（SPF）雄性ICR 小鼠，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒，南京建成生物有限公司；總RNA 提取試劑盒，Life Technologies 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Thermo Fisher Scientific 公司；擴(kuò)增試劑盒，Luna公司；腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）、白介素-1β（IL-1β）試劑盒，上海酶聯(lián)生物有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀、熒光定量PCR 儀，美國(guó)Thermo 公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 實(shí)驗(yàn)小鼠經(jīng)過(guò)1 周適應(yīng)性喂養(yǎng)后，將其隨機(jī)分為4 組，正常組（NC）、模型組（ET）、駝乳組（CM）、駝乳干預(yù)組（ET+CM），每組10 只。CM 和ET+CM 組均按6 g/kg 的劑量灌胃駝乳，NC 組和ET 組給予同體積蒸餾水灌胃，連續(xù)14 d。于末次灌胃后禁食不禁水6 h，除NC 組和CM 組灌胃蒸餾水外，其它2 組均給予50%酒精（7.3 g/kg bw）。6 h 后，眼眶取血，3 000 r/min、4℃離心20 min 取上清液，分裝貯于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ缓?，頸椎脫臼處死小鼠，迅速摘取肝臟組織，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 凍干駝乳粉的制備 新鮮駝乳經(jīng)3 500 r/min 離心40 min 脫脂，然后進(jìn)行真空冷凍干燥，密封保存，備用。試驗(yàn)開(kāi)始后，按6 g/kg 灌胃計(jì)量，以CM 組和ET＋CM 組小鼠平均體重按照m0計(jì)，每次灌胃量0.3 mL，需要配制質(zhì)量濃度為2m0×10-2g/mL 脫脂駝乳粉溶液，組內(nèi)個(gè)體體質(zhì)量為m（g）小鼠灌胃駝乳粉體積按照下列公式進(jìn)行計(jì)算：

1.3.3 肝組織中ALT 和AST 指標(biāo)的測(cè)定 將9倍體積的生理鹽水加入肝組織中，并將肝組織在冰水浴中勻漿。將制備的勻漿在4 ℃下以3 000×g離心20 min，取上清液進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)試劑盒方法測(cè)定肝組織中ALT 和AST 水平。

1.3.4 血清中TNF-α、IL-10、1L-6 和IL-1β 含量的測(cè)定 用離心管收集小鼠血清，靜置2 h 后3 000×g 離心20 min，取上清按照試劑盒方法測(cè)定TNF-α、IL-10、1L-6 和IL-1β 含量。

1.4 肝臟組織RNA 提取及cDNA 文庫(kù)構(gòu)建

根據(jù)試劑盒（RNAiso Plus 試劑盒和RNeasy Mini 試劑盒）的操作流程提取小鼠肝組織總RNA，所得總RNA 經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100 電泳質(zhì)檢合格后，連接有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA。然后將mRNA 隨機(jī)大段成短片段為模板進(jìn)行第一鏈和第二鏈cDNA 的合成并使用RNAClean XP Kit 和RNase-Free DNase Set 純化；修復(fù)黏性末端為平末端并在3 末端加堿基A并加接頭，最后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增獲得最終測(cè)序文庫(kù)。由Agilent 2100 確定文庫(kù)大小后，使用Illumina HiSeq平臺(tái)對(duì)cDNA 文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序部分由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.5 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)處理及分析

為了得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)，首先采用fastx_toolkit_0.0.14 軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)（Raw Reads）進(jìn)行質(zhì)控。將質(zhì)控后的原始數(shù)據(jù)（clean data 或Clean reads），與參考基因組（Mus musculus.GRCm38.p，http：//www.ensembl.org/Mus_musculus/Info/ Index）比對(duì)，然后用FPKM 法將影響計(jì)算基因表達(dá)的基因長(zhǎng)度和測(cè)序量差異進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，使用RSEM 計(jì)算各個(gè)樣品的基因表達(dá)水平，并用edgeR 方法進(jìn)行組間差異表達(dá)分析。根據(jù)差異基因檢測(cè)結(jié)果，對(duì)候選基因進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 驗(yàn)證相關(guān)差異基因

采用TRIzol 法提取小鼠肝組織當(dāng)中總RNA，RNA 樣品符合要求（OD260nm/OD280nm=1.8～2.2）。使用Nanodrop 檢測(cè)RNA 純度和濃度。采用UEIris ⅡRT-PCR System for Fist-Strand cDNA Synthesis試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物cDNA 稀釋10 倍用于qPCR 模板。根據(jù)SYBRPremix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行定量檢測(cè)，反應(yīng)體系20 μL：cDNA 2 μL，TB 溶液10 μL，正/反向引物各0.8 μL，無(wú)菌水6.4 μL，將樣品混合均勻于96孔板，上機(jī)運(yùn)行。其運(yùn)行條件為：95 ℃30 s，95 ℃5 s，57 ℃30 s，72 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。本研究所用引物基因序列由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列如表1 所示。通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA 的表達(dá)，以β-actin 為內(nèi)參，與正常組做比值，根據(jù)樣本CT 值計(jì)算各基因相對(duì)表達(dá)量，以溶解曲線判斷PCR 產(chǎn)物是否具有特異性。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本研究所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并由GraphPad prism 5.03 進(jìn)行分析并繪圖。所有組之間的比較采用單向方差分析（ANOVA）檢驗(yàn)。根據(jù)Bonferroni 事后檢驗(yàn)計(jì)算出顯著差異。P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 駝乳對(duì)肝損傷小鼠肝組織AST 和ALT 的影響

ALT 和AST 是臨床上常用的肝功能評(píng)價(jià)指標(biāo)，其水平反映了肝細(xì)胞損傷程度。如圖1a、1b 所示，與NC 組相比，ET 組小鼠肝組織中的AST 和ALT 酶活力顯著升高（P＜0.05），說(shuō)明ALD 小鼠建模成功。與ET 組相比，ET+CM 組的AST 和ALT酶活力顯著降低（P＜0.05），表明駝乳不同程度的抑制了肝組織中該兩種酶的活性，從而有效緩解酒精引起的肝損傷。此外，NC 與CM 組之間沒(méi)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖1 駝乳對(duì)肝損傷小鼠肝組織AST 和ALT 的影響Fig.1 Effect of camel milk on AST and ALT of liver tissue in mice with liver injury

2.2 駝乳對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠炎癥反應(yīng)的影響

酒精進(jìn)入機(jī)體后，激活kuffer 細(xì)胞釋放IL-10、IL-6、IL-1β 和TNF-α 等炎癥因子，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，從而加重酒精性肝損傷。為了評(píng)估駝乳的抗炎作用，測(cè)定了血清中IL-10、IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平。結(jié)果如圖2 所示，與NC 組相比，ET組的TNF-α、1L-6 和IL-1β 水平顯著升高（P＜0.05），IL-10 含量顯著降低（P＜0.05），表明酒精暴露可誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞發(fā)生炎性損傷。與ET 組相比，ET+CM 組小鼠血清中TNF-α、1L-6 和IL-1β水平顯著降低（P＜0.05），IL-10 含量顯著升高（P＜0.05），表明駝乳會(huì)產(chǎn)生大量抗炎因子來(lái)抑制酒精誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，從而改善急性酒精性肝損傷。

圖2 駝乳對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠炎癥反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of camel milk on inflammatory response in mice with acute alcoholic liver injury

2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)及比對(duì)分析

本測(cè)序的12 個(gè)樣本的質(zhì)量和比對(duì)統(tǒng)計(jì)表如表2 所示，各樣本測(cè)序共得到5 160 萬(wàn)條raw reads，然后進(jìn)行過(guò)濾后共得到5 124 萬(wàn)clean reads。在獲得的clean reads 中，所有樣本能定位到基因組上的比率高于93%，然后在參考序列上有唯一比對(duì)率達(dá)到84%以上。測(cè)序結(jié)果表明，RNA測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制良好，可進(jìn)行后續(xù)生物信息學(xué)分析。

表2 樣本質(zhì)量和比對(duì)結(jié)果Table 2 Sample quality and comparison results

2.4 駝乳干預(yù)下小鼠轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)的差異性分析

如圖3 所示，NC 組共檢測(cè)出10 929 個(gè)基因，ET 組測(cè)出11 170 個(gè)基因，CM 組11 026 個(gè)基因，ET+CM 組10 750 個(gè)基因。

圖3 基因量化維恩圖Fig.3 Gene quantification Venn diagram

采用edgeR 對(duì)差異基因進(jìn)行篩選，篩選條件為差異倍數(shù)（log2 fold change）＞1，P＜0.05。結(jié)果如圖4 所示，NC 組與ET 組相比，共檢測(cè)出4 105 個(gè)差異基因，其中2 250 個(gè)基因上調(diào)，1 855 個(gè)基因下調(diào)。ET 組與ET+CM 組相比，篩選到1 426 個(gè)基因，其中673 個(gè)基因上調(diào)，753 個(gè)基因下調(diào)。NC 組與ET+CM 組相比，共檢測(cè)出3 958 個(gè)差異基因，其中1 748 個(gè)基因上調(diào)，2 210 個(gè)基因下調(diào)。NC 組與CM 組相比較，共檢測(cè)出2 368 個(gè)差異基因，其中891 個(gè)基因上調(diào)，1 477 個(gè)基因下調(diào)。

圖4 兩組間差異基因表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖Fig.4 Statistical graph of differential gene expression between the two groups

2.5 駝乳干預(yù)下小鼠轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因的功能分析

為了進(jìn)一步了解差異表達(dá)基因的功能，確定其在分子水平上的作用，針對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分析，發(fā)現(xiàn)各功能的基因注釋數(shù)目有明顯差異。結(jié)果如圖5 所示，在生物過(guò)程中，NC 與ET 組和ET+CM 與ET 組差異基因注釋到細(xì)胞過(guò)程的最多，分別為2 986、973 條。在細(xì)胞組分中，注釋到細(xì)胞部分的最多，分別為3 435、1 148 條。在分子功能中，注釋到結(jié)合的基因最多，分別為3 049、1 053 條。進(jìn)一步進(jìn)行GO 富集分析，發(fā)現(xiàn)NC 組與ET 組的差異基因主要參與炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激、脂多糖反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程。ET組和ET+CM 組的差異表達(dá)基因主要參與炎癥反應(yīng)、脂多糖反應(yīng)、含氧化合物的反應(yīng)、細(xì)胞因子的反應(yīng)、脂質(zhì)代謝過(guò)程、白細(xì)胞遷移等生物學(xué)過(guò)程，結(jié)果如表3 所示。

圖5 組間GO 注釋圖Fig.5 GO annotation diagram between groups

表3 ET 組與ET+CM 組差異基因GO 富集分析Tabel 3 Significant terms of GO analysis for ET vs ET+CM differential gene

進(jìn)一步，將差異表達(dá)基因進(jìn)行了KEGG 功能富集分析。NC 與ET 組的差異基因顯著富集在MAPK 信號(hào)通路（92 個(gè)差異基因）、Insulin resistance（44 個(gè)差異基因）、AMPK 信號(hào)通路（44 個(gè)差異基因）、Pathways in cancer（146 個(gè)差異基因）等。ET 與ET+CM 組差異基因顯著富集在MAPK信號(hào)通路（24 個(gè)差異基因）、Oxidative phosphorylation（22 個(gè)差異基因）、NF-κB 信號(hào)通路（14 個(gè)差異基因）、Toll-like（11 個(gè)差異基因）等。下面主要對(duì)ET 與ET+CM 組富集在MAPK、Toll-like 和NF-κB 通路上的差異基因進(jìn)行分析，找出駝乳干預(yù)急性酒精性肝損傷的關(guān)鍵基因。

在MAPK 信號(hào)通路中，低表達(dá)的白細(xì)胞分化抗原14（CD14）基因表明了駝乳參與了ALD 小鼠的免疫應(yīng)答，低表達(dá)的IL-1R1、TNFR1 基因表明了駝乳調(diào)節(jié)ALD 小鼠的炎癥因子，低表達(dá)的ERK1/2、JIP3、TGFβ、TGFβR、ATF-2、PIK3R1 基因表明了駝乳通過(guò)抑制細(xì)胞分化或凋亡從而調(diào)控ALD 小鼠的免疫應(yīng)答。

在Toll-like 信號(hào)通路中，低表達(dá)的IL-1R1、IL-6、TNFR1、TLR5 和TLR9 基因表明了駝乳產(chǎn)生大量抗炎因子從而抑制ALD 小鼠的炎癥反應(yīng)，低表達(dá)的CD14 基因表明了駝乳參與了ALD 小鼠的免疫調(diào)節(jié)，ERK1/2 和PIK3R1 基因表明了駝乳通過(guò)抑制細(xì)胞分化或凋亡從而調(diào)控ALD 小鼠的免疫應(yīng)答。

在NF-κB 信號(hào)通路中，低表達(dá)的CXCL1、IL-1R1、TNFR1 表明了駝乳調(diào)節(jié)ALD 小鼠的炎癥因子，Bcl2a1d 基因表明了駝乳通過(guò)抑制細(xì)胞分化或凋亡從而調(diào)控ALD 小鼠的免疫應(yīng)答。

2.6 轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的準(zhǔn)確性以及確定駝乳對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用是否與MAPK、Tolllike 和NF-κB 炎癥通路相關(guān)，選取CD14、TLR5、TLR9 等6 個(gè)代表性差異基因進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR 測(cè)定。結(jié)果如圖7 所示，與NC 組相比，ET組的CD14、IL-1β、IL-6、TLR5 和TLR9 表達(dá)量顯著上升（P＜0.05），IL-10 表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。與ET 組相比，ET+CM 組的CD14、IL-1β、IL-6、TLR5 和TLR9 表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），IL-10 表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）。說(shuō)明駝乳通過(guò)調(diào)控MAPK、Toll-like 和NF-κB 通路上的基因，緩解急性酒精性肝損傷。

圖7 差異基因表達(dá)量Fig.7 Differential gene expression

3 討論

肝臟是人體最重要的代謝器官，通過(guò)吞噬和解毒功能對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用。攝入大量酒精會(huì)導(dǎo)致肝臟出現(xiàn)一系列損害性病變。如何安全有效的預(yù)防和治療酒精性肝病已成為各國(guó)科研人員的研究熱點(diǎn)。大量研究表明，ALD 的發(fā)病機(jī)制與乙醇及其代謝物對(duì)肝臟的毒性、脂質(zhì)代謝紊亂、氧化應(yīng)激、炎癥介質(zhì)、免疫反應(yīng)等多種因素有關(guān)[17-18]。此外，酒精誘導(dǎo)的肝損傷發(fā)生在多個(gè)層面，從先天免疫細(xì)胞到肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、肝細(xì)胞，該過(guò)程需要多條肝細(xì)胞信號(hào)通路的相互作用[19]。ALT 和AST 是評(píng)估肝細(xì)胞損傷的重要指標(biāo)之一，通過(guò)測(cè)定肝組織中ALT 和AST 活性可以判斷肝損傷程度。炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致酒精性肝損傷的典型病理機(jī)制。IL-10 是一種抗炎和免疫抑制細(xì)胞因子，TNF-α 是一種促炎細(xì)胞因子，主要由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生，參與炎癥和免疫反應(yīng)過(guò)程。IL-6 是一種同時(shí)促進(jìn)炎癥和肝再生的多效性細(xì)胞因子，主要調(diào)節(jié)抗凋亡基因轉(zhuǎn)錄和肝再生。IL-1β 通過(guò)誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞趨化因子，加重炎癥反應(yīng)。因此，通過(guò)測(cè)定血清IL-10、TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平綜合分析肝臟因炎癥反應(yīng)發(fā)生的損傷程度。結(jié)果表明，駝乳不僅可以顯著降低肝組織中AST 和ALT 水平、還可以顯著降低血清中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平，提高IL-10水平。表明駝乳能夠抑制酒精引發(fā)的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮對(duì)肝臟的保護(hù)作用。

基于生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果，進(jìn)一步研究駝乳改善酒精性肝損傷的作用機(jī)制，對(duì)各組小鼠肝組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，NC 與ET 組共獲得4 105 個(gè)差異基因，ET 與ET+CM 組共獲得1 426 個(gè)差異基因，挑選6 個(gè)差異基因經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 驗(yàn)證，結(jié)果與測(cè)序結(jié)果表達(dá)一致，說(shuō)明了本次測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確可靠。在差異表達(dá)基因的GO 富集分析中發(fā)現(xiàn)，ET 與ET+CM 組大多數(shù)差異基因顯著富集到免疫炎癥相關(guān)的功能上，如基因CXCL1 和CD14 分別富集到GO term 的免疫應(yīng)答和細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)，且共同富集到炎癥反應(yīng)。

在KEGG 富集分析中，ET 與ET+CM 組差異基因顯著富集到MAPK、Toll-like、NF-κB 信號(hào)等免疫炎癥相關(guān)的信號(hào)通路。已有的研究表明，Tolllike 信號(hào)通路與MAPK 信號(hào)通路和NF-κB 信號(hào)通路密切相關(guān)，通過(guò)抑制Toll-like 信號(hào)通路，可以進(jìn)一步抑制MAPK 信號(hào)通路和NF-κB 信號(hào)通路，從而緩解酒精引發(fā)的一系列病理反應(yīng)，發(fā)揮對(duì)肝臟的保護(hù)作用[20]。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）在細(xì)胞凋亡和炎癥因子信號(hào)傳遞過(guò)程中起著重要的作用。主要包含細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）和p38 MAPK 這3 條途徑[22]。本研究結(jié)果顯示，在ET 組中起到信號(hào)傳導(dǎo)作用的基因ERK 表達(dá)顯著上調(diào)，效應(yīng)因子TNFR1、JIP3、ATF-2 和TGF-β 基因表達(dá)上調(diào)，而經(jīng)駝乳預(yù)處理后均顯著下調(diào)。MAPK1（ERK2）和MAPK3（ERK1）是與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化、分化相關(guān)的MAPK[22]。MAPK 被酒精刺激后可釋放炎性因子TNF-α，進(jìn)而加劇炎癥反應(yīng)[23]。TNF-R1 作為T(mén)NFα 受體，與TNF-α 結(jié)合經(jīng)一系列反應(yīng)形成多種復(fù)合物激活JNK[24-25]，被激活的JNK 靶向JIP3（JNK信號(hào)通路上的支架蛋白）、ATF-2 參與Toll-like 受體（TLR）的調(diào)控，TLR 識(shí)別炎性細(xì)胞因子，發(fā)生炎癥反應(yīng)[26]。本研究中，駝乳降低了酒精引發(fā)的TNF-R1、JIP3 和ATF-2 的高表達(dá)。研究表明，敲除JIP3 基因可降低氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，從而改善NAFLD 小鼠肝損傷[26]。此外，Stebbins 等[27]發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制JNK-JIP 位點(diǎn)以劑量依賴性方式抑制JNK 底物的磷酸化，從而阻斷肝損傷。Deng 等[28]研究表明，JNK 基因敲除降低了HCC 細(xì)胞在體外的侵襲和淋巴黏附能力，同時(shí)在基因和蛋白質(zhì)水平下調(diào)了ATF-2 的表達(dá)，認(rèn)為ATF-2 是肝癌預(yù)后的潛在標(biāo)志物。由此可知，駝乳通過(guò)調(diào)控MAPK 信號(hào)通路，改善酒精引發(fā)的炎癥反應(yīng)以及肝細(xì)胞凋亡和損傷。

近期研究表明，除TLR3 和IL-1 受體外，所有TLR 均以MyD88 作為銜接分子，激活NF-κB 和MAPK 通路[29]。本研究結(jié)果顯示，攝入酒精使Tolllike（CD14、TLR5、TLR9、ERK1/2、PIK3R1）和NFκB 信號(hào)通路（CXCL1、TNFR1、IL-1R1、Bcl2a1）基因的顯著上調(diào)，而在ET+CM 組中均顯著下調(diào)。此外，本研究PCR 結(jié)果表明駝乳干預(yù)顯著降低CD14、TLR5、TLR9 的表達(dá)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，TLR9 信號(hào)的激活可誘導(dǎo)肝細(xì)胞產(chǎn)生CXC 趨化因子配體1（CXCL1），從而誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞進(jìn)入肝臟[30]。CXCL1 是炎性趨化因子，可促進(jìn)炎癥因子釋放并加重炎癥反應(yīng)[31]。在免疫相關(guān)的差異基因中，我們還關(guān)注到重要的促炎因子IL-6，它與可溶性IL-6 受體結(jié)合，然后與膜受體b 鏈gp130 結(jié)合，激活PI3K/Akt 通路。而PIK3R1 是PI3K 的調(diào)節(jié)亞基，所以駝乳通過(guò)抑制炎癥因子IL-6 的產(chǎn)生間接抑制PIK3R1 的表達(dá)。趙宏等[32]發(fā)現(xiàn)巴亞格七味散可通過(guò)抑制PIK3R1 表達(dá)，來(lái)減輕酒精性肝病模型小鼠肝組織損傷。還發(fā)現(xiàn)肝癌中PIK3R1 表達(dá)顯著上調(diào)，沉默PIK3R1 可抑制HCC 細(xì)胞系增殖、遷移并加速凋亡[33]。IL-1 家族是一個(gè)重要的促炎因子家族，可導(dǎo)致炎癥并與急性和慢性炎癥密切相關(guān)。IL1R1 作為IL-1 的受體，能夠介導(dǎo)IL-1 的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活JNK/c-Jun 和NF-κB p65 信號(hào)通路并加重炎癥反應(yīng)程度[34]。研究表明，肝細(xì)胞中缺失IL-1R1 可保護(hù)小鼠免受急性肝衰竭，降低肝臟炎癥細(xì)胞因子和趨化因子水平，以及減輕中性粒細(xì)胞因損傷而滲入肝臟[35]。本研究結(jié)果如上所述，駝乳能夠調(diào)控Toll-like 和NF-κB 信號(hào)通路抑制酒精誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和肝臟炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)肝臟免受酒精的損傷。

4 結(jié)論

本研究表明，駝乳能夠有效降低肝臟中AST、ALT 的酶活力并可以降低血清中IL-6、IL-1β、TNF-α 水平，提高IL-10 水平。然后通過(guò)生物信息學(xué)分析，發(fā)掘出駝乳干預(yù)急性酒精性肝損傷的顯著差異表達(dá)基因和重要的免疫炎癥信號(hào)通路以及免疫應(yīng)答關(guān)鍵基因，為預(yù)防酒精性肝損傷研究提供了新的視角，為進(jìn)一步研發(fā)保肝護(hù)肝功能性食品奠定了理論基礎(chǔ)。