曹康寧，彭幫柱

（華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院 武漢 430070）

牡丹作為中國傳統(tǒng)的“藥食兩用”植物，其花和根具有清熱解毒、活血化瘀等功效，是藥用主體。牡丹籽是藥用植物牡丹花的種子，一直作為中藥材丹皮的副產(chǎn)物被丟棄，尚未得到合理的利用。近年來，有學者的研究表明，牡丹籽中營養(yǎng)成分較高，含有豐富的不飽和脂肪酸資源，其中α-亞麻酸的含量高達43%，約是橄欖油的80 倍、菜籽油的5 倍[1]，具有抗衰老、抗真菌、抗發(fā)炎及預防心血管疾病的作用[2-5]。此外，牡丹籽中還含有萜類[6-7]、芪類[8-9]、黃酮類[9]等成分，具有巨大的開發(fā)潛力。

自2011 年牡丹籽油被列為新資源食品后，牡丹籽的開發(fā)利用受到廣泛關注。目前市場上牡丹籽的產(chǎn)品仍以籽油為主，其它相關食品未見報道。原因可能是牡丹籽具有苦味，易引起牡丹籽油及其產(chǎn)品的苦澀味，因此限制了其加工利用。至今，對牡丹籽的研究主要集中于牡丹籽中營養(yǎng)成分及生理功能研究，對其苦味物質研究較少。鑒于此，本研究采用有機溶劑萃取與感官評價相結合的方法，利用超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜（UPLC-HRMS）對牡丹籽中的苦味物質進行分離與鑒定，以期為牡丹籽苦味成分解析和脫苦機制研究與開發(fā)利用提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油用牡丹籽，在2020 年10 月上旬采摘于湖北省宜昌市某產(chǎn)業(yè)園區(qū)，顆粒飽滿，成熟充分。

分析級氫氧化鈉、正己烷、正丁醇、乙醇、鹽酸奎寧，購買于國藥集團化學試劑有限公司；色譜級甲酸、乙腈，購于武漢弗頓科技有限公司；食品級檸檬酸，購于商丘耕道電子商務有限公司；AB-8大孔吸附樹脂，購于源葉生物有限公司。

1.2 儀器與設備

SB-400 DTY 超聲清洗機，購于寧波新芝生物科技股份有限公司；LGJ-10 真空冷凍干燥機，購于北京松源華興科技發(fā)展有限公司；RE-52AA旋轉蒸發(fā)儀，購于上海亞榮生化儀器廠；電熱鼓風干燥箱，購于上海一恒科學儀器有限公司；Thermo QE PLUS 四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜、Ulti-Mate 3000 高效液相色譜儀，購于美國Thermo Fisher 公司。

1.3 方法

1.3.1 牡丹籽前處理 將脫殼后的牡丹籽按料液比1∶5（m/V）置于質量濃度為0.004 g/mL、溫度為100 ℃NaOH 溶液中，熱燙處理3 min，玻璃棒攪拌去皮后用清水洗凈。將去皮牡丹籽置于60 ℃熱風干燥至恒重，粉碎后備用。

1.3.2 正己烷和水溶液浸提 稱取處理好的牡丹籽粉末50 g，用250 mL 正己烷室溫浸提4 次。每次浸提12 h，合并濾液后真空旋轉蒸發(fā)獲得組分F-Ⅰ，殘渣放于60 ℃熱風干燥12 h。

將殘渣按照料液比為1∶20（m/V）置于50 ℃、pH 值為4 的檸檬酸水溶液中，超聲處理6 h，功率為350 W，頻率為40 kHz。將脫苦處理的上清液真空旋轉蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥后獲得組分F-Ⅱ；超聲處理后殘渣經(jīng)60 ℃熱風干燥12 h，獲得組分F-Ⅲ。

1.3.3 正丁醇萃取 將組分F-Ⅱ用蒸餾水溶解至100 mL 后，用100 mL 飽和正丁醇溶液萃取3次，合并正丁醇萃取部分，70 ℃真空旋轉蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥，獲得F-Ⅱ-1 組分；水相部分70 ℃真空旋轉蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥，獲得組分F-Ⅱ-2。

1.3.4 大孔樹脂純化 AB-8 大孔樹脂經(jīng)預處理[10]后，采用濕法裝柱填充到層析柱（30 mm×200 mm）中，填充量為50 mL。將F-Ⅱ-1 組分溶解于10 mL 蒸餾水并上樣至AB-8 大孔樹脂層析柱中，依次用蒸餾水、30%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、100%乙醇進行梯度洗脫，洗脫速度為4 mL/min，洗脫體積為10 倍柱體積（500 mL）。收集洗脫液，真空旋轉蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥，獲得組分F-Ⅱ-1-MR1、F-Ⅱ-1-MR2、F-Ⅱ-1-MR3、F-Ⅱ-1-MR4 和F-Ⅱ-1-MR5。

1.3.5 感官評價方法 篩選7 位（4 女3 男）經(jīng)苦味感官訓練的人員進行評價，年齡在20～35 歲之間。以鹽酸奎寧溶液為參考評估苦味強度（表1），將1 mL 不同濃度的鹽酸奎寧溶液呈現(xiàn)給帶鼻夾的感官小組成員，并要求在口中短暫旋轉樣品，然后將其吐出，用蒸餾水漱口。

表1 苦味評分等級及分值Table 1 Grade and scores of bitter

組分F-Ⅰ和F-Ⅲ直接感官評定外，其余組分用4%的乙醇溶液溶解并定容至200 mL，然后用于感官評價。感官小組成員以鹽酸奎寧溶液為參照，在0～10 之間評價苦味[11]。本次感官分析采用的溶劑水均為蒸餾水，采用3 位數(shù)隨機標注樣品編號，試驗樣品感官評定重復3 次，每次間隔10 min。

1.3.6 苦味得率的計算 苦味組分得率按照公式（1）進行計算。

式中：X——苦味組分質量，g；X0——牡丹籽粉末質量，g。

1.3.7 液相色譜-質譜分析

1.3.7.1 液相色譜分析條件 將苦味組分F-Ⅱ-1-MR2 和F-Ⅱ-1-MR3 分別用超純水和50%乙醇溶解，過0.22 μm 濾膜，備用。采用Agilent Eclipse Plus C18 色譜柱（2.1 nm×100 nm，1.8 μm）；流動相：0.1%甲酸水溶液（A）和乙腈（B）；流速0.3 mL/min；進樣量1 μL；柱溫30 ℃；洗脫梯度：0～5 min，5%～10%（B）；5～25 min，10%～45%（B）；25～30 min，45%～75%（B）；30～35 min，75%～95%（B）；35～36 min，95%～5%（B）；36～40 min，5%（B）。

1.3.7.2 質譜分析條件 采用電噴霧離子源（ES I）；掃描模式：負離子模式；掃描范圍：m/z 80～1 200；毛細管電壓：2 500 V；錐孔電壓：440 V；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流速：600 L/h；碎裂電壓：30 和50 eV。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理 試驗結果用平均值±標準差表示，重復3 次。用Origin 2018 軟件對數(shù)據(jù)進行處理繪圖。

2 結果與分析

2.1 感官評價及苦味得率結果

各組分物質的苦味分值及得率見表2。

表2 感官評價結果及苦味組分得率Table 2 Sensory evaluation results and the yield of bitter components

正己烷提取組分F-Ⅰ為油狀層，除去揮發(fā)溶劑后經(jīng)感官品嘗無苦味，該提取物為牡丹籽油。正己烷殘渣經(jīng)水提獲得的組分F-Ⅱ苦味加重，而水提殘渣F-Ⅲ無明顯苦味，說明pH=4 的水溶液能夠有效提取牡丹籽中的苦味物質。用飽和正丁醇進一步萃取組分F-Ⅱ，獲得正丁醇組分F-Ⅱ-1 和水層組分F-Ⅱ-2，且組分F-Ⅱ-2 顯示出甜味，說明牡丹籽苦味物質聚集在正丁醇層F-Ⅱ-1中。通過AB-8 大孔樹脂對正丁醇組分F-Ⅱ-1 進一步分離純化，獲得5 個組分。組分F-Ⅱ-1-MR1具有輕微甜味，未顯示明顯苦味；組分F-Ⅱ-1-MR2 是一種白色粉末狀物質，得率最高，苦味程度最高；組分F-Ⅱ-1-MR3 是一種褐色粉末狀物質，也具有苦味；F-Ⅱ-1-MR4 和F-Ⅱ-1-MR5 所得凍干量很少，經(jīng)感官評價未顯示出明顯苦味。

經(jīng)感官評價及得率可見，牡丹籽中的苦味物質主要集中在30%和50%乙醇洗脫液中，即組分F-Ⅱ-1-MR2 和組分F-Ⅱ-1-MR3 中，該方法實現(xiàn)了對牡丹籽中苦味組分的有效分離，獲得了較高純度的牡丹籽苦味組分，有利于下一步的分析與鑒定。

2.2 苦味組分鑒定

2.2.1 組分F-Ⅱ-1-MR2 鑒定 F-Ⅱ-1-MR2 為白色粉末，是苦味物質提取率最高的組分。采用UPLC-HRMS 對其進行分析，共鑒定出7 個化合物，其中化合物C1-C6 均為單萜類化合物，見表3。

圖1 組分F-Ⅱ-1-MR2 的總離子圖Fig.1 Total ion current chromatograms of F-Ⅱ-1-MR2

化合物C1，保留時間為1.94 min，在m/z 405.1396[M-H]-處產(chǎn)生分子離子峰，根據(jù)元素組成計算其分子式為C16H24O9，在m/z 359，197，178 處存在3 個二級質譜碎片。其中，分子離子m/z 405.1396[M-H]-脫去一分子甲酸（46 u）得到m/z 359[M-H-HCOO-]-，碎片m/z 197.08 [M-H-HCOOGlu]-為去甲酸后再斷裂失去1 分子葡萄糖基獲得，碎片m/z 179 [M-H-HCOO-Glu-H2O]-對應失去1 分子水。經(jīng)過對比保留時間和文獻碎片[12-13]，初步斷定化合物C1 為牡丹酮1-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物C2，保留時間為7.06 min，MS 圖顯示該物質在m/z 495.1505 [M-H]-處有分子離子峰，并在MS2 質譜上存在碎 片m/z 495，465，281，165，137，推測其分子式為C23H28O12。碎片m/z 465[M-H-CH2O-]-與分子離子差30 u，由分子脫去葡萄糖基上的甲氧基（30 u）獲得，m/z 333[M-HGlu-]-與分子離子脫去一分子葡萄糖基有關，在m/z 165 處的碎片被鑒定為芍藥苷類特征碎片——蒎烷基本骨架，m/z 137 對應斷裂后所剩的對羥基苯甲酸結構，與文獻[14]，[15]所述氧化芍藥苷二級質譜碎片一致，結構式見圖3a，故鑒定化合物C2為氧化芍藥苷。

化合物C3、C5 和C6 的出峰時間分別在9.25，10.16 和14.45 min，在ESI（-）模式下，出現(xiàn)強度不同的甲酸加和離子峰m/z 525.1607 [M+HCOO]-，即均存在m/z 479[M-H]-分子離子峰，推測為芍藥苷及其異構體。其中，化合物C5 的MS2質譜碎片分別 為m/z 449，327，165，121（見 圖2a），碎片m/z 449[M-H-CH2O]-由去甲酸分子m/z 479[M-H]-失去葡萄糖基中的甲氧基（30 u）形成，繼而失去1 個苯甲酸（122 u）形成特征碎片m/z 327[M-H-CH2O-C7H6O2-]-；m/z 327[M-H]-丟失1分子葡萄糖基獲得蒎烷基本骨架結構的碎片（m/z 165）[15]，最后蒎烷基本骨架斷裂，脫去1 個苯甲酰取代基，產(chǎn)生m/z 121 [M-H]-離子碎片，與文獻[16-17]所述芍藥苷質譜裂解規(guī)律一致，結構式見圖3b，確定化合物C5 為芍藥苷。根據(jù)出峰時間順序，推斷化合物C3 可能為芍藥內酯苷（離子碎片見圖2b，結構式見圖3c），化合物C6 為牡丹皮苷I。

圖2 組分F-Ⅱ-1-MR2 部分化合物的二級質譜圖Fig.2 MS2 spectra generated from some bitter compounds of F-Ⅱ-1-MR2

圖3 組分F-Ⅱ-1-MR2 部分單萜苷類化合物的結構式Fig.3 Structure of some monoterpene glycosides in F-Ⅱ-1-MR2

圖4 組分F-Ⅱ-1-MR3 的總離子圖Fig.4 Total ion current chromatograms of F-Ⅱ-1-MR3

化合物C4，保留時間為9.47 min，MS 圖顯示該物質具有m/z 687.2128 [M-H]-離子碎片，MS2圖中含有特征碎片m/z 593，471，323，165，121，與分子式C30H40O18相對應。該物質具有單萜蒎烷骨架特征碎片m/z 165，推測其為芍藥苷類物質。經(jīng)與文獻[18-19]碎片對比，初步斷定為異麥芽芍藥苷（isomaltopaeoniflorin）。

化合物C7，保留時間為31.04 min，MS 質譜圖顯示高豐度的碎片m/z 265.16[M-H]-，含有N 元素，經(jīng)Xcalibur 軟件計算該物質分子式為C5H17O3N10。具體結構待進一步確定。

萜類化合物中具有內脂、內縮醛、糖苷鍵等可以形成螯合物而具有苦味。曹煌[20]通過電子舌仿生技術對白芍藥材樣品和不同濃度芍藥苷單體進行識別，結果顯示其滋味均顯示苦味，該結果與Zhang 等[21]報道一致。組分F-Ⅱ-1-MR2 得率最高，鑒定出的化合物中以芍藥苷類為主，推測芍藥苷類化合物是牡丹籽的主要苦味成分。

2.2.2 組分F-Ⅱ-1-MR3 鑒定 從組分F-Ⅱ-1-MR3 共鑒定出21 種化合物，化合物C3、C5、C6 和C7 也存在于F-Ⅱ-1-MR2 組分中，化合物中C13屬于單萜類化合物，C15 為有機酸類，C17、C18 為芪類化合物，C19-C24 為三羥基脂肪酸類化合物，其余均為黃酮類化合物，見表3。

化合物C8，保留時間為11.02 min，MS 圖顯示該物質具有m/z 597.1821 [M-H]-離子碎片，推測分子式為C27H34O15，根據(jù)ChemSpider 數(shù)據(jù)庫匹配，推測該物質為根皮素3'，5'-Di-葡萄糖苷。

化合物C9-C11 的分子質量和保留時間均不同，但它們都具有木犀草素類特征碎片m/z 285，因此被鑒定為木犀草素糖苷類化合物。化合物C9的保留時間為11.77 min，MS 圖中存在高豐度碎片m/z 655.1009 [M-H]-，為該物質準分子峰，確定分子式為C28H32O18。MS2圖中含有特征碎片m/z 447，285，151，133，推測其為木犀草苷類化合物?；衔顲10，保留時間為13.89 min，在m/z 477.1030 [M-H]-存在分子離子峰，與分子式C22H22O12對應?；谄渌x子片段m/z 314，285，271，257，243，151，與ChemSpider 數(shù)據(jù)庫進行比對，鑒定其為6-甲氧基木犀草素-7-葡萄糖苷或異鼠李素3-O-葡萄糖苷[22]。其中m/z 285 為苷元離子峰，比分子離子m/z 477.1030 [M-H]-少192 u，表明丟失1 分子葡萄糖和1 分子甲氧基?；衔顲11 保留時間為13.93 min，于m/z 447.2593[M-H]-處存在主離子峰，經(jīng)計算其分子式為C21H20O11。其二級質譜出現(xiàn)質荷比為285 苷元離子碎片，由m/z 447[M-H-Glu]-失去1 個葡萄糖基得到，鑒定化合物C11 為木犀草苷[23]。

化合物C12，保留時間為14.30 min，在ESI（-）模式下，其MS 圖中產(chǎn)生了一個m/z 449.1082[M-H]-的離子碎片，對其二級質譜圖下進行分析，得到質荷比為449，287，269，151，135 等碎片。其中，碎片m/z 449 脫去1 分子葡萄糖基得到m/z 287.06 [M-H-Glu]-，再脫去1 分子水得到m/z 269.05 [M-H]-，通過RDA 裂解，得到碎片m/z 151.00[M-H-Glu-H2O-C8H6O]-和碎片m/z 135.04[M-H-Glu-H2O-C8H6O-O]-。通過對比文獻[24]和Pubchem 數(shù)據(jù)庫，初步鑒定為黃酮類物質馬里苷（marein）。

化合物C13，保留時間為14.99 min，MS 圖顯示該物質在m/z 509.1660 [M-H]-處產(chǎn)生主離子峰，推測分子式為C24H30O12，存在MS2質譜碎片m/z 463，331，161，121。通過查閱文獻[18]，推測其為牡丹皮苷D。

化合物C14，保留時間為16.87 min，分子式為C15H12O6，在ESI（-）模式下，在m/z 287.0557 [MH]-產(chǎn)生分子離子片段，MS2 質譜圖中存在m/z 287，151，135，107 等離子碎片（見圖5a），碎片m/z 287[M-H]-脫去1 分子水，再經(jīng)RDA 裂解，產(chǎn)生碎片m/z 151 [M-H-H2O-C8H6O]-，m/z 135 由m/z 151 脫去1 分子氧所得。向進樂等[25]研究表明牡丹中存在圣草酚類化合物，因此鑒定化合物C14 為圣草酚。

圖5 組分F-Ⅱ-1-MR3 部分化合物的二級質譜圖Fig.5 MS2 spectra generated from some bitter compounds of F-Ⅱ-1-MR3

化合物C15，保留時間為17.27 min，MS 質譜圖顯示該物質于m/z 121.0281[M-H]-處存在準分子離子峰，鑒定為苯甲酸。

化合物C16，保留時間為17.46 min，MS 圖中于m/z 285.0401 [M-H]-存在分子離子，與分子式C15H10O6匹配，MS2 質譜圖存在m/z 285，151，133，107 等離子碎片（見圖5b），其中碎片m/z 151 [M-H-C8H6O2]-是黃酮母核在A1，3與B1，3處經(jīng)RDA 裂解所得，m/z 151 失去1 分子水得到m/z 133 [M-H-H2O]-，與文獻所報道一致[24]，初步鑒定為木犀草素。

化合物C17，保留時間為17.83 min，MS 圖顯示該物質存在m/z 227.1281 [M-H]-分子離子峰，與分子式C15H10O6對應，在MS2質譜圖中產(chǎn)生m/z 227，185，143，117 等離子碎片（見圖5c），其中m/z 143 為苯環(huán)裂解重排后的特征離子碎片，初步鑒定為白藜蘆醇[26]。

化合物C18，保留時間19.24 min，存在m/z 453.0773 [M-H]-分子離子碎片，推測其分子式為C28H22O6，含有二級質譜碎片m/z 453，435，359，347，253，225 等（見圖5d），通過與Pubchem 信息庫進行比對，初步鑒定為ε-葡萄素。

化合物C19，保留時間為19.82 min，MS 圖顯示該物質于m/z 327.2171 [M-H]-存在分子離子峰，MS2 圖產(chǎn)生m/z 327，291，229，211，171 等特征離子碎片，與分子式C18H32O5對應。結合參考文獻[27]和ChemSpider 數(shù)據(jù)庫對比，初步斷定為9，12，13-三羥基-10，15-十八碳二烯酸?；衔顲22（保留時間為21.81 min）的分子離子峰和二級質譜碎片均與化合物C19 相同，推測為其同分異構體——（10E，15Z）-9，12，13-三羥基-10，15-十八碳二烯酸。

化合物C20，保留時間為21.23 min，于m/z 329.2328 [M-H]-處存在分子離子峰，基于二級質譜碎片m/z 329，229，211，171，139，推測分子式為C18H34O5。結合參考文獻[27]和ChemSpider 數(shù)據(jù)庫對比，初步斷定為該化合物為（15Z）-9，12，13-三羥基-15-十八碳烯酸?；衔顲21（保留時間為21.48 min）具有相同的準分子離子峰，推測其為（15Z）-9，12，13-三羥基-15-十八碳烯酸同分異構體。

化合物C23，保留時間為26.83 min，MS 圖中存在m/z 309.3873 [M-H]-分子離子峰，MS2質譜圖含有特征碎片m/z 309，291，221，195，179，與分子式C18H34O4相對應。經(jīng)Pubchem 和ChemSpider 數(shù)據(jù)庫對比，鑒定為13（S）-HpOTrE。

化合物C24，保留時間為30.01 min，MS 質譜圖具有m/z 293.1790 [M-H]-分子離子碎片，MS2質譜圖含有特征碎片m/z 293，275，223，195，179，根據(jù)元素組成確定分子式為C18H34O3。經(jīng)Pubchem 和ChemSpider 數(shù)據(jù)庫對比，鑒定為13（S）-HOTrE。

黃酮類物質是植物苦澀味的重要來源，組分F-Ⅱ-1-MR3 含有木犀草素及其糖苷類、圣草酚、根皮素、馬里苷等，因此黃酮類物質也是牡丹籽苦味物質成分。此外，組分F-Ⅱ-1-MR3 還含有三羥基脂肪酸類物質，有研究發(fā)現(xiàn)9，12，13-三羥基-10，15-十八碳二烯酸是全麥面包屑的苦味成分[28]，主要是由亞油酸氧化而來。據(jù)報道，由亞油酸與大豆制劑孵育產(chǎn)生的9，10，13-和9，12，13-三羥基十八烯酸的混合物可引出苦味[29]。Hamberg 等[30]認為，三羥基酸異構體味覺閾值可能大不相同，推測啤酒中9，10，13 和9，12，13-三羥基十八烯酸的異構體可能是導致啤酒苦味的原因，特別是9（s），12（s），13（s）-三羥基-10（E）-十八烯酸等主要三羥基酸異構體。趙騰飛等[31]鑒定出化合物9，10，13-三羥基-11（E）-十八烯酸和9，12，13-三羥基-（E）-十八烯酸是白酒中呈苦味特征的化合物。因此推測三羥基脂肪酸也可能是牡丹籽的苦味來源之一。

3 結論

本研究通過有機溶劑萃取結合大孔樹脂純化，分離和制備了牡丹籽苦味組分，感官評價結果表明牡丹籽苦味成分主要富集在30%和50%乙醇洗脫液中，且30%乙醇洗脫組分是牡丹籽苦味主要成分的所在相。經(jīng)UPLC-HRMS 分析與鑒定，30%乙醇洗脫液中以芍藥苷類化合物為主，包括芍藥苷、芍藥內酯苷、氧化芍藥苷、異麥芽芍藥苷等組分，芍藥苷類化合物是牡丹籽中的主要苦味物質。此外，木犀草素及其糖苷、白藜蘆醇、三羥基脂肪酸等也導致了牡丹籽苦味的產(chǎn)生。該研究可為牡丹籽苦味成分解析和脫苦機制研究奠定了物質基礎，也可為牡丹籽的進一步開發(fā)利用提供技術支持。