程世紀, 匡天瑞, 董可帥, 余 佳

武漢大學(xué)人民醫(yī)院肝膽外科, 武漢 430060

原發(fā)性肝癌位于我國惡性腫瘤發(fā)生率的第4 位,腫瘤致死病因的第3位[1]。近年來,以免疫細胞為基礎(chǔ)的治療方案在延長肝癌患者生存期、降低癌癥轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等方面取得顯著成果。自然殺傷細胞(NK細胞)作為肝內(nèi)主要的淋巴細胞,被認為是抵御肝癌的第一道防線。研究[2]表明,肝癌進展過程中存在NK細胞耗竭,而NK細胞的數(shù)量與患者生存率呈正相關(guān),因此恢復(fù)NK細胞在肝內(nèi)的數(shù)量和功能,或是一種有效的治療方法。本文綜述了NK細胞的生物學(xué)特性、肝癌中的NK細胞及基于NK細胞的免疫治療在肝癌中的研究進展。

1 NK細胞的生物學(xué)特性

NK 細胞是骨髓來源的大顆粒淋巴細胞,占外周血淋巴細胞總數(shù)的 10%～15%,在人體先天性免疫和適應(yīng)性免疫中均發(fā)揮著重要作用。生理狀態(tài)下,NK細胞占肝內(nèi)淋巴細胞數(shù)量的30%～50%,其中80%屬于肝內(nèi)常駐NK細胞,說明NK細胞在肝臟中可能發(fā)揮著更重要的作用。人體NK細胞被分為兩個亞群,即CD56brightCD16dim和CD56dimCD16bright的NK細胞,前者主要分泌細胞因子,后者則表現(xiàn)出更強的細胞毒性以及抗體依賴的細胞毒作用。NK細胞被認為是抵御腫瘤的第一道防線,具有無需預(yù)先致敏、無主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)限制性等屬性[3]。NK細胞可通過穿孔素和顆粒酶的細胞毒作用、抗體依賴的細胞毒作用、分泌炎癥因子以及對外界細胞因子做出反應(yīng)等發(fā)揮作用。此外,研究[4]表明,肝內(nèi)常駐的CD49a+NK細胞具有記憶細胞的特點,即在反復(fù)刺激下,該細胞可以迅速激活并產(chǎn)生大量IFN-γ。NK細胞的功能取決于胞膜上激活受體和抑制受體與靶細胞相互作用,這些受體與特定的配體結(jié)合產(chǎn)生激活或抑制NK細胞的效應(yīng)[5]。肝內(nèi)最主要的抑制性配體是在正常肝細胞上表達的MHC-Ⅰ類分子,其可通過與NK細胞表面的殺傷細胞免疫球蛋白受體(killer cell immunoglobin-like receptor, KIR)結(jié)合,從而避免損傷正常細胞[6]。而腫瘤細胞等下調(diào)MHC-Ⅰ類分子從而躲避CD8+T淋巴細胞的殺傷,此時NK細胞因抑制信號缺失而被激活從而介導(dǎo)腫瘤殺傷。

2 肝癌中的NK細胞

NK細胞對肝癌的監(jiān)測至關(guān)重要,然而肝癌進展過程中,盡管存在異常肝細胞MHC-Ⅰ類分子下調(diào)和NK細胞激活,肝內(nèi)CD56dimCD16bright的NK細胞數(shù)量仍急劇減少,且腫瘤浸潤區(qū)域顯著少于正常區(qū)域并顯示出功能受損[7]。多種因素可導(dǎo)致NK細胞耗竭,其中腫瘤微環(huán)境(tumor micro environment, TME)不可或缺。TME指由周圍血管、免疫細胞、細胞外基質(zhì)等構(gòu)成,腫瘤發(fā)生、生長和轉(zhuǎn)移所處的環(huán)境。在腫瘤生長早期,腫瘤細胞招募和激活免疫細胞及相關(guān)基質(zhì)成分形成抑瘤性炎性微環(huán)境從而阻礙腫瘤進展,而TME能夠改變局部趨化環(huán)境,優(yōu)先招募細胞毒性較小的NK細胞。經(jīng)過持續(xù)的抗原刺激,TME中的NK細胞逐漸耗竭而無法正常發(fā)揮作用[8]。TME中的缺氧環(huán)境、髓源性抑制細胞、吲哚胺2,3-雙加氧酶、前列腺素E2以及TGF-β等共同構(gòu)成抑制性免疫微環(huán)境,進而導(dǎo)致NK細胞功能受抑。同時腫瘤招募的單核/巨噬細胞可通過CD48/2B4誘導(dǎo)NK細胞快速活化,這些NK細胞隨后疲憊并凋亡[9]。此外,腫瘤細胞可上調(diào)表面檢查點及形成可溶性激活配體從而逃避免疫殺傷[10]。通過這些方式,NK細胞抗腫瘤作用被削弱,最終導(dǎo)致腫瘤逃逸。研究[2]表明,外周血和肝內(nèi)NK細胞絕對數(shù)量與肝癌患者的生存率及預(yù)后呈正相關(guān),因此改善患者NK細胞的活性和數(shù)量或可有效地殺死腫瘤細胞,實現(xiàn)治療目的。

3 基于NK細胞的免疫治療

3.1 抗體相關(guān)療法

3.1.1 免疫檢查點抑制劑(ICI) ICI是用于阻斷免疫細胞與腫瘤細胞間的免疫檢查點,從而解除腫瘤抑制作用的單抗類藥物。ICI可通過多種方式影響NK細胞的功能,包括阻斷抑制信號、誘導(dǎo)NK細胞表型轉(zhuǎn)化和通過影響T淋巴細胞及Treg細胞活性間接逆轉(zhuǎn)NK細胞耗竭等。NK細胞表面的非MHC-Ⅰ特異性抑制受體如PD-1、 TIM-3、TIGIT、CD96 等被認為是經(jīng)典免疫檢查點,在腫瘤浸潤的NK細胞表面不同程度的上調(diào)。其中基于PD-1的研究最為廣泛。表達PD-1的 NK細胞顯示出毒性受損及增殖能力降低等特點,而PD-1的阻斷可逆轉(zhuǎn)這些不利影響[11]。臨床研究中,PD-1抑制劑納武利尤單抗治療肝癌的安全性和有效性得到證實[12],但這并非由NK細胞主導(dǎo)。一項研究[13]將PD-1抑制劑與NK細胞輸注聯(lián)用,在非小細胞肺癌患者中實現(xiàn)了有效抗腫瘤活性,且療效優(yōu)于單獨輸注NK細胞,闡明了PD-1阻斷在基于NK細胞的免疫治療的潛力。然而隨著藥物的應(yīng)用,PD-1拮抗劑的耐藥性逐漸顯現(xiàn)。相關(guān)研究[14]表明TIM-3的上調(diào)與PD-1阻斷的耐藥性相關(guān)。肝癌患者NK細胞表達高水平的TIM-3,在與其配體半乳糖凝集素-9(Galectin 9, GAL-9)結(jié)合早期階段促進NK細胞成熟。然而TIM-3的持續(xù)高表達可中斷PI3K/mTORC1/p-S6信號從而導(dǎo)致NK細胞功能障礙[15]。TIM-3單獨阻斷或與PD-1阻斷相結(jié)合已展示出充分的治療潛力。

TIGIT和CD96是同一免疫球蛋白超家族的免疫檢查點,主要負責轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制信號,在腫瘤浸潤的NK細胞上調(diào)。兩者作為抑制受體與激活受體DNAM-1競爭結(jié)合 CD155 ,且親和力高于DNAM-1[16],因而表現(xiàn)出對NK細胞的抑制作用。CD155在健康人群中幾乎不出現(xiàn),而在各類惡性腫瘤中顯著表達,與TIGIT和CD96的結(jié)合可抑制NK細胞的毒性和IFN-γ的產(chǎn)生[17]。Sun等[18]證實阻斷TIGIT可增加外周血NK細胞對體外培養(yǎng)肝癌細胞的毒性,這表明靶向阻斷TIGIT或是恢復(fù)肝癌患者NK細胞功能的有效方法。此外TIGIT通常與PD-1共表達,兩者的聯(lián)合阻斷可以更有效地逆轉(zhuǎn)NK細胞耗竭。臨床研究[19]中,TIGIT抗體維博利單抗被證明具有良好的耐受性,與PD-1抗體聯(lián)合使用,在晚期肺癌患者中實現(xiàn)抗腫瘤活性。表達CD96的NK細胞與肝細胞癌(HCC)患者預(yù)后不良相關(guān)[18],體外研究[20]表明CD96的阻斷可促進NK細胞IFN-γ的釋放和增強抗腫瘤應(yīng)答,但尚缺乏臨床證據(jù)支持。

NK細胞表面MHC-Ⅰ特異性抑制受體如KIR、NKG2A等亦是NK細胞群的典型免疫檢查點,與經(jīng)典免疫檢查點在激活的NK細胞中上調(diào)不同,KIR、NKG2A等在實體腫瘤浸潤的NK細胞中穩(wěn)定表達[21],介導(dǎo)NK細胞免疫耐受的作用不可或缺。然而研究[22]表明,KIR抑制劑及NKG2A抑制劑單藥療效有限,提示研究重點或是聯(lián)合治療方案。

3.1.2 MICA/B特異性抗體 MHC-Ⅰ類相關(guān)蛋白MICA和MICB是構(gòu)成NK細胞的激活配體NKG2DL結(jié)構(gòu)的一部分。正常情況下,NKG2DL僅在腫瘤組織中表達[23],并與NKG2D結(jié)合,介導(dǎo)機體抗腫瘤反應(yīng)。然而腫瘤細胞據(jù)此產(chǎn)生多種逃逸機制,其中最常見的是膜結(jié)合NKG2DL脫落成為可溶性配體,后者可下調(diào)NK細胞表面NKG2D的表達,從而逃避NK細胞攻擊[24]。Ferrari等[25]據(jù)此設(shè)計了MICA/B特異性抗體7C6,該抗體掩蓋了MICA/B的α3結(jié)構(gòu)域,減少癌細胞丟失細胞表面的NKG2DL并增強NK細胞的細胞毒性。Oliviero等[24]將該抗體用于肝內(nèi)膽管癌患者,結(jié)果表明7C6的加入顯著促進了外周血及腫瘤浸潤區(qū)域NK細胞脫顆粒和IFN-γ的產(chǎn)生,為MICA/B抗體的使用提供了證據(jù)支持。

3.1.3 雙特異性抗體(BsAb)與雙特異性殺傷細胞接合劑(BiKE) BsAb是含有2種抗原結(jié)合位點的人工抗體,其中一個識別腫瘤抗原,另一個與NK細胞上CD16結(jié)合。由于CD16有不同的亞型,各亞型與抗體的親和力不同,NK細胞表現(xiàn)出不同的殺傷活性。BsAb中抗CD16成分可通過與CD16更強的相互作用來抵消這些差異并改善NK功能[26]。而與完整的BsAb不同,BiKE僅由兩個相互連接的可變片段組成。與其他類型的抗體相比,BiKE能夠更自由地對抗體片段進行組合,且得益于其小分子特性,BiKE具有更好的實體腫瘤穿透性[27]。綜上所述,BsAb和BiKE將腫瘤抗原與NK細胞連接起來,促進兩者形成免疫突觸,使NK細胞能夠特異性地、更加有效地發(fā)揮抗體依賴的細胞毒作用。除了BsAb和BiKE,多特異性抗體和多特異性殺傷細胞接合劑能為抗原結(jié)合提供更多選擇、更加有效地招募免疫細胞,亦值得探索。

3.2 過繼性細胞療法

3.2.1 自體或同種異體NK細胞移植 自體NK細胞輸注因治療風險低且無后期免疫抑制的需要而最先受到關(guān)注。然而輸注的細胞雖然能夠在體內(nèi)擴增,但因輸注前采集和預(yù)處理對NK細胞功能的影響以及MHC-Ⅰ類分子的抑制作用,過繼的NK細胞無法對腫瘤產(chǎn)生有效作用,同種異體NK細胞成為新選擇。同種異體NK細胞表面KIR與宿主細胞的MHC-Ⅰ不匹配,因而可以被激活。然而由于原代NK細胞的分離和純化存在困難,NK-92細胞系、臍帶血(umbilical cord blood, UCB)和誘導(dǎo)多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSC)來源的NK細胞逐漸受到關(guān)注。目前應(yīng)用最廣泛的是來源于非霍奇金淋巴瘤患者外周血的克隆細胞系NK-92。NK-92屬CD56brightCD16dim的NK細胞,可高表達穿孔素和顆粒酶B,具有高度的細胞毒性[28]。NK-92表達許多激活受體,包括NKG2D、NKp30、NKp46和2B4,而缺乏除KIR2DL4和CD94/NKG2A以外的大多數(shù)抑制受體,使得NK-92細胞的激活得到保障[29]。在良好操作規(guī)范條件下,NK-92細胞可大量擴增使其成為過繼細胞的良好選擇。臨床研究[30]表明,NK-92細胞用于過繼細胞治療是安全的,在晚期癌癥實驗中沒有出現(xiàn)嚴重的不良反應(yīng)并在各類腫瘤模型中顯示出治療潛力。然而NK-92在體內(nèi)擴增困難,且由于輸注前γ射線照射導(dǎo)致其持久性不足等問題使其無法發(fā)揮最大療效。宿主體內(nèi)的單個核細胞可靶向裂解NK-92細胞,進一步降低了其在體內(nèi)的存活率,部分研究[31]表明與IL-15共同給藥似乎能緩解這種排斥反應(yīng)。此外NK-92細胞高度依賴IL-2,而IL-2的重復(fù)注射會帶來諸多不良反應(yīng)。NK-92細胞的變體NK-92MI和NK-92CI細胞,通過基因改造使其表達hIL-2cDNA以合成內(nèi)源性IL-2或是一種有效方法。目前,如何保證NK-92細胞在體內(nèi)的持久性和功能性是該療法應(yīng)用的關(guān)鍵問題。

3.2.2 嵌合抗原受體NK (CAR-NK)細胞 CAR-NK細胞是指將含有抗原識別結(jié)構(gòu)域及激活信號的基因引入NK細胞并表達,使其能與特定腫瘤抗原結(jié)合而被激活的治療方法。隨著CAR-T淋巴細胞在治療上取得一定成果,其局限性如MHC限制性、移植物抗宿主反應(yīng)、脫靶效應(yīng)、神經(jīng)毒性和細胞因子釋放綜合征等隨之顯現(xiàn)[32]。NK細胞無需預(yù)先致敏、無MHC限制等特性,使得CAR-NK細胞可潛在地克服CAR-T淋巴細胞現(xiàn)有的不足,成為過繼治療的新選擇。此外多項臨床試驗[33]表明,NK細胞比基于T淋巴細胞的療法具有更安全的特征?；贑AR的候選靶標包括:磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(glypican-3, GPC3)、NKG2D、AFP、上皮細胞黏附分子、細胞間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)換因子、CD147等。其中GPC3是一種在正常肝臟細胞不表達,而在肝癌組織過度表達的糖蛋白。Yu等[34]開發(fā)了GPC3-CAR-NK-92細胞并證明其可有效殺傷肝癌細胞。Zhao等[35]在此基礎(chǔ)上對CAR進行優(yōu)化,開發(fā)出包含CD8α鉸鏈區(qū)域和4-1BB跨膜結(jié)構(gòu)域的GPC3-O4-CAR,后者可以在NK細胞表面高效、穩(wěn)定地表達,且具有該結(jié)構(gòu)的NK細胞表現(xiàn)出更強的細胞毒性并可以分泌更多IFN-γ。Tseng等[36]以CD147為靶抗原,開發(fā)了用于治療HCC的CD147-CAR-NK細胞并證實該細胞可有效殺死多種肝癌細胞系和抑制PDX小鼠模型中肝癌的進展。該研究在此基礎(chǔ)上進一步探索了GPC3-synNotch誘導(dǎo)的CD147-CAR-NK細胞來減輕腫瘤外毒性,此時的NK細胞僅對高表達GPC3的肝癌細胞表現(xiàn)出殺傷活性。

除了引入CAR,從過繼細胞中去除負調(diào)節(jié)因子亦是基因改造的一種選擇。由CISH基因編碼的細胞因子誘導(dǎo)的SH2蛋白(cytokine-inducible SH2-containing protein, CIS)是NK細胞內(nèi)IL-15信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵負調(diào)節(jié)因子。通過去除NK細胞中的CIS進行代謝重編程,可提高其在體內(nèi)的持久性和抗瘤活性,增加由IL-15介導(dǎo)的JAK-STAT通路信號傳導(dǎo)活性,進而刺激NK細胞增殖[37]。CD38也被認為是NK細胞的負調(diào)節(jié)因子,表達CD38的NK細胞持久性降低并易受到氧化應(yīng)激的影響。通過敲除NK細胞中的CD38相關(guān)基因,與CD38抗體協(xié)同作用,可改善多發(fā)性骨髓瘤患者體內(nèi)NK細胞的持久性并增強抗體依賴的細胞毒作用[38],為增強NK細胞活性提供另一種選擇。

然而,該療法尚面臨未解決的難題,其中最主要的便是NK細胞的擴增困難和體內(nèi)持久性不足?？捎糜诒磉_CAR的NK細胞有多種來源,其中iPSC來源的細胞有望解決這一問題。iPSC指由數(shù)個重編程基因?qū)塍w細胞并逐步誘導(dǎo)獲得的,具備無限增殖和多向分化能力的人造胚胎干細胞。iPSC可進行精確的基因修飾,有效地分化以產(chǎn)生成熟的NK細胞即iPSC-NK細胞。與其他來源的NK細胞相比,iPSC-NK細胞更易以可靠的方式進行基因改造,且具有更強的抗癌活性,是基因工程細胞的合適來源[30]。目前已有iPSC-NK細胞用于臨床試驗,包括與ICI聯(lián)合治療難治性實體瘤以及對CD16高親和力的iPSC-NK細胞,有望為iPSC-NK細胞的臨床應(yīng)用提供證據(jù)支持。此外,該療法應(yīng)用的另一障礙是缺乏合適的引入CAR的載體。最近的研究對離體擴增的人NK細胞慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)性改進后,轉(zhuǎn)導(dǎo)效率為26%～61%[39],或是產(chǎn)生大量基因修飾NK細胞的有效方法。

3.3 細胞因子 正常肝臟中富含的細胞因子對NK細胞的成熟和活化至關(guān)重要,其中IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和IFN-γ表現(xiàn)出對NK細胞的促進和激活作用,而其他細胞因子如IL-6、IL-10、TGF-β則直接或間接抑制NK細胞。在有積極作用的細胞因子中,具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、促進免疫細胞生長、分化等作用的IL-15最受關(guān)注。肝癌進展過程中,細胞因子的產(chǎn)生存在免疫規(guī)避性抗炎反應(yīng),表現(xiàn)為肝內(nèi)抗炎因子IL-10和TGF-β表達的上調(diào),進而導(dǎo)致各類免疫細胞功能受抑[40]。研究[41]表明,IL-15可增強暴露于肝癌后NK細胞的功能,提示了IL-15的治療潛力。而與其他細胞因子相比,IL-15更具有維持NK細胞持久性、恢復(fù)線粒體完整性、減少細胞凋亡等功能及更低的毒副作用[42]。目前已經(jīng)設(shè)計了幾種重組形式的IL-15,如hetIL-15、IL-15“超級激動”劑N-803等,并在臨床前研究中取得良好效果。然而IL-15長期使用已被證實可通過表觀遺傳重編程機制導(dǎo)致細胞周期停滯、活力和溶解活性降低等不利影響[43]。IL-2、IL-21對NK細胞亦有積極作用,其中IL-2因其毒性作用導(dǎo)致應(yīng)用受限。值得關(guān)注的是IL-21可以激活STAT1和PI3K-AKT-Foxo1通路從而逆轉(zhuǎn)TIM-3和PD-1介導(dǎo)的NK細胞耗竭,與其他細胞因子如IL-15的組合可增加NK細胞增殖和IFN-γ的產(chǎn)生[44],提示細胞因子的組合或?qū)⑷〉酶询熜?同時細胞因子聯(lián)合其他療法比單獨應(yīng)用獲益更多。

4 總結(jié)

隨著人們對NK細胞研究的深入,以及免疫學(xué)、基因工程技術(shù)等發(fā)展,NK細胞作為腫瘤治療主力軍成為可能。同基于T淋巴細胞的治療相比,NK細胞在功能性、安全性等方面顯示出優(yōu)勢。相關(guān)研究表明,基于NK細胞的治療取得可喜成果,但也必須正視這些治療方法帶來的挑戰(zhàn),進一步探索兼顧安全性和有效性的治療方法。目前,盡管該療法尚處在起步階段,但仍應(yīng)堅信基于或聯(lián)合NK細胞的治療能在未來肝癌治療中占據(jù)一席之地。

利益沖突聲明:本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明:程世紀負責查找文獻,撰寫文章;匡天瑞、董可帥負責修改文章;余佳負責指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。