呂曉龍 魏佳佳 張志慧 李 密*

（1）沈陽(yáng)工業(yè)大學(xué)人工智能學(xué)院，沈陽(yáng) 110870；2）中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)自動(dòng)化研究所，機(jī)器人學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110016；3）中國(guó)科學(xué)院機(jī)器人與智能制造創(chuàng)新研究院，沈陽(yáng) 110169；4）中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

細(xì)胞力學(xué)特性在細(xì)胞生命活動(dòng)過(guò)程中起著關(guān)鍵調(diào)控作用。越來(lái)越多的證據(jù)表明，細(xì)胞不僅是個(gè)生化系統(tǒng)，同時(shí)也是個(gè)力學(xué)系統(tǒng)［1］。細(xì)胞處于由細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix）、其他細(xì)胞（如基質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞等）、組織液、各種生物化學(xué)分子（如細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子、活性氧類等）等共同構(gòu)成的三維微環(huán)境中［2-3］。作為細(xì)胞微環(huán)境的重要組成成分，細(xì)胞外基質(zhì)不僅為細(xì)胞提供物理支架以維持組織的完整性和彈性，同時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)還提供細(xì)胞各種生命活動(dòng)過(guò)程中所需的力學(xué)線索［4］。哺乳動(dòng)物的細(xì)胞外基質(zhì)由約300種蛋白質(zhì)分子（如膠原蛋白、蛋白聚糖、糖蛋白等）組成［5］。根據(jù)細(xì)胞外基質(zhì)所處位置和成分的不同，細(xì)胞外基質(zhì)主要分為間隙基質(zhì)（interstitial matrix）和基膜（basement membrane）兩類［6］。動(dòng)物體內(nèi)幾乎所有細(xì)胞均與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白直接接觸，如上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞與基膜接觸，結(jié)締組織中的細(xì)胞被間隙基質(zhì)所包圍，甚至血液中的細(xì)胞也與游離態(tài)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（如纖連蛋白）進(jìn)行接觸［7］。細(xì)胞通過(guò)機(jī)械力傳導(dǎo)機(jī)制（mechanotransduction）將細(xì)胞外基質(zhì)的機(jī)械刺激（如細(xì)胞外基質(zhì)剛度、血液/淋巴液剪切力）轉(zhuǎn)化為化學(xué)信號(hào)以調(diào)節(jié)細(xì)胞行為和功能（如細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、形態(tài)重構(gòu)以及基因變化等）［8］。細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用具有典型的交互性（reciprocal）：一方面，細(xì)胞在其生命活動(dòng)過(guò)程中會(huì)不斷生成、降解或重排細(xì)胞外基質(zhì)以改變細(xì)胞外基質(zhì)的某種或多種特性；另一方面，細(xì)胞生理活動(dòng)導(dǎo)致的細(xì)胞外基質(zhì)變化反過(guò)來(lái)會(huì)影響并改變細(xì)胞行為［9］。細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞力學(xué)特性的動(dòng)態(tài)變化，特別是在疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中（如癌癥）通常伴隨著細(xì)胞力學(xué)特性的顯著變化［10］。近年來(lái)，研究人員開(kāi)始在多種疾病（如癌癥、纖維化和心血管病等）中探索對(duì)細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)力學(xué)特性進(jìn)行干預(yù)（如預(yù)防、逆轉(zhuǎn)力學(xué)特性變化或中斷細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)力學(xué)特性的響應(yīng)等）的治療方法［11］，并已經(jīng)研發(fā)了多種進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段的力學(xué)特性干預(yù)藥物［12］，為治療人類疾病提供了新的可能。因此，開(kāi)展細(xì)胞力學(xué)特性研究對(duì)于揭示生命活動(dòng)內(nèi)在機(jī)理、推進(jìn)新型藥物研發(fā)、促進(jìn)疾病診療進(jìn)展等均具有重要的基礎(chǔ)意義。

原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM）的發(fā)明為單細(xì)胞力學(xué)特性研究提供了重要方法。AFM 利用壓電陶瓷管驅(qū)動(dòng)一根末端集成有極細(xì)針尖的微懸臂梁對(duì)樣本表面進(jìn)行水平方向光柵掃描，同時(shí)通過(guò)一束照射到懸臂梁背面的激光檢測(cè)懸臂梁信號(hào)（如偏轉(zhuǎn)量、振幅、頻率等）變化來(lái)感知掃描過(guò)程中針尖表面原子與樣本表面原子之間的相互作用，并通過(guò)信號(hào)處理與反饋電路系統(tǒng)控制探針在垂直方向運(yùn)動(dòng)以維持針尖與樣本之間相互作用力恒定，從而獲取反映樣本表面形貌起伏的三維圖像［13-14］。AFM 的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)是可以直接在生理溶液環(huán)境下對(duì)活體狀態(tài)生物樣本的表面精細(xì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行無(wú)損高分辨率成像，特別是通過(guò)控制AFM 探針在樣本表面進(jìn)行壓痕（indentation）實(shí)驗(yàn)還可以對(duì)樣本的力學(xué)特性進(jìn)行精確測(cè)量［15］。在壓痕實(shí)驗(yàn)中，AFM 探針在樣本表面垂直方向進(jìn)行逼近（approach）-回退（retract）往復(fù)運(yùn)動(dòng)，同時(shí)通過(guò)記錄該過(guò)程中探針懸臂梁偏轉(zhuǎn)量變化和壓電陶瓷垂直方向的位置變化即得到力曲線（force curve），最后利用理論模型對(duì)力曲線進(jìn)行分析即可得到樣本的力學(xué)特性（如楊氏模量）。AFM壓痕實(shí)驗(yàn)方法在細(xì)胞力學(xué)特性探測(cè)方面取得了極大的成功，已成為細(xì)胞力學(xué)特性表征的重要方法［16-17］。通過(guò)將細(xì)胞表面特定區(qū)域劃分為若干個(gè)網(wǎng)格，并控制AFM 探針在所有網(wǎng)格內(nèi)分別進(jìn)行壓痕實(shí)驗(yàn)，即可得到反映細(xì)胞表面不同位置點(diǎn)力學(xué)特性分布的楊氏模量圖［18］。特別是近年來(lái)出現(xiàn)的基于峰值力輕敲（peak force tapping）模式的AFM 多參數(shù)成像方法可以同時(shí)獲取細(xì)胞形貌圖和力學(xué)特性圖［19-22］，極大地促進(jìn)了AFM 在細(xì)胞力學(xué)特性探測(cè)方面的應(yīng)用。然而需要指出的是，當(dāng)前基于AFM 的單細(xì)胞力學(xué)特性測(cè)量主要依賴于人工操作，即操作員需要在光學(xué)顯微鏡細(xì)胞成像導(dǎo)引下控制AFM 探針移動(dòng)到目標(biāo)細(xì)胞表面特定位置后進(jìn)行探測(cè)。由于不同細(xì)胞間形態(tài)的差異，操作員僅憑經(jīng)驗(yàn)通常難以準(zhǔn)確判斷并移動(dòng)AFM 探針至所需位置，往往需要重復(fù)多次才能將AFM 探針移動(dòng)至合適的位置以成功在目標(biāo)細(xì)胞表面進(jìn)行AFM 壓痕實(shí)驗(yàn)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)過(guò)程耗時(shí)費(fèi)力且效率低下。

針對(duì)上述問(wèn)題，本文將AFM 和細(xì)胞光學(xué)圖像識(shí)別相結(jié)合，提出了單細(xì)胞力學(xué)特性快速測(cè)量方法。通過(guò)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)算法自動(dòng)識(shí)別出光學(xué)圖像中的細(xì)胞，并利用模板匹配算法識(shí)別光學(xué)圖像中的AFM探針，在此基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)細(xì)胞和AFM探針空間位置關(guān)系的自動(dòng)快速判斷并進(jìn)而控制AFM探針準(zhǔn)確移動(dòng)至合適位置以對(duì)目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行AFM壓痕實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所提出的方法不僅適用于常規(guī)AFM錐形針尖探針，還適用于AFM球形針尖探針，為AFM 單細(xì)胞力學(xué)特性自動(dòng)測(cè)量提供了新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

本文選用兩種細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別為HEK 293（人胚胎腎細(xì)胞）和MCF-7（人乳腺癌細(xì)胞），細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)（上海）。細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM 高糖培養(yǎng)基） 以及磷酸鹽緩沖液（PBS）購(gòu)自上海瑞典生物科技有限公司，胎牛血清購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Thermo Fisher 公司，青霉素-鏈霉素溶液購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Hyclone公司。細(xì)胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。HEK 293和MCF-7 均為貼壁生長(zhǎng)型細(xì)胞，因此直接將細(xì)胞接種在60 mm 培養(yǎng)皿（廣州潔特生物有限公司）中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher 公司）中進(jìn)行培養(yǎng)（37℃、5% CO2、95%空氣）。

1.2 AFM及球形探針制作

本文采用的AFM 型號(hào)為美國(guó)Bruker 公司生產(chǎn)的Dimension Icon AFM（圖1a）。該型AFM擁有一個(gè)安裝在AFM 掃描頭側(cè)面的光學(xué)顯微鏡，使操作員可以在光學(xué)顯微視覺(jué)導(dǎo)引下控制AFM 探針對(duì)基底目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行探測(cè)。將生長(zhǎng)有細(xì)胞（HEK 293或MCF-7）的培養(yǎng)皿置于AFM 樣品臺(tái)后，即可控制AFM 探頭浸入培養(yǎng)皿液面對(duì)細(xì)胞力學(xué)特性進(jìn)行探測(cè)。所采用的AFM錐形針尖探針型號(hào)為MLCT-C（美國(guó)Bruker 公司），該探針的材料為氮化硅，探針懸臂梁（懸臂梁背面有反射金涂層）的彈性系數(shù)為0.01 N/m，懸臂梁共振頻率為7 kHz，針尖曲率半徑為20 nm，針尖高度為2.5~8 μm。此外，在光學(xué)顯微視覺(jué)導(dǎo)引下利用AFM 微操作將單個(gè)微球黏附至MLCT-C探針懸臂梁制作得到球形針尖探針（圖2）。制作球形探針?biāo)璧腁B 膠（DP420）購(gòu)自美國(guó)3M 公司，碳酸鋇微球（直徑20 μm）購(gòu)自天津市倍思樂(lè)色譜技術(shù)開(kāi)發(fā)中心。首先將A膠和B膠以1∶1 在載玻片表面一端均勻混合，同時(shí)將碳酸鋇微球粉末蘸至載玻片表面另一端。隨后在光學(xué)顯微鏡視覺(jué)導(dǎo)引下控制AFM 探針移動(dòng)至AB 膠上方并控制探針緩慢接近AB 膠，在懸臂梁接觸到AB 膠后立即控制AFM探針回退。緊接著轉(zhuǎn)動(dòng)AFM樣品臺(tái)，控制AFM 探針移動(dòng)至單個(gè)碳酸鋇微球上方（圖2aI）并控制探針接近微球（圖2aII），在懸臂梁接觸到微球后控制探針回退（圖2aIII）。將制作好的微球探針置于探針盒中保存12 h待AB膠徹底固化后即可利用微球探針進(jìn)行細(xì)胞力學(xué)特性測(cè)量實(shí)驗(yàn)。對(duì)制作完成的微球探針進(jìn)行的掃描電鏡（SEM）成像清晰地顯示了修飾到AFM探針懸臂梁的單個(gè)微球（圖2b）。

Fig. 1 Combining AFM with optical image recognition for rapid measurements of single-cellular mechanical properties

Fig. 2 Preparation of the AFM probe with a spherical tip

1.3 結(jié)合光學(xué)圖像識(shí)別的AFM單細(xì)胞力學(xué)特性快速測(cè)量

光學(xué)圖像中細(xì)胞和AFM 探針自動(dòng)識(shí)別流程如圖1b所示。將生長(zhǎng)有細(xì)胞的培養(yǎng)皿置于AFM樣品臺(tái)，隨后控制AFM 探針進(jìn)入培養(yǎng)皿液面并逼近培養(yǎng)皿基底。隨后利用AFM 光學(xué)顯微鏡（圖1a）拍攝細(xì)胞和AFM探針的光學(xué)圖像（圖1c）。利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練模型識(shí)別出光學(xué)圖像中的細(xì)胞輪廓并確定細(xì)胞輪廓重心坐標(biāo)，利用圖像模板匹配方法識(shí)別出光學(xué)圖像中的AFM 探針位置。其中，為獲取探針針尖的位置，利用日本HIROX 公司生產(chǎn)的正置光學(xué)顯微鏡對(duì)AFM 探針進(jìn)行成像，根據(jù)正置光學(xué)顯微鏡成像結(jié)果得到錐形針尖和球形針尖在探針懸臂梁上的準(zhǔn)確位置，從而在后續(xù)截取AFM 探針模板圖像時(shí)使針尖處于模板圖像的中間位置。得到細(xì)胞重心坐標(biāo)和AFM 探針針尖坐標(biāo)后即可確定目標(biāo)細(xì)胞和探針針尖之間的空間位置關(guān)系，隨后利用所得到的位置關(guān)系控制AFM 探針準(zhǔn)確移動(dòng)至目標(biāo)細(xì)胞并進(jìn)行AFM 力學(xué)特性實(shí)驗(yàn)。在完成對(duì)目標(biāo)細(xì)胞力學(xué)特性進(jìn)行測(cè)量后，控制AFM 探針移動(dòng)至下一個(gè)細(xì)胞附近，并重復(fù)上述基于光學(xué)圖像自動(dòng)識(shí)別的細(xì)胞力學(xué)特性快速測(cè)量流程。

近年來(lái)機(jī)器學(xué)習(xí)領(lǐng)域的快速發(fā)展，特別是在深度學(xué)習(xí)方面的進(jìn)展，極大地促進(jìn)了生物醫(yī)學(xué)圖像理解分析的進(jìn)步，深度學(xué)習(xí)算法已成為生物醫(yī)學(xué)圖像分類、檢測(cè)、分割、配準(zhǔn)等的重要研究方法［23］。當(dāng)前，在生物醫(yī)學(xué)圖像分析方面應(yīng)用得最廣泛的深度學(xué)習(xí)模型是端到端（end-to-end）監(jiān)督學(xué)習(xí)的卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型［24］。本文采用UNet++卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（圖3）識(shí)別AFM 光學(xué)顯微鏡采集的光學(xué)圖像中的細(xì)胞。UNet++由不同深度的U-Net 結(jié)構(gòu)（由卷積、下采樣、上采樣和跳躍連接組成的編碼器-解碼器網(wǎng)絡(luò)）組成，這些U-Net結(jié)構(gòu)的解碼器通過(guò)重新設(shè)計(jì)的跳躍連接以相同尺寸緊密相連［25］。UNet++網(wǎng)絡(luò)有以下優(yōu)點(diǎn)。首先，UNet++結(jié)構(gòu)中嵌入了不同深度的U-Net 結(jié)構(gòu)，這些U-Net 結(jié)構(gòu)共享一個(gè)編碼器，而這些U-Net結(jié)構(gòu)的解碼器則是通過(guò)跳躍連接的方式相互交織。利用深度監(jiān)督訓(xùn)練UNet++網(wǎng)絡(luò)時(shí)，所有U-Net 結(jié)構(gòu)通過(guò)共享圖像可同時(shí)得到訓(xùn)練，這種設(shè)計(jì)不僅提升了整體的圖像分割性能，還可以在推理時(shí)對(duì)模型進(jìn)行剪枝。其次，UNet++網(wǎng)絡(luò)不會(huì)受到跳躍連接的阻礙，因?yàn)橹挥衼?lái)自編碼器和解碼器的相同比例特征圖才可以進(jìn)行融合。UNet++網(wǎng)絡(luò)中重新設(shè)計(jì)的跳躍連接可以提取出不同尺度的特征，允許聚合層將跳躍連接中各個(gè)尺度的特征圖與解碼器的特征圖進(jìn)行融合，因而在圖像語(yǔ)義分割和實(shí)例分割方面具有更好的性能。

Fig. 3 Schematic illustration of the UNet++ network structure

用于UNet++網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練的數(shù)據(jù)集由本文采用的Dimension Icon AFM的光學(xué)顯微鏡（圖1a）拍攝得到。圖像大小為320×240 像素，經(jīng)過(guò)篩選共得到308 張細(xì)胞圖像。利用Labelme 軟件對(duì)圖像進(jìn)行標(biāo)注（圖1c）。圖像像素被標(biāo)注為2 類，分別為細(xì)胞（紅色表示） 和背景（黑色表示）。隨后在Windows 10系統(tǒng)環(huán)境下，以PyTorch為框架，使用矩池云人工智能云計(jì)算平臺(tái)（浙江）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行訓(xùn)練。訓(xùn)練集由通過(guò)對(duì)308張?jiān)技?xì)胞及其標(biāo)注圖像進(jìn)行鏡像翻轉(zhuǎn)、旋轉(zhuǎn)等一系列圖像操作后得到的1 232張圖像組成。迭代次數(shù)為60次，經(jīng)過(guò)迭代后得到UNet++訓(xùn)練模型，用于后續(xù)對(duì)細(xì)胞光學(xué)圖像進(jìn)行的語(yǔ)義分割。利用C++編寫(xiě)模板匹配程序并采用OpenCV軟件庫(kù)中平方差匹配方法以實(shí)現(xiàn)對(duì)獲取的光學(xué)圖像AFM探針的定位?？紤]到在AFM實(shí)驗(yàn)中AFM 探針在探針夾上安裝姿態(tài)的誤差會(huì)導(dǎo)致模板圖像與待匹配圖像之間存在角度偏差，本文在模板匹配算法的基礎(chǔ)上添加了模板旋轉(zhuǎn)算法，即對(duì)模板從-5°到5°，以1°為步長(zhǎng)依次進(jìn)行旋轉(zhuǎn)并在每次旋轉(zhuǎn)后都會(huì)對(duì)待匹配圖像進(jìn)行模板匹配，從中選取模板與待匹配圖像之間差異最小者作為最終匹配結(jié)果。此外，為了對(duì)光學(xué)圖像中像素之間的實(shí)際距離進(jìn)行標(biāo)定，在空白區(qū)域使用AFM 操控軟件控制AFM 探針移動(dòng)一定距離（AFM操控軟件可以得到AFM探針移動(dòng)的準(zhǔn)確距離），并利用模板匹配方法獲取探針移動(dòng)前后的坐標(biāo)，得到光學(xué)圖像像素與實(shí)際距離的對(duì)應(yīng)關(guān)系。因此，在利用上述圖像分析方法分別得到細(xì)胞重心和AFM 探針針尖坐標(biāo)后，便可自動(dòng)計(jì)算得到細(xì)胞與AFM探針之間的位置關(guān)系，從而控制AFM 探針準(zhǔn)確移動(dòng)至細(xì)胞表面獲取力曲線。

1.4 SEM成像

利用美國(guó)Thermo Fisher 公司生產(chǎn)的Quattro SEM 環(huán)境掃描場(chǎng)發(fā)射電鏡對(duì)制作的微球探針進(jìn)行高分辨率成像。具體來(lái)說(shuō)，利用導(dǎo)電膠將制作好的微球探針固定在SEM 樣品臺(tái)上，并利用離子濺射儀對(duì)樣本進(jìn)行鍍金處理。隨后在高真空模式下對(duì)微球探針樣本進(jìn)行掃描成像。

1.5 細(xì)胞楊氏模量計(jì)算

利用Hertz-Sneddon 模型（Hertz 模型對(duì)應(yīng)微球針尖探針，Sneddon 模型對(duì)應(yīng)常規(guī)錐形針尖探針）對(duì)獲取的力曲線進(jìn)行分析以得到細(xì)胞楊氏模量［15，26］：

其中F為探針加載力，E為細(xì)胞楊氏模量，R為微球針尖半徑，δ為壓痕深度，θ為錐形針尖半開(kāi)角，υ為細(xì)胞的泊松比（一般認(rèn)為活細(xì)胞為不可壓縮材料，因此活細(xì)胞的泊松比為0.5［27］）。探針加載力F可以根據(jù)胡克定律從懸臂梁偏轉(zhuǎn)量x得到：

其中k為探針懸臂梁彈性系數(shù)。獲取的力曲線記錄了AFM 壓痕過(guò)程中探針懸臂梁偏轉(zhuǎn)量x與壓電陶瓷驅(qū)動(dòng)器垂直方向位置變化量d之間的關(guān)系。獲取的力曲線分為兩部分，分別為逼近曲線和回退曲線。通常利用逼近曲線計(jì)算樣本的楊氏模量［28］。根據(jù)逼近曲線上接觸點(diǎn)的位置將逼近曲線轉(zhuǎn)化為壓痕曲線（壓痕深度等于壓電陶瓷驅(qū)動(dòng)器垂直方向變化量d與懸臂梁偏轉(zhuǎn)量x之間的差值），隨后利用Matlab （美國(guó)Mathworks 公司） 編寫(xiě)的Hertz-Sneddon模型擬合程序?qū)汉矍€進(jìn)行擬合即得到細(xì)胞楊氏模量［13］。

2 結(jié)果與討論

為了驗(yàn)證本文提出方法的有效性，首先利用常規(guī)錐形針尖AFM 探針進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。圖4 顯示了結(jié)合AFM 和光學(xué)圖像識(shí)別對(duì)單個(gè)HEK 293 細(xì)胞力學(xué)特性進(jìn)行測(cè)量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果?？刂艫FM 探針到達(dá)目標(biāo)細(xì)胞附近后，利用AFM 光學(xué)顯微鏡獲取細(xì)胞和AFM探針的光學(xué)圖像（圖4a）。隨后即可根據(jù)預(yù)先訓(xùn)練的UNet++網(wǎng)絡(luò)模型識(shí)別出光學(xué)圖像中的目標(biāo)細(xì)胞輪廓（圖4b），同時(shí)通過(guò)模板匹配方法識(shí)別出AFM探針（圖4c）。根據(jù)錐形針尖高分辨率光學(xué)成像結(jié)果（圖4a插圖）可以確保在制備的AFM探針模板圖像中針尖位置處于模板中心，因此模板識(shí)別結(jié)果的中心即為AFM探針針尖（圖4c藍(lán)色方框中心）?；谏鲜鲎R(shí)別結(jié)果即可確定目標(biāo)細(xì)胞輪廓重心與AFM 針尖之間的位置關(guān)系（圖4d），得到AFM 探針在水平面內(nèi)移動(dòng)至目標(biāo)細(xì)胞所需的距離（Δx和Δy），并將其輸入至AFM操控軟件，即可實(shí)現(xiàn)將AFM 探針準(zhǔn)確移動(dòng)至目標(biāo)細(xì)胞（圖4e）并進(jìn)行AFM壓痕實(shí)驗(yàn)。利用Hertz-Sneddon模型對(duì)壓痕實(shí)驗(yàn)中獲取的力曲線進(jìn)行分析即得到細(xì)胞楊氏模量（圖4f）?？紤]到不同類型細(xì)胞之間的形態(tài)差異，利用該方法對(duì)MCF-7 細(xì)胞進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖5）表明，基于光學(xué)圖像自動(dòng)識(shí)別可將AFM錐形針尖準(zhǔn)確移動(dòng)至目標(biāo)MCF-7 細(xì)胞重心并在此基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了對(duì)MCF-7細(xì)胞力學(xué)特性的測(cè)量。

Fig. 4 Experimental results of utilizing AFM conical probe to rapidly detect the mechanical properties of single living HEK 293 cells under aqueous conditions based on optical image automatic recognition

Fig. 5 Experimental results of utilizing AFM conical probe to rapidly detect the mechanical properties of single living MCF-7 cells based on optical image automatic recognition

隨后利用AFM 微球探針測(cè)試了所建立的方法流程的有效性。圖6 為光學(xué)圖像識(shí)別導(dǎo)引下利用AFM 微球探針對(duì)單個(gè)HEK 293 活細(xì)胞力學(xué)特性進(jìn)行探測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以看到基于光學(xué)圖像識(shí)別可將微球探針準(zhǔn)確移動(dòng)至目標(biāo)細(xì)胞表面并進(jìn)而對(duì)細(xì)胞力學(xué)特性進(jìn)行測(cè)量。圖7 為結(jié)合光學(xué)圖像識(shí)別和AFM微球探針對(duì)MCF-7細(xì)胞進(jìn)行探測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，同樣顯示了所提出方法的有效性。為了獲取具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果，利用所建立的方法分別對(duì)10 個(gè)HEK 293 細(xì)胞和10 個(gè)MCF-7 細(xì)胞的力學(xué)特性進(jìn)行了測(cè)量，其中在每個(gè)細(xì)胞表面獲取10 條力曲線，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖8所示?？梢钥吹郊?xì)胞楊氏模量測(cè)量結(jié)果符合正態(tài)分布，且球形針尖探針測(cè)量得到的細(xì)胞楊氏模量要明顯小于錐形針尖探針測(cè)量得到的楊氏模量，與前人測(cè)量結(jié)果［29-31］一致。造成這種差異的主要原因是錐形針尖和球形針尖所探測(cè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)部位的不同［32］。錐形針尖由于接觸面積小，其主要探測(cè)的是細(xì)胞表層局部區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，而球形針尖則由于接觸面積大探測(cè)的是細(xì)胞骨架及細(xì)胞質(zhì)等細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)。細(xì)胞骨架的硬度要明顯大于細(xì)胞質(zhì)等細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致錐形針尖測(cè)量得到的細(xì)胞楊氏模量遠(yuǎn)大于球形針尖測(cè)量得到的細(xì)胞楊氏模量。

Fig. 6 Experimental results of utilizing AFM spherical probe to rapidly detect the mechanical properties of single living HEK 293 cells based on optical image automatic recognition

Fig. 7 Experimental results of utilizing AFM spherical probe to rapidly detect the mechanical properties of single living MCF-7 cells based on optical image automatic recognition

本文所提出方法對(duì)于AFM 單細(xì)胞力學(xué)特性研究具有積極意義。AFM 已成為單細(xì)胞力學(xué)特性研究的重要工具并在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。然而，現(xiàn)有的AFM 單細(xì)胞力學(xué)特性測(cè)量實(shí)驗(yàn)嚴(yán)重依賴于人工，需要操作員根據(jù)經(jīng)驗(yàn)判斷AFM 探針和目標(biāo)細(xì)胞之間的空間距離關(guān)系并控制探針移動(dòng)至目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行壓痕實(shí)驗(yàn)。本文通過(guò)借鑒光學(xué)圖像分析技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)光學(xué)圖像中細(xì)胞和AFM 探針位置的自動(dòng)識(shí)別，在此基礎(chǔ)上控制AFM 探針準(zhǔn)確移動(dòng)至目標(biāo)細(xì)胞并進(jìn)而完成壓痕實(shí)驗(yàn)。本文提出的方法不依賴于操作員的經(jīng)驗(yàn)，有助于提升AFM 壓痕實(shí)驗(yàn)效率，為基于AFM 的高通量單細(xì)胞力學(xué)特性研究提供了新的思路和潛在可行的方法。此外本文提出的方法不僅適用于探測(cè)細(xì)胞表面局部區(qū)域力學(xué)特性的常規(guī)錐形針尖探針（圖4，5），還適用于探測(cè)細(xì)胞整體力學(xué)特性的球形針尖探針（圖6，7），對(duì)于AFM 細(xì)胞力學(xué)特性研究具有普遍意義。需要指出的是，本文方法直接控制探針移動(dòng)到目標(biāo)細(xì)胞表面，因此探測(cè)范圍取決于所采用AFM 的探針在水平面的運(yùn)動(dòng)范圍。本文AFM 的水平面探針運(yùn)動(dòng)范圍為80×80 μm2，因此本文方法的探測(cè)范圍為以AFM探針針尖為中心的80×80 μm2區(qū)域。下一步可以在細(xì)胞光學(xué)圖像識(shí)別基礎(chǔ)上，通過(guò)控制AFM 樣品臺(tái)運(yùn)動(dòng)以提升單細(xì)胞力學(xué)特性自動(dòng)化探測(cè)范圍。本文方法目前主要適用于單個(gè)孤立細(xì)胞，在未來(lái)通過(guò)借鑒聚團(tuán)細(xì)胞光學(xué)圖像分割方法［33］以對(duì)聚團(tuán)細(xì)胞進(jìn)行精準(zhǔn)分割將顯著提升本文方法的適用范圍。當(dāng)前在基于AFM 的細(xì)胞力學(xué)特性測(cè)量研究中，為了最大限度減少基底效應(yīng)對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響，通常在細(xì)胞中央?yún)^(qū)域（細(xì)胞核）采集力曲線［34］?；诖?，本文基于光學(xué)圖像自動(dòng)識(shí)別實(shí)現(xiàn)了準(zhǔn)確移動(dòng)AFM 探針針尖至細(xì)胞中央?yún)^(qū)域以對(duì)細(xì)胞力學(xué)特性進(jìn)行測(cè)量。研究人員已經(jīng)提出了去除基底效應(yīng)的方法以使AFM 可以較準(zhǔn)確地測(cè)量細(xì)胞邊緣部位的力學(xué)特性［27］，因此下一步研究利用光學(xué)圖像識(shí)別算法自動(dòng)識(shí)別出細(xì)胞其他部位（如在癌癥轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用的癌細(xì)胞偽足結(jié)構(gòu)［35-36］以及細(xì)胞質(zhì)等），并實(shí)現(xiàn)將AFM探針準(zhǔn)確移動(dòng)至細(xì)胞表面不同部位，以進(jìn)行力學(xué)特性測(cè)量，這對(duì)于理解細(xì)胞生命活動(dòng)過(guò)程中的內(nèi)在力學(xué)機(jī)制具有重要意義。此外，通過(guò)將單個(gè)細(xì)胞連接到AFM 探針懸臂梁制成單細(xì)胞探針［37-38］，并應(yīng)用本文提出的方法有望實(shí)現(xiàn)對(duì)單對(duì)細(xì)胞間黏附作用的快速自動(dòng)測(cè)量，對(duì)于細(xì)胞黏附行為研究具有積極意義。

Fig. 8 Statistical histograms of measuring cellular mechanical properties based on the combination of AFM and optical image recognition

3 結(jié)論

總結(jié)起來(lái)，本文結(jié)合AFM 和光學(xué)圖像自動(dòng)識(shí)別技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)活細(xì)胞力學(xué)特性的快速測(cè)量，為提升AFM 單細(xì)胞分析實(shí)驗(yàn)探測(cè)效率提供了新的可能，對(duì)于單細(xì)胞力學(xué)特性研究具有重要基礎(chǔ)意義。