熊文典 賈 磊 蔡燕飛 陳 蘊(yùn) 金 堅(jiān)*** 朱景宇***

（1）江南大學(xué)生命科學(xué)與健康工程學(xué)院，無(wú)錫 214122；2）江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，無(wú)錫 214122）

炎癥（inflammation），是機(jī)體對(duì)外界感染、組織損傷等刺激所產(chǎn)生的，以維持機(jī)體自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和正常生命活動(dòng)為根本的一種保護(hù)性反應(yīng)［1］。炎癥疾病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，而且常常表現(xiàn)為慢性炎癥，治療困難，從而容易引發(fā)其他疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、肺纖維化，甚至腫瘤［2］。大量研究已發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)與胞內(nèi)多條信號(hào)通路的激活相關(guān)， 其中磷脂酰肌醇 3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）信號(hào)通路備受關(guān)注［3-4］。PI3K是一種胞內(nèi)脂質(zhì)磷酸激酶，根據(jù)其結(jié)構(gòu)和底物的特異性可分為I、II、III型，其中I型PI3K 研究最為廣泛［5］。受多種細(xì)胞表面受體激活后，I 型PI3K 可磷酸化靶底物磷酸肌醇（PIP2）肌醇環(huán)的第3 位，產(chǎn)生脂質(zhì)第二信使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），進(jìn)而啟動(dòng)廣泛的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)［6］。其介導(dǎo)的PI3K/Akt 信號(hào)通路調(diào)控著一系列細(xì)胞生理活動(dòng)，如細(xì)胞存活、遷移、分化和增殖等［7］。I 型PI3K 是由調(diào)節(jié)亞基（p85）和催化亞基（p110）組成的異源二聚體，根據(jù)結(jié)構(gòu)特異性和調(diào)控亞基的差異，進(jìn)一步分為IA類和IB類。IA類包括PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kδ，而IB 類僅含有PI3Kγ［8］。作為唯一的亞型結(jié)構(gòu)，PI3Kγ 擁有如下幾個(gè)顯著特征：a. IA 型PI3K 主要由酪氨酸激酶受體（recptor tyrosine kinases，RTKs） 激活，而PI3Kγ 主要受G 蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCRs）激活［9-10］；b. PI3Kα 和PI3Kβ在人體組織中普遍表達(dá)，而PI3Kγ和PI3Kδ主要分布于造血系統(tǒng)，其中PI3Kγ 主要存在于白細(xì)胞中，如中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞、肥大細(xì)胞中［11］；c. 在受到如GPCR 這些細(xì)胞表面受體刺激后，PI3Kγ被大量激活從而可以調(diào)控多種免疫細(xì)胞功能［12］；d. PI3Kγ 缺陷小鼠模型表明，敲除PI3Kγ不會(huì)造成胚胎致死，但會(huì)嚴(yán)重影響小鼠的免疫功能［11，13］。大量研究表明，PI3Kγ 的激活有助于中性粒細(xì)胞在感染和炎癥部位聚集，從而釋放大量的趨化因子、炎癥因子及活性氧（ROS）等［14］。PI3Kγ 在其他免疫細(xì)胞及其功能中也發(fā)揮著重要作用，例如，趨化單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞在炎癥部位的遷移、激活及發(fā)育T 淋巴細(xì)胞等［11］。此外，在多種小鼠模型中，抑制PI3Kγ 可以有效地治療多種炎癥疾病，包括關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、哮喘、肺部炎癥和纖維化等［15-17］。因此，PI3Kγ因其在免疫系統(tǒng)中的重要作用而成為一個(gè)極具潛力的抗炎藥物靶點(diǎn)。

目前已有一些選擇性PI3Kγ報(bào)道，其中依加利塞（Eganelisib，IPI-549） 已進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)（圖1a）［18］。IPI-549 作為一個(gè)腫瘤免疫治療候選化合物，主要用于治療尿路上皮癌、乳腺癌、卵巢癌等腫瘤疾病，迄今沒(méi)有IPI-549 用于炎癥治療的報(bào)道［19］。目前已有多篇論文綜述了PI3Kγ 抑制劑的開(kāi)發(fā)情況，其中用于抗炎作用的PI3Kγ抑制劑報(bào)道較少［16，20-21］。因此，開(kāi)發(fā)新型的PI3Kγ抑制劑用于炎癥治療具有廣闊的應(yīng)用前景及臨床意義。然而，目前幾乎所有的PI3Kγ抑制劑都是圍繞其ATP結(jié)合口袋進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)［22］，即ATP 競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，由于I型PI3K的高度同源及ATP口袋的保守性，使得開(kāi)發(fā)選擇性PI3Kγ 抑制劑具有極大的挑戰(zhàn)［23］，因此，研究現(xiàn)有抑制劑的選擇性機(jī)制將有助于選擇性PI3Kγ 的開(kāi)發(fā)。本文擬采用IPI-549 作為工具藥物，使用體外炎癥模型評(píng)價(jià)其抗炎作用，同時(shí)利用整合的計(jì)算模擬技術(shù)來(lái)研究其PI3Kγ的選擇性機(jī)制，為抗炎PI3Kγ抑制劑的開(kāi)發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 IPI-549對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠巨噬細(xì)胞RAW246.7（購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)），每孔5 000 個(gè)細(xì)胞接種至96 孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37℃，5% CO2）。待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的IPI-549，設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白組和對(duì)照組，作用24 h后使用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力。

1.2 IPI-549對(duì)PI3K信號(hào)通路作用評(píng)價(jià)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7 細(xì)胞鋪于6 孔板，每孔1.5×106個(gè)細(xì)胞，加入1 ml 無(wú)血清的DMEM 培養(yǎng)基后置于培養(yǎng)箱中饑餓過(guò)夜處理（37℃，5% CO2）。提前加入不同濃度（0.1、0.5、1.0 μmol/L） 的IPI-549 （0.5% DMSO） 處理30 min后，加入500 μg/L脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作用30 min。隨后根據(jù)RIPA 裂解液說(shuō)明書提取蛋白質(zhì)，使用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度并調(diào)節(jié)至同一濃度水平，加入上樣緩沖液（loading buffer）后在水中煮沸5 min使蛋白質(zhì)充分變性，完成上樣液的制備。上樣等量的樣品，并按照預(yù)制膠的說(shuō)明書進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育抗體，其中封閉使用5%脫脂奶粉，一抗為磷酸化Akt（p-Akt-S473，1∶1 000稀釋）、總Akt（total-Akt，1∶1 000稀釋）抗體，均購(gòu)置于Cell Signaling Technology公司。最后采用ECL方法顯色。

1.3 IPI-549抗炎作用的評(píng)價(jià)

使用LPS誘導(dǎo)RAW264.7構(gòu)建炎癥模型。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW246.7 鋪于12 孔板，每孔40 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，貼壁后，提前30 min 加入不同濃度的IPI-549 （0.1、 0.5、 1.0 μmol/L）， 后加入LPS 500 μg/L，共同作用24 h。按照TRIzol （購(gòu)自Thermo Scientific）的官方操作提取RNA，之后按照PrimeScriptTMRT Master Mix（Takara）官方操作得到相應(yīng)的cDNA，最后加入已合成的目的基因引物（上海生工），使用SYBRTMSelect Master Mix（Thermo Scientific）按照說(shuō)明書進(jìn)行PCR定量，引物序列見(jiàn)表S1。GAPDH作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.4 PI3Kγ蛋白及小分子數(shù)據(jù)集準(zhǔn)備

小分子結(jié)構(gòu)均來(lái)自Drew 課題組的文獻(xiàn)報(bào)道［24］。IPI-549/PI3Kγ 復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)采自RCSB Protein Data Bank 數(shù)據(jù)庫(kù)，PDB ID：6XRL［24］。IPI-549的三維結(jié)構(gòu)直接取自6XRL，其余小分子結(jié)構(gòu)使用Discovery studio 3.5 （DS3.5） 軟件中Sketching 工具繪制，共含有41 個(gè)小分子結(jié)構(gòu)，其活性數(shù)據(jù)采用文獻(xiàn)報(bào)道的IC50值（表S2）。所有小分子使用DS3.5 的Minimize Ligands 工具進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化：賦予CHARMm 力場(chǎng)，采用Smart Minimizer算法進(jìn)行能量?jī)?yōu)化。優(yōu)化后的40 個(gè)小分子（除去IPI-549）組成抑制劑數(shù)據(jù)集（Inhibitors dataset），同時(shí)根據(jù)抑制劑數(shù)據(jù)集結(jié)構(gòu)，使用DUD-E在線工具（http://dude.docking.org/）生成含有850個(gè)小分子的數(shù)據(jù)庫(kù)，作為非抑制劑數(shù)據(jù)集（Decoys dataset）。

1.5 構(gòu)建基于分子共同特征的藥效團(tuán)模型

采用 DS3.5 軟件中的 Common Feature Pharmacophore Generation 模塊構(gòu)建基于分子共同特征的藥效團(tuán)模型（HipHop）。首先，從上述的41個(gè)抑制劑集中挑選活性最高的6個(gè)小分子來(lái)構(gòu)建模型（表S2中*標(biāo)識(shí)），設(shè)置其Principal值為2，意為有活性的參考分子。根據(jù)DS3.5默認(rèn)推薦藥效團(tuán)特征（Features），選定氫鍵供體（D）、氫鍵受體（A）、疏水中心（H）、正電離子中心（PI）、芳香環(huán)中心（R）。其他參數(shù)設(shè)置如下：Conformation Generation 設(shè)置為Best；MaxOmitFeat 值設(shè)置為0，表示構(gòu)建的藥效團(tuán)模型所有特征元素都要匹配這6個(gè)小分子；其余參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)。

1.6 構(gòu)建基于受體-配體復(fù)合物的藥效團(tuán)模型

使 用 DS3.5 軟 件 中 的 Receptor-ligand Pharmacophore Generation 模塊基于IPI-549/PI3Kγ復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)6XRL 構(gòu)建受體-配體復(fù)合物藥效團(tuán)模型。首先，采用Prepare Protein 工具進(jìn)行蛋白質(zhì)優(yōu)化：去除水分子；添加氫鍵及缺失的原子；自動(dòng)質(zhì)子化；賦予CHARMm立場(chǎng)。隨后，采用優(yōu)化的復(fù)合物結(jié)構(gòu)來(lái)構(gòu)建藥效團(tuán)，復(fù)合物蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)作為Input Receptor，復(fù)合物配體小分子作為Input Ligand， 其余參數(shù)設(shè)置如下： Maximum Pharmacophores 為10； Minimum Features 為3；Maximum Features 為6；模型采用GFA（Genetic Function Approximation）算法進(jìn)行打分［25］。此外，采用已知活性化合物與非活性化合物對(duì)產(chǎn)生的藥效團(tuán)模型進(jìn)行驗(yàn)證：Validation 設(shè)置為True，其中抑制劑數(shù)據(jù)集（Inhibitors dataset） 設(shè)置為Active Ligands，非抑制劑數(shù)據(jù)集（Decoys dataset）設(shè)置為Inactive Ligands。模型采用留一法（Leave-oneout）進(jìn)行驗(yàn)證，并使用以下指標(biāo)來(lái)進(jìn)行模型評(píng)估：包括敏感性（SE）、特異性（SP）、受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）及對(duì)應(yīng)ROC曲線下面積（AUC）值。

其中TP （true positive） 指真陽(yáng)性，F(xiàn)N （false negative）指假陰性，TN（true negative）指真陰性，F(xiàn)P（false positive）指假陽(yáng)性。

1.7 分子動(dòng)力學(xué)模擬

采用6XRL為分子動(dòng)力學(xué)初始構(gòu)象，首先使用Maestro 中Protein Preparation 模塊進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)備和優(yōu)化：去除水分子，加入氫原子；使用OPLS-2005力場(chǎng)進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化至最小化均方根偏差（RMSD）達(dá)到最大值0.3 ?。隨后，使用Desmond軟件進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬［26］，首先使用System Builder 工具構(gòu)建模擬體系：水盒子設(shè)置為orthorhombic，每個(gè)方向截?cái)嘀禐?0 ?；使用TIP3P 水模型；添加Na+中和體系電荷；添加0.15 mol/L 濃度的NaCl 溶液；賦予OPLS-2005 力場(chǎng)［27］。隨后，使用Desmond 軟件默認(rèn)的Relax model 方法對(duì)體系進(jìn)行優(yōu)化。最后，使用Molecular Dynamics 工具運(yùn)行動(dòng)力學(xué)模擬：模擬時(shí)間設(shè)置為200 ns；模擬體系設(shè)置為NPT，體系溫度為300 K，壓力為1 bar。分子動(dòng)力學(xué)模擬完成后，使用Simulation interaction diagram 工具進(jìn)行結(jié)果分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 IPI-549具有顯著的抗炎作用

首先檢測(cè) IPI-549 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞活性的影響，從而篩選出活性實(shí)驗(yàn)的安全濃度。使用不同濃度的IPI-549處理RAW264.7細(xì)胞，24 h后檢測(cè)細(xì)胞活力。圖1b顯示即使在藥物高濃度10 μmol/L作用下，細(xì)胞存活率仍達(dá)80%以上，表明細(xì)胞存活受到較小的影響，而在小于1.25 μmol/L藥物作用下，細(xì)胞的存活幾乎沒(méi)有影響，表明了IPI-549 較小的細(xì)胞毒性作用。使用LPS作用RAW264.7構(gòu)建炎癥細(xì)胞模型，圖1c 表明，LPS 可以顯著提升RAW264.7中PI3K通路中Akt的磷酸化水平，而使用不同濃度IPI-549 處理后，Akt473 的磷酸化水平（p-Akt-S473）受到顯著抑制，并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。對(duì)比空白組發(fā)現(xiàn)，0.1 μmol/L的IPI-549即可顯著抑制Akt473 的磷酸化，說(shuō)明IPI-549 可以有效地抑制炎癥細(xì)胞中的PI3K信號(hào)通路。

LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞為經(jīng)典的炎癥細(xì)胞模型，其特征是LPS的誘導(dǎo)會(huì)使得細(xì)胞大量釋放炎癥介質(zhì)，其中TNF-α、IL-1β 和IL-6 較為典型［28-29］。如圖1d~f 所示，隨著LPS 的誘導(dǎo)刺激，細(xì)胞中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高。使用不同濃度IPI-549（0.1、0.5、1.0 μmol/L）作用細(xì)胞，可以看到IPI-549 顯著抑制炎癥因子的釋放，并且這種抑制呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系。上述結(jié)果表明，IPI-549 可以通過(guò)抑制炎癥細(xì)胞中的PI3K 通路來(lái)有效地抑制炎癥細(xì)胞中炎癥因子的釋放，初步驗(yàn)證了IPI-549的抗炎作用。

2.2 基于分子共同特征（HipHop）藥效團(tuán)的分析

HipHop 可以提取系列化合物中具有相似活性但結(jié)構(gòu)不同或結(jié)構(gòu)柔性較大分子的共同化學(xué)特征，并探索其中的構(gòu)效關(guān)系［30］。由表1 可知，HipHop共生成10 個(gè)藥效團(tuán)模型。其中HipHop_01 藥效團(tuán)得分（Rank score）最高，為84.783?！癉irect Hit”及“Partial Hit”表示生成的藥效特征與訓(xùn)練集分子匹配情況，1 表示完全匹配，0 表示部分匹配。由表1 可知，HipHop_01 的特征與6 個(gè)小分子完全匹配。HipHop_01 擁有6 個(gè)藥效團(tuán)特征，包括了4個(gè)疏水特征（H）和2 個(gè)氫鍵受體特征（A）（圖2a）。其中，氨基吡唑嘧啶基團(tuán)對(duì)應(yīng)的氫鍵特征尤其關(guān)鍵，其產(chǎn)生的氫鍵作用保證了抑制劑與PI3Kγ蛋白的緊密結(jié)合（圖2b）［31］。

Table 1 Results of HipHop pharmacophore models

Fig. 2 Assessment of pharmacophore models

2.3 受體-配體復(fù)合物藥效團(tuán)模型分析

利用IPI-549/PI3Kγ 復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了10個(gè)藥效團(tuán)模型，其結(jié)果匯總于表2。其中，1號(hào)及2號(hào)藥效團(tuán)具有較高的選擇性分?jǐn)?shù)（selective score），為9.777。兩者分別產(chǎn)生了5個(gè)藥效團(tuán)特征：1號(hào)含有2 個(gè)氫鍵供體特征（D），2 個(gè)疏水特征（H）及1 個(gè)芳香環(huán)中心特征（R）；2號(hào)含有2 個(gè)氫鍵供體特征（D）及3個(gè)疏水特征（H）。其余藥效團(tuán)均含有4 個(gè)藥效團(tuán)特征，且基本都包含氫鍵供體特征（D）及疏水特征（H），表明疏水及氫鍵為PI3Kγ與小分子結(jié)合的重要相互作用。

Table 2 Results of receptor-ligand pharmacophore models

選擇性分?jǐn)?shù)通過(guò)模型命中DS3.5軟件內(nèi)置化合物庫(kù)中的drug-like分子數(shù)來(lái)進(jìn)行評(píng)分，因而無(wú)法準(zhǔn)確驗(yàn)證藥效團(tuán)模型對(duì)PI3Kγ抑制劑的篩選能力。因此，為了進(jìn)一步考察模型區(qū)分抑制劑與非抑制劑的真實(shí)能力，使用活性化合物及非活性化合物數(shù)據(jù)集對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證（表3）。其中，Sensitivity（SE）代表敏感度，表明模型預(yù)測(cè)活性化合物的準(zhǔn)確性；Specificity（SP）代表特異性，表明模型預(yù)測(cè)非活性化合物的準(zhǔn)確性，兩者數(shù)值越接近于1表示模型具有較準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)能力。從表3可以看出，生成的10 個(gè)模型SE和SP值具有顯著差距：1號(hào)及2號(hào)藥效團(tuán)盡管擁有較高的SP值，但是其SE值偏低，原因是這兩個(gè)模型的TP值較低，表明模型不能有效預(yù)測(cè)出真實(shí)的PI3Kγ活性抑制劑；8~10號(hào)藥效團(tuán)均含有較高的SE值，但其SP值較低，原因是其TN值較低，表明這些模型無(wú)法區(qū)分出非活性化合物；3號(hào)及4號(hào)藥效團(tuán)具有相對(duì)較高的SE及SP值，表明這兩個(gè)模型可以較為準(zhǔn)確的區(qū)分PI3Kγ抑制劑及非抑制劑。為了對(duì)各模型的區(qū)分能力進(jìn)行全面的評(píng)估，計(jì)算了各模型的AUC值（表3），一般認(rèn)為AUC>0.7，代表模型具有較好的預(yù)測(cè)能力。其中，3號(hào)模型的AUC值得分最高，為0.875（圖2c），顯示較高的預(yù)測(cè)能力，因此選擇3號(hào)模型進(jìn)行進(jìn)一步分析。根據(jù)表2看出該模型共含有4個(gè)藥效團(tuán)特征：2 個(gè)氫鍵供體（D），1 個(gè)疏水中心（H），1 個(gè)芳香環(huán)中心（R）。將該模型與IPI-549 結(jié)構(gòu)進(jìn)行疊合分析（圖2d），發(fā)現(xiàn)共軛結(jié)構(gòu)連接的碳原子處具有疏水作用（藍(lán)色），表明PI3Kγ 蛋白在此處具有顯著的疏水性。IPI-549 的母核喹唑酮結(jié)構(gòu)處對(duì)應(yīng)了芳香環(huán)中心特征（黃色），這個(gè)母核結(jié)構(gòu)類似于ATP的嘌呤結(jié)構(gòu)，對(duì)抑制劑與PI3Kγ的結(jié)合發(fā)揮重要作用［32］。第三個(gè)特征對(duì)應(yīng)于氨基吡唑嘧啶基團(tuán)，為氫鍵供體特征（紫色），表明PI3Kγ 在此處易與抑制劑產(chǎn)生氫鍵相互作用，這個(gè)結(jié)果與上述HipHop結(jié)果吻合。上述結(jié)果表明，氫鍵及疏水是PI3Kγ蛋白與小分子結(jié)合的關(guān)鍵藥效特征。

Table 3 Predicted results of receptor-ligand pharmacophore models

2.4 分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果分析

為了深入分析IPI-549 與PI3Kγ 的動(dòng)態(tài)結(jié)合過(guò)程并進(jìn)一步揭示兩者的相互作用機(jī)制，將IPI-549/PI3Kγ 復(fù)合物進(jìn)行了200 ns 動(dòng)力學(xué)模擬。首先，計(jì)算了整個(gè)模擬過(guò)程中PI3Kγ 蛋白主鏈C 原子及IPI-549結(jié)構(gòu)的均方根偏差值（RMSD）及主鏈C原子的均方根漲落（RMSF）。圖S1a顯示，在體系經(jīng)過(guò)100 ns后，RMSD基本沒(méi)有顯著波動(dòng)，表明體系經(jīng)100 ns模擬后已達(dá)到平衡。圖S1b顯示，在ATP結(jié)合口袋位置處（氨基酸編號(hào)560~720），C原子波動(dòng)較小，表示IPI-549 與PI3Kγ 蛋白ATP 結(jié)合口袋的氨基酸發(fā)生緊密的結(jié)合。圖3a 顯示了IPI-549 與PI3Kγ活性口袋結(jié)合情況，可以發(fā)現(xiàn)IPI-549中吡唑環(huán)中的氮原子和氨基上的氮原子與Val882 形成關(guān)鍵的氫鍵相互作用，這個(gè)結(jié)果與上述藥效團(tuán)結(jié)果對(duì)應(yīng)，說(shuō)明這個(gè)氫鍵作用在PI3Kγ與抑制劑結(jié)合的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。此外，圖3b 顯示IPI-549 的甲基吡唑基團(tuán)與母核結(jié)構(gòu)喹唑酮基本呈垂直狀態(tài)，這個(gè)構(gòu)象進(jìn)一步穩(wěn)定了氫鍵作用。同時(shí)甲基吡唑基團(tuán)由于較長(zhǎng)的炔基結(jié)構(gòu)，使其深入PI3Kγ蛋白的“選擇性口袋”（圖3b），從而進(jìn)一步增加抑制劑的PI3Kγ選擇性。除了這些作用，IPI-549中的兩個(gè)苯環(huán)與TRP812 和THR887 形成顯著的π-π 相互作用，進(jìn)一步增加了抑制劑與蛋白的結(jié)合（圖3a）。為了進(jìn)一步定量分析這些相互作用，本文計(jì)算了復(fù)合物結(jié)合過(guò)程中重要氨基酸與IPI-549 的結(jié)合作用力。如圖3c 所示，縱坐標(biāo)使用“Interaction Fraction”表示，即配體與氨基酸殘基非鍵相互作用力持續(xù)時(shí)間占總作用時(shí)間的比例。若分?jǐn)?shù)大于1，表示配體與該氨基酸殘基可能同時(shí)具備多個(gè)復(fù)合作用力?？梢钥闯觯琕al882 的氫鍵作用發(fā)揮了最大的能量貢獻(xiàn)。此外，疏水相互作用也發(fā)揮了重要作用，如Met804、Trp812、Ile963等，這個(gè)結(jié)果與上述藥效團(tuán)結(jié)果吻合，也進(jìn)一步證明了疏水及氫鍵作用在PI3Kγ選擇性結(jié)合中發(fā)揮了重要作用。

Fig. 3 Molecular dynamics simulation of IPI-549/PI3Kγ complex

3 結(jié)論

哮喘、神經(jīng)退行性疾病、心血管慢性疾病等通常伴隨著不同程度的炎癥反應(yīng)，大量研究已經(jīng)表明PI3K 相關(guān)信號(hào)通路與免疫細(xì)胞的生存和功能實(shí)現(xiàn)具有密切關(guān)系。隨著PI3K 各亞型生物功能研究的深入，發(fā)現(xiàn)PI3Kγ在免疫系統(tǒng)中起著重要且獨(dú)特的作用，從而揭示了PI3Kγ 潛在的炎癥治療成靶性。但是，目前鮮有PI3Kγ 抑制劑用于炎癥治療的研究，從而缺乏PI3Kγ 炎癥治療研究的工具藥物。IPI-549是現(xiàn)已進(jìn)入臨床研究的PI3Kγ抑制劑，其具有活性強(qiáng)、選擇性高的特點(diǎn)。但是其研究主要集中于腫瘤治療，目前尚沒(méi)有抗炎作用的評(píng)價(jià)。因此，本文采用IPI-549 進(jìn)行其抗炎作用的初步評(píng)價(jià)。炎癥細(xì)胞模型體外實(shí)驗(yàn)表明，IPI-549 沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性，IPI-549 可以濃度依賴性地抑制炎癥細(xì)胞中PI3K 信號(hào)通路，從而有效地抑制LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 的釋放。上述實(shí)驗(yàn)表明，IPI-549 可以通過(guò)抑制炎癥細(xì)胞中PI3K 信號(hào)通路來(lái)抑制炎癥因子的釋放，從而初步驗(yàn)證了PI3Kγ 抑制劑在炎癥治療方面的潛在作用，也證明了IPI-549 可以作為PI3Kγ 抑制劑炎癥治療的有效工具藥物。

隨后使用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)對(duì)IPI-549 的PI3Kγ選擇性機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究。通過(guò)分別構(gòu)建基于PI3Kγ小分子抑制劑及PI3Kγ蛋白大分子的藥效團(tuán)，發(fā)現(xiàn)疏水及氫鍵作用在抑制劑與PI3Kγ結(jié)合過(guò)程中發(fā)揮主要作用。動(dòng)力學(xué)模擬的結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了藥效團(tuán)特征：Val882產(chǎn)生的氫鍵作用保證了抑制劑與PI3Kγ 的高效結(jié)合；Met804、Trp812、Ile963 等關(guān)鍵氨基酸提供了顯著的疏水作用；IPI-549 的甲基吡唑基團(tuán)可以進(jìn)一步深入PI3Kγ 的“選擇性口袋”位置，從而進(jìn)一步提高IPI-549 的PI3Kγ 選擇性。上述構(gòu)效關(guān)系研究可以為新型PI3Kγ抑制劑的開(kāi)發(fā)提供一定的指導(dǎo)作用。

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