李長碩 李碩果 季 剛 王 麗* 李勁濤 王 莉 賈 星張小云 韓曉東* 吉 元* 孫 飛

（1）北京工業(yè)大學(xué)材料與制造學(xué)部，北京 100124；2）中國科學(xué)院生物物理研究所蛋白質(zhì)科學(xué)研究平臺生物成像中心，北京 100101；3）北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100124；4）生物島實驗室，廣州 510005）

生物成像技術(shù)的飛躍發(fā)展，為從細(xì)胞、亞細(xì)胞、單分子及基因的不同層面了解生命過程，研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能、病理和生理變化，以及與環(huán)境之間的信號作用提供了強(qiáng)大的觀測手段。傳統(tǒng)的熒光光學(xué)顯微鏡（fluorescence light microscope，F(xiàn)LM）可直接觀察活細(xì)胞，獲得細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能相關(guān)的動力學(xué)信息［1-2］，但受限于光學(xué)衍射極限，光學(xué)成像分辨率只能達(dá)到~200 nm，無法觀察小于百納米尺度的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)及單分子［3-5］。超分辨熒光顯微鏡突破了光學(xué)衍射極限，把光學(xué)成像的分辨率提高到了數(shù)十納米［6-10］，為細(xì)胞生物學(xué)研究提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）的分辨率已達(dá)到亞埃級，可解析生物大分子的分子結(jié)構(gòu)［11-17］。掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）的分辨率已達(dá)到亞納米級，可識別標(biāo)記的單一膜蛋白分子［18-19］。光鏡電鏡關(guān)聯(lián)（correlative light and electron microscopy，CLEM）技術(shù)結(jié)合了熒光特異標(biāo)記和電鏡高分辨率成像的優(yōu)勢，為原位結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究提供了強(qiáng)有力的分析手段，但為適配電鏡和光鏡兩種成像模式，CLEM技術(shù)流程難以克服樣品在不同成像系統(tǒng)之間的傳輸難題和圖像關(guān)聯(lián)匹配精度低等瓶頸，且面臨著兩種成像模式分辨率不匹配（相差1~2個量級）的挑戰(zhàn)。

陰極熒光（cathodoluminescence，CL），是電子束激發(fā)固體發(fā)光材料發(fā)射光子的現(xiàn)象，采用CL成像，可以獲得突破光學(xué)衍射極限的熒光圖像［16，20-21］。相對于傳統(tǒng)的FLM技術(shù)，CL成像技術(shù)的主要優(yōu)勢在于高度局部化的激發(fā)［22］：入射電子束被聚焦到~1 nm 尺度，CL 像的分辨率可達(dá)到電子像的水平（十幾到幾十納米）。近幾年來，基于SEM 的陰極熒光與電鏡關(guān)聯(lián)（correlative cathodoluminescence and electron microscopy，CCLEM）技術(shù)已在無機(jī)納米晶體材料中得到應(yīng)用［12-14，22］。在SEM-CL 系統(tǒng)中，采用CCLEM 成像，可以同時獲得由電子束激發(fā)產(chǎn)生的電子像和CL 像，并解決了兩種成像模式之間分辨率不匹配的問題。此外，與CLEM 技術(shù)比較，CCLEM 技術(shù)也不需要為適配兩種成像模式引入的樣品傳輸、定位，及圖像關(guān)聯(lián)等技術(shù)流程。CL 譜儀已廣泛用于地質(zhì)及半導(dǎo)體材料的性能和結(jié)構(gòu)測試，以及納米光子學(xué)及等離子激元物理性能等研究［20，23-24］，而生物材料的電子束敏感性則限制了CL技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)中的廣泛應(yīng)用［25-26］。研究和發(fā)展CL 技術(shù)在生物樣品中的應(yīng)用，需要探究電子輻照引起碳基材料的結(jié)構(gòu)損傷、有機(jī)基團(tuán)的降解，及熒光猝滅等問題，還需要研究電子源對有機(jī)化合物（熒光染料及熒光蛋白等熒光標(biāo)簽）的激發(fā)及發(fā)光特性。

本文采用SEM-CL系統(tǒng)，研究電子源對有機(jī)物的激發(fā)特性，通過改變輻照能量、電子束束流，及輻照劑量，研究了不同成像方式下有機(jī)熒光團(tuán)的CL 發(fā)光特性和成像特點，并應(yīng)用CCLEM 技術(shù)，觀察了染料分子及熒光蛋白標(biāo)記的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。Crossing）指系間跨越。

Fig. 1 The principle of the fluorescence-excitationemission of organics

1 材料與方法

1.1 實驗原理及方法

實驗采用場發(fā)射環(huán)境掃描電鏡（Thermo fisher Quanta 600 FEG ESEM）和陰極熒光譜儀（Gatan Mono3+CL）。圖1為有機(jī)物的熒光發(fā)射原理。陰極熒光是固體發(fā)光材料在電子束輻照下產(chǎn)生的弛豫發(fā)光［21，25］。在有機(jī)材料中，電子在分子軌道中輻射躍遷。處于基態(tài)S0的分子吸收電子后，電子從基態(tài)S0被激發(fā)到單穩(wěn)激發(fā)態(tài)Sn，躍遷到單穩(wěn)激發(fā)態(tài)S1，再由單穩(wěn)激發(fā)態(tài)S1輻射躍遷到基態(tài)S0發(fā)射熒光；若從單穩(wěn)激發(fā)態(tài)S1態(tài)躍遷到三穩(wěn)態(tài)T1，再輻射躍遷到基態(tài)S0態(tài)，則發(fā)射磷光。圖1 中ISC（InterSystem圖2為SEM-CL系統(tǒng)的成像裝置及成像原理示意圖。圖2a 為SEM-CL 系統(tǒng)的裝置示意圖。二次電子（secondary electrons，SE）信號由SE 探頭接收；CL信號由CL譜儀的拋物面接收鏡收集，再通過光電倍增管（photomultiplier，PMT）探測器，收集紫外-紅外波段的光譜及CL全光像；或通過光譜儀的衍射光柵分光后，再傳至PMT 收集光譜及單光像。圖2b 為裝配了一個自制的薄樣品成像裝置［27］的SEM-CL 系統(tǒng)，SE 和CL 信號的接收方式同圖2a 所示。入射電子束在塊樣品（圖2c）和薄樣品（圖2d）中的作用范圍（R）及激發(fā)產(chǎn)生的主要電子和光子信號，分別對應(yīng)于圖2a 和2b 所示的成像裝置。在圖2b 所示的薄樣品成像裝置中，薄樣品（電子束可穿透的薄膜及細(xì)胞等）放置在一個由Si芯片支撐的Si3N4薄窗口（SiN-Si）上，SiN窗口厚度100 nm，面積0.5×0.5 mm2（SG050D，蘇州原位芯片科技有限責(zé)任公司），薄樣品厚度100 nm到幾微米。如圖2d 所示，入射電子穿透薄樣品或樣品薄區(qū)，以及SiN-Si襯底，產(chǎn)生了部分透射電子（TE），使電子作用范圍（R）減小，即減少了形成SE 像的背底信號強(qiáng)度，包括經(jīng)過多重非彈性散射產(chǎn)生的背散射電子（BSE）及BSE在出射過程中激發(fā)產(chǎn)生的SE（SE2），從而增加了低能量二次電子SE（SE1）產(chǎn)額，提高SE 像襯度。同時也減小了CL 信號的散射寬度及作用范圍，提高CL 像的分辨率。

Fig. 2 SEM-CL system and the signals produced by electron beam in the sample

本實驗使用的SEM-CL 系統(tǒng)的主要操作參數(shù)：加速電壓2~30 kV，電子束束流10-11~10-10A，常用束斑尺寸（spot size，SP）為SP3、SP4和SP5，其對應(yīng)的電流值為，SP3：7.944×10-11A，SP4：2.667 8×10-10A，SP5：8.447 3×10-10A （pA 表實測），電子像的像素1 024×768，駐留時間30 μs，掃描時間27.8 s/幀。CL 譜儀測量精度為0.6 nm，光柵1 200 line/mm，PMT電壓600~1 500 V，CL像的像素1 024×1 024，駐留時間100 μs，掃描時間104 s/幀。采用ImageJ 軟件，根據(jù)CL 像的像素灰度值確定熒光相對發(fā)射強(qiáng)度。

1.2 樣品

1.2.1熒光微珠及細(xì)胞樣品

本實驗采用熒光聚苯乙烯微珠（賽默飛世爾科技（中國）有限公司，以下簡稱賽默飛），測定有機(jī)熒光團(tuán)的CL 發(fā)射特性及CL 成像效果。熒光基團(tuán)被聚苯乙烯微珠包覆，可以降低環(huán)境對熒光基團(tuán)發(fā)光強(qiáng)度的影響。紅色微珠粒徑為1 μm（貨號F13083）和500 nm（貨號F8812），激發(fā)和發(fā)射波長分別為λex=555 nm 和λem=600 nm；綠色微珠直徑為200 nm（貨號F8767），λex=488 nm和λem=525 nm；藍(lán)色微珠直徑為100 nm（貨號F8767），λex=405 nm和λem=445 nm。以上熒光微珠在原液基礎(chǔ)上稀釋50倍后，滴在鋁樣品臺上，干燥后進(jìn)行SEM-CL觀測。

細(xì)胞樣品包括食管癌細(xì)胞（Eca109）和人腎上皮細(xì)胞（293T）（中國疾控中心病毒所，曾毅院士實驗室），均采用常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)方法制備［19］。

1.2.2熒光標(biāo)記

熒光標(biāo)記內(nèi)容包括：a. 采用DAPI 染料（貨號62247，賽默飛公司）對Eca109細(xì)胞核染色；b. 采用增強(qiáng)的綠色熒光蛋白（EGFP）轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞（Eca109-EGFP）；c. 采用紅色熒光蛋白mCherry 標(biāo)記293T 細(xì)胞的膜蛋白ACE2（細(xì)胞血管緊張酶轉(zhuǎn)化素）。

1.2.3細(xì)胞的襯底材料

細(xì)胞樣品通過爬片生長或細(xì)胞懸液滴片的方式承載到襯底上。本實驗采用了3 種襯底：a. ITO 導(dǎo)電薄膜襯底，ITO 薄膜厚度185 nm，電阻率≤6 Ω/sq［28］，采用該襯底消除非導(dǎo)電樣品的荷電現(xiàn)象（深圳華南湘城科技有限公司）；b. SiN-Si襯底，采用該襯底配合薄樣品成像裝置使用（圖2b）；c. Si芯片襯底，為SiN-Si薄窗口的Si支撐芯片。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光微珠的SEM-CL觀測

2.1.1熒光微珠的CL發(fā)射強(qiáng)度及CL成像

采用SEM-CL 系統(tǒng)（圖2a），在較低加速電壓（4 kV）輻照下，觀察不同粒徑及不同發(fā)光波長的熒光微珠（圖3）。圖3a，b 為直徑1 μm 紅色微珠的CL 像和SE 像，圖3c，d 為500 nm 紅色微珠的CL 像和SE 像。觀察結(jié)果顯示，熒光珠的CL 像具有較高的熒光強(qiáng)度、明亮的襯度，及足夠的信噪比（signal to noise ratio，SNR）。圖3e，f 為200 nm 綠色微珠的CL 像和SE 像，在CL 像中可分辨單個發(fā)光微珠。圖3g，h為100 nm藍(lán)色微珠的CL像和SE像，在CL 像中仍可顯示出100 nm 微珠的發(fā)光中心，估算CL 像的分辨率（d）可達(dá)到幾十納米（~30 nm）（圖3g 插圖）。此外，在CL 像中還測出一些最近鄰發(fā)光顆粒的間距，分別在30~40 nm 之間。有機(jī)物CL像的分辨率與文獻(xiàn)報道的20~50 nm有機(jī)物的CL像分辨率，及超分辨熒光顯微鏡的分辨率相當(dāng)［16，29-30］。通常有機(jī)物的CL像分辨率低于無機(jī)物的分辨率（15~20 nm）［31］，本研究觀察結(jié)果顯示，有機(jī)熒光團(tuán)的CL 像分辨仍遠(yuǎn)高于光學(xué)衍射極限。綜上所述，電子源可在較大的能量/波長范圍內(nèi)，激發(fā)從紫外到紅外光譜的多個躍遷，采用低能量電子激發(fā)有機(jī)熒光基團(tuán)，可同時獲得電子像（單色，顯示電子密度）及CL 像（多色，顯示波長），CL 信號具有較高的光量子產(chǎn)額及成像分辨率。

Fig. 3 SEM-CL imaging of fluorescent beads （FL beads），4 kV，SP4

2.1.2電子激發(fā)條件對熒光微珠發(fā)光強(qiáng)度的影響

電子激發(fā)條件包括電子束束流、輻照時間，及輻照劑量。圖4 為入射電子能量和束流對CL 發(fā)射強(qiáng)度的影響。當(dāng)改變加速電壓（3、5、30 kV）時，在500 nm綠色微珠的CL像中都呈現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度（圖4a~c）。圖4d給出了綠色微珠發(fā)光強(qiáng)度隨加速電壓的變化，CL 發(fā)射強(qiáng)度由ImageJ 軟件提取CL 像的像素灰度值確定。觀測結(jié)果表明，改變加速電壓沒有使CL 發(fā)光強(qiáng)度發(fā)生明顯變化。作為連續(xù)激發(fā)源，入射電子能量可在較大范圍內(nèi)調(diào)整，而對有機(jī)熒光團(tuán)發(fā)光強(qiáng)度的影響較小。在高能量電子（30 keV）激發(fā)下熒光微珠未產(chǎn)生光猝滅；在低能量電子（3 keV）激發(fā)下，熒光團(tuán)仍保持了較高的發(fā)光強(qiáng)度。對光子成像，低能量激發(fā)減小了CL 產(chǎn)生的體積，提高了CL 像的分辨率（圖2d）；對電子成像，低能量激發(fā)減小了電子作用范圍（R），可消除荷電現(xiàn)象，并增加SE產(chǎn)額（δ）（公式（1），E0：入射電子能量），獲得更多表面信息［32］，提高SE像襯度。

R可通過蒙特卡洛模擬獲得（圖4e），模擬電子數(shù)量為30 000 個；并通過公式（2）［33］計算求出，式中，A：原子質(zhì)量；Z：原子序數(shù)；ρ：密度（g/cm3），碳密度：1.8 g/cm3，R=0.63 μm（5 kV），2.15 μm（10 kV），14.86 μm（30 kV）。

模擬與計算結(jié)果相符，特別在5~10 kV 更吻合。模擬和計算結(jié)果顯示，帶有5 keV能量電子的穿透深度（R：~0.6 μm）已超過熒光微珠尺寸（R：100~500 nm），故產(chǎn)生的CL 信號已是整個熒光微珠的平均信號，繼續(xù)增加電子能量也難以再增加CL光量子產(chǎn)額。此外，調(diào)整電子束束流，使束流增加一個量級（從7.944×10-11A到8.447 3×10-10A），相應(yīng)束斑尺寸從SP3增加到SP5，發(fā)光強(qiáng)度也沒有明顯增加（圖4f~h）。綜上所述，采用低電壓及低束流激發(fā)有機(jī)熒光團(tuán)，可獲得亮度高、襯度好，及SNR高的CL 像，還有利于減少局部的累積劑量及潛在的輻照損傷［16］。

Fig. 4 Effects of incident electron energy and beam current on emission intensity and CL imaging of the 500 nm green FL beads, 20 000×, PMT: 1 400 V

2.1.3熒光微珠CL強(qiáng)度的衰減特性

在低電壓（5 kV）及低束流（SP3）輻照下，對500 nm 綠色微珠的同一視場進(jìn)行連續(xù)掃描，記錄下26 min內(nèi)獲得的15幅CL像。圖5a給出了其中輻照時間為1.7、5.2、8.7、12.0、13.9、15.6、17.3、26.0 min，相對應(yīng)的第1、3、5、7、8、9、10、15 幅CL 像。CL系列像清楚顯示出CL像的亮度及SNR隨輻照時間增加而降低的現(xiàn)象。表1列出了單個熒光微珠（圖5a 左圖中箭頭所示）的電子輻照時間、累計輻照量、CL 強(qiáng)度衰減的數(shù)據(jù)。累計輻照量由電子輻照劑量（q）（公式（3）［34］）和輻照時間求出。

電子輻照劑量（q），即每單位面積樣品的電子數(shù)，決定了電子束對樣品的損傷程度，取決于電子束電流、駐留時間、掃描面積，式中，τ：輻照時間，5×10-5s，I：探針電流（A），I=7.94 4×10-11A，e：電子電荷，1 e=1.6×10-19C，d：像素尺寸，d為分辨率，d=30 nm。熒光強(qiáng)度的衰減由ImageJ軟件提供的像素灰度/熒光強(qiáng)度的變化確定。圖5b給出CL強(qiáng)度衰減隨輻照時間的變化曲線。從圖5a中的CL成像質(zhì)量及熒光衰減率可知，從第1幅（1.7 min）到第7 幅（12.0 min）CL 像，CL 強(qiáng)度衰減了~25%，但CL像仍保留了可接受的發(fā)光強(qiáng)度及足夠的SNR。從第8 幅CL 像（13.9 min）以后，CL 衰減從~27%增加到~52%，出現(xiàn)嚴(yán)重的光猝滅，難以清晰成像。通常認(rèn)為有機(jī)分子在電子束輻射下會迅速漂白［34-35］，但本文的觀測表明，在較低電壓及較低束流作用下，有機(jī)熒光團(tuán)可經(jīng)受較長時間的電子輻照（~12 min）。

Fig. 5 Effects of the radiation time of e-beam on CL intensity of 500 nm green FL beads

從圖5c 看出，隨著輻照時間增加，單個熒光微珠（圖5a 左圖中箭頭所示）強(qiáng)度峰下降，同時強(qiáng)度峰的起伏程度也隨之加大（三角形標(biāo)記所示）。這表明，CL 強(qiáng)度的衰減受兩方面因素的影響：電子輻照引起熒光強(qiáng)度整體下降，以及電子束誘導(dǎo)的局部損傷或表面缺陷使微區(qū)熒光強(qiáng)度降低。在5 kV下，輻照缺陷對500 nm綠色熒光珠的CL發(fā)光強(qiáng)度的影響范圍約100 nm，與陰極熒光被局域激發(fā)的特性相符。

Table 1 Electron irradiation time， cumulative irradiation dose and CL intensity attenuation of green fluorescent microbeads

2.2 亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的SEM-CL成像

采用SEM-CL系統(tǒng)，觀察了染料及熒光蛋白標(biāo)記的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，包括細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜（圖6）。圖6a，b 是DAPI 染色Eca109 細(xì)胞核的SE像及CL 像（10 000×），將懸浮細(xì)胞液滴在ITO 襯底上，干燥后觀察。在圖6b的CL像中，顯示出由一個細(xì)胞核內(nèi)發(fā)出的較強(qiáng)且分布不均勻的熒光信號。受限于電子束的作用深度，發(fā)射出的CL信號只能顯示出細(xì)胞內(nèi)靠近上表面的染色細(xì)胞核的部分結(jié)構(gòu)。不均勻的熒光亮度反映出DAPI標(biāo)記的靠近核膜部分的異染色質(zhì)的不均勻分布。由于缺乏重金屬染色，難以結(jié)合電子像確定熒光標(biāo)記的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，但CL像顯示出的非均布的發(fā)光中心，體現(xiàn)了電子束高度局部激發(fā)的特征［22］。此外，由于CL信號的生成體積遠(yuǎn)大于SE 信號近表面的生成體積，SE顯示出的是細(xì)胞的表面形貌，而CL則更多顯示出細(xì)胞膜下一定深度內(nèi)的發(fā)光結(jié)構(gòu)。成像結(jié)果還顯示，CL像中的發(fā)光位置與SE像中相應(yīng)位置的表面特征并非一一對應(yīng)，而是形成了較多的發(fā)光中心，說明CL 像主要顯示了熒光分子標(biāo)記的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。以上結(jié)果說明，電子和光子成像模式相結(jié)合（CCLEM），可提供從細(xì)胞表面到內(nèi)部一定深度內(nèi)（取決于入射電子能量及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的特征）的結(jié)構(gòu)信息。

圖6c，d 是對增強(qiáng)綠色熒光蛋白（EGFP）轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞（Eca109-EGFP）的觀察，采用ITO襯底。CL 像顯示EGFP 在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)高表達(dá)，形成均勻而明亮的襯度，能清晰地區(qū)分發(fā)光的細(xì)胞質(zhì)與不發(fā)光的細(xì)胞核。

圖6e，f 為采用SEM-CL 系統(tǒng)（圖2a），觀察生長在Si襯底上，由紅色熒光蛋白mCherry轉(zhuǎn)染的293T 細(xì)胞膜蛋白ACE2 （293T-ACE2-mCherry）。在圖6f 的CL 像中，細(xì)胞整體顯示出均勻的亮度。與此相比較，采用自制的薄樣品成像裝置及SiN薄窗口襯底（SiN-Si）（圖2b） 對293T-ACE2-mCherry細(xì)胞成像，則顯示出明顯不同的襯度。在SE 像中，細(xì)胞周邊形成了明亮的形貌襯度（圖6g）；在CL 像中，細(xì)胞周邊也形成了明亮的熒光襯度，體現(xiàn)出ACE2廣泛定位于細(xì)胞膜上（圖6h）。由此可見，薄膜成像方式突出了熒光標(biāo)記的結(jié)構(gòu)，并使形貌像與熒光像形成了可比較的襯度。對襯度的說明參考圖2d，薄樣品成像通過產(chǎn)生部分TE（TE 的數(shù)量取決于入射電子能量及樣品的質(zhì)量厚度），減小電子作用范圍（R）的方式，增加了表面敏感的低能SE（SE1）產(chǎn)額，提高了SE像襯度；同時，通過減小CL 發(fā)光中心的橫向及縱向擴(kuò)展，提高了CL像的分辨率。在圖6i 薄樣品成像原理示意圖中，展示了入射電子作用于SiN-Si襯底上的一個熒光標(biāo)記細(xì)胞激發(fā)產(chǎn)生的電子（SE和TE）及光子（CL）信號。與電子束掃描細(xì)胞內(nèi)部比較，掃描邊緣薄區(qū)可產(chǎn)生更多數(shù)量的TE，從而提高了SE（SE1）的發(fā)射幾率及對CL 發(fā)光中心的分辨能力，結(jié)合形貌和熒光襯度，可更清楚地識別熒光標(biāo)記的細(xì)胞膜蛋白的位置。通過模擬和計算也可知［34］，在9~10 kV下，入射電子在細(xì)胞中的作用范圍（R）約2 μm，大于爬片細(xì)胞邊緣厚度，可產(chǎn)生一定量的TE。此外，結(jié)合293T-ACE2-mCherry 細(xì)胞膜蛋白的整體分布信息與免疫金（Au-NPs）特異性標(biāo)記的293T-ACE2-AuNP 細(xì)胞膜蛋白單分子分布信息［28］，可以更準(zhǔn)確地確定膜蛋白在原生細(xì)胞表面的位置、分布及表達(dá)量，并支持膜蛋白與細(xì)胞的功能研究，及靶向藥物的研發(fā)。

Fig. 6 SEM-CL observation of fluorescent labeled cells

以上對亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的觀察表明，采用低能量電子激發(fā)（2.5~5 keV），使電子作用體積與亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的尺寸相匹配，可在信號強(qiáng)度、分辨率、襯度，及信噪比之間達(dá)到較好的權(quán)衡，并減少電子輻照損傷。 此外， 常用熒光標(biāo)簽（DAPI、 EGFP、mCherry染料分子及熒光蛋白等）發(fā)射出可探測到的光子，表明通過調(diào)整電子穿透深度束流輻照劑量等參數(shù)，以及選擇不同的成像方式，可實現(xiàn)對細(xì)胞表面至內(nèi)部一定深度內(nèi)的激發(fā)及CL信號探測。

3 結(jié)論

采用CCLEM的成像技術(shù)，觀測了有機(jī)熒光團(tuán)和熒光標(biāo)記的細(xì)胞樣品。研究了電子激發(fā)源對有機(jī)樣品的激發(fā)特性，包括輻照能量、電子束束流、輻照劑量，觀測了CL 信號的發(fā)射特性、強(qiáng)度衰減、成像方式及成像特點。在SEM-CL系統(tǒng)中，電子激發(fā)源束斑和CL信號可被控制在納米尺度，有機(jī)熒光微珠的CL像分辨率可達(dá)到~30 nm。采用低能量（2.5~5 keV）及低束流（~10 pA）激發(fā)，CL 像呈現(xiàn)出較高的熒光強(qiáng)度和明亮的襯度，允許熒光微珠經(jīng)過較長時間輻照（~12 min，CL 信號衰減了~25%）仍保留可接受的CL強(qiáng)度及足夠的SNR，并可減少對生物樣品的輻照損傷。采用低能量和低束流電子激發(fā)，及不同的成像方式，獲得了從細(xì)胞表面及表層下一定深度內(nèi)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)信息。

4 展望

受限于光學(xué)衍射極限，通過熒光成像技術(shù)表征納米尺度的生物結(jié)構(gòu)具有極大的挑戰(zhàn)性?；趻呙桦婄R/環(huán)境掃描電鏡的CCLEM技術(shù)在這方面具有進(jìn)一步發(fā)展的空間和應(yīng)用潛力，未來可預(yù)見的發(fā)展方向包括且不限于以下方面：a. 采用SEM-CL模式提高CL像的分辨率，實現(xiàn)對單一膜蛋白分子的熒光定位；b. 采用低溫樣品制備及低溫成像方式，使發(fā)射光的能量分布變窄，增強(qiáng)熒光標(biāo)記的生物樣品的發(fā)光強(qiáng)度及量子產(chǎn)額，提高CL 像的分辨率；c. 開發(fā)高量子產(chǎn)額及高穩(wěn)定性的有機(jī)和無機(jī)熒光標(biāo)記，如量子點、稀土摻雜的納米熒光團(tuán)等，允許探測多個位點，并實現(xiàn)單分子熒光定位；d. 開發(fā)活細(xì)胞CCLEM技術(shù)，結(jié)合“濕”環(huán)境和液體成像［20］，及微流控技術(shù)，保存活體信息，為活細(xì)胞電子顯微成像提供可能。總之，CCLEM技術(shù)的多模態(tài)、跨尺度成像方式，及可調(diào)控的成像環(huán)境，為細(xì)胞結(jié)構(gòu)（表面及內(nèi)部）及功能研究提供了亞微米~納米水平分辨率的觀測平臺。CCLEM 技術(shù)可作為CLEM技術(shù)的重要補(bǔ)充，并可發(fā)展成為一種表征亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)標(biāo)記單分子的高分辨生物成像技術(shù)。

致謝感謝Gatan Inc.公司趙越經(jīng)理及陸暢博士的技術(shù)支持，感謝北京大學(xué)物理學(xué)院徐軍教授、北京協(xié)和醫(yī)院吳煒教授及華天瑞博士、金竟公司何超博士及王凱博士，以及Delmic 公司任辛博士給予的學(xué)術(shù)及技術(shù)探討。

數(shù)據(jù)可用性聲明本論文的關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)（doi:10.577601 sciencedb.09062；CSTR：31253.11.sciencedb.09062） 可在Science Data Bank 數(shù)據(jù)庫（https://www.scidb.cn/s/RfiQN3）中訪問獲取。