巫旗生，祁劍飛，羅 娟，寧 岳，郭 香，羅輝玉，曾志南

(福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 廈門 361013)

菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)隸屬軟體動物門、雙殼綱、簾蛤科，為我國四大海水養(yǎng)殖貝類之一[1]，具有養(yǎng)殖方式簡單、周期短、投資少、效益高等優(yōu)點。2021 年中國蛤類產(chǎn)量達 428.98 ×104t，占中國海水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的 19.40%[2]，其中菲律賓蛤仔產(chǎn)量超過300×104t，位居世界首位。菲律賓蛤仔是福建省重要的海水養(yǎng)殖貝類品種之一，目前其養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)量在福建省僅次于牡蠣，位居第二位。福建是中國菲律賓蛤仔苗種最主要的生產(chǎn)和供應(yīng)基地，占全國苗種產(chǎn)量的90%以上[2]，苗種生產(chǎn)方式主要為墾區(qū)大水面人工育苗[3-5]和工廠化人工育苗[6-9]。福建菲律賓蛤仔苗種除滿足中國需求外，還遠銷東南亞等沿海國家。

在海水貝類人工繁育過程中，配子的質(zhì)量直接影響到受精率、孵化率以及幼蟲的生長速度、存活率、附著變態(tài)等[10]。大部分海水貝類解剖獲得的配子需要采用化學藥物[維生素、氨海水、5-羥色胺(5-HT)、多巴胺、組胺等]進行激活或促熟(生發(fā)泡破裂)，從而使受精卵發(fā)育至幼蟲[11]。王昭萍等[12]采用維生素浸泡太平洋牡蠣(Crassostreagigas)卵子，促進了成熟度較差的卵子進一步成熟，從而提高卵子的受精率。鄧海姣[10]和李浩浩等[13]采用了不同濃度的氨海水處理櫛江珧(Atrinapectinata)的解剖配子，結(jié)果表明一定濃度范圍內(nèi)的氨海水浸泡可以促使卵子成熟及激活精子，提高卵子的受精率，而5-HT、多巴胺和維生素對櫛江珧解剖卵子的促熟效果不明顯。邸煒鵬等[14]對櫛孔扇貝(Chlamysfarrer)解剖卵子進行了體外促熟研究，結(jié)果表明一定濃度的氨海水可顯著促使卵子生發(fā)泡破裂，但受精率不高；5-HT不能誘導(dǎo)卵子生發(fā)泡破裂，但能促使生發(fā)泡破裂的卵子進一步成熟；先用氨海水處理，再用5-HT處理，可以得到最佳誘導(dǎo)效果。本研究采用氨海水和5-HT對菲律賓蛤仔的解剖配子進行體外促熟，統(tǒng)計卵子的生發(fā)泡破裂發(fā)生率和受精率，觀察受精卵胚胎發(fā)育情況，明確氨海水和和5-HT處理菲律賓蛤仔配子的適宜濃度范圍，為菲律賓蛤仔的選擇育種及多倍體育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 配子的獲得

實驗用菲律賓蛤仔為福建省寶智水產(chǎn)科技有限公司土池養(yǎng)殖的1齡親貝，平均體質(zhì)量為(12.13±2.08)g，平均殼長為(3.88±0.29)cm，平均殼高為(2.66±0.28)cm，平均殼寬為(1.78±0.22)cm。將土池促熟后的菲律賓蛤仔解剖，從中選擇性腺飽滿的雌雄個體，分別擠出卵、精。精子：采用400目篩絹網(wǎng)過濾雜質(zhì)，獲取精液；卵子：先用250目篩絹網(wǎng)過濾大顆粒組織等，再用400目篩絹網(wǎng)過濾黏液等。鏡檢配子的成熟度，選擇發(fā)育成熟的配子開展體外促熟實驗。

1.2 解剖配子的體外促熟

在實驗室恒溫(25 ℃)條件下，分別取50 mL卵液或20 mL精液加入100 mL燒杯中，再添加不同濃度的氨海水處理液或5-HT處理液，卵子密度為100～500個/mL，搖勻后開始計時。氨海水處理液的濃度梯度設(shè)置為0.002 5%、0.005%、0.010%、0.015%、0.020%和0.025%，5-HT處理液的濃度梯度設(shè)置為0.01、0.1、1、10、100、1 000 μmol/L，處理時間梯度為15、30、45、60 min。以自然海水處理的配子作為對照，每個實驗組設(shè)置3個平行。

1.3 人工授精

采用400目篩絹網(wǎng)過濾去除氨海水處理液或5-HT處理液，將收集到的卵子放入100 mL燒杯中，先加入50 mL自然海水，再加入適量精子，確保一個卵子周圍有5～10個精子，充分搖勻。在受精過程中，需要經(jīng)常攪動受精卵液，增加水體溶解氧含量。

1.4 觀察記錄生發(fā)泡破裂發(fā)生率和受精率

受精卵胚胎發(fā)育1 h后，使用顯微鏡觀察記錄并計算卵子的生發(fā)泡破裂發(fā)生率和受精率。

生發(fā)泡破裂發(fā)生率=生發(fā)泡破裂的卵子數(shù)量/卵子總數(shù)×100%

(1)

受精率=卵裂的受精卵數(shù)量/卵子總數(shù)×100%

(2)

1.5 數(shù)據(jù)處理

獲得的實驗組數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，利用多重比較檢驗不同實驗組間差異的顯著性，顯著水平設(shè)置為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 菲律賓蛤仔精子體外激活及卵子體外促熟的過程

采用自然海水或5-HT處理液浸泡均不能激活菲律賓蛤仔解剖精子，0.010%～0.025%氨海水可以有效激活解剖精子。菲律賓蛤仔解剖卵子經(jīng)過自然海水的浸泡，生發(fā)泡不會發(fā)生破裂(圖1A)；采用5-HT處理液或氨海水處理液浸泡菲律賓蛤仔的卵子后，生發(fā)泡發(fā)生破裂(圖1B)；菲律賓蛤仔的卵子經(jīng)過體外促熟后受精，一部分受精卵可以進行正常的胚胎發(fā)育(圖1C)；一部分受精卵出現(xiàn)胚胎發(fā)育緩慢及畸形等現(xiàn)象(圖1D)。

2.2 5-HT對菲律賓蛤仔卵子的促熟作用

采用5-HT處理液浸泡可以顯著促使菲律賓蛤仔卵子的成熟(圖2)，隨著處理時間的延長，生發(fā)泡破裂發(fā)生率均顯著升高(P<0.05)，表現(xiàn)出時間依賴關(guān)系。當處理時間相同時，采用0.01～ 0.1 μmol/L 5-HT處理液浸泡菲律賓蛤仔卵子，生發(fā)泡破裂發(fā)生率差異不顯著(P>0.05)；當采用1 μmol/L～1 mmol/L 5-HT處理液浸泡菲律賓蛤仔卵子，生發(fā)泡破裂發(fā)生率差異顯著(P<0.05)，表現(xiàn)出濃度依賴關(guān)系。當采用 1 mmol/L 5-HT處理液浸泡菲律賓蛤仔卵子60 min時，生發(fā)泡破裂發(fā)生率最高，達79.31%。

注：同一時間點標有不同小寫字母表示組間有顯著性差異 (P<0.05)；標有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異 (P>0.05)。下同。

菲律賓蛤仔卵子經(jīng)過不同濃度的5-HT處理液浸泡后進行人工授精，隨著受精時間的延長，受精率均顯著升高(P<0.05)，表現(xiàn)出時間依賴關(guān)系(圖3)。當處理時間相同時，表現(xiàn)出一定的濃度依賴關(guān)系，10～100 μmol/L 5-HT處理組的卵子受精率顯著高于其他處理組(P<0.05)。其中，采用10 μmol/L 5-HT處理液浸泡菲律賓蛤仔卵子60 min獲得的受精率最高，為28.38%。

2.3 氨海水對菲律賓蛤仔卵子的促熟作用

采用氨海水處理液浸泡可以顯著促使菲律賓蛤仔卵子的成熟(圖4)，隨著處理時間的延長，生發(fā)泡破裂發(fā)生率均顯著升高(P<0.05)，表現(xiàn)出時間依賴關(guān)系。當處理時間分別為45、60 min時，生發(fā)泡破裂發(fā)生率隨濃度增加而顯著升高(P<0.05)，表現(xiàn)出濃度依賴關(guān)系。當采用0.025%氨海水處理液浸泡菲律賓蛤仔卵子60 min時，生發(fā)泡破裂發(fā)生率最高，達80.01%。

菲律賓蛤仔卵子經(jīng)過不同濃度的氨海水處理液浸泡后進行人工授精，隨著受精時間的延長，受精率均顯著升高(P<0.05)，表現(xiàn)出時間依賴關(guān)系(圖5)。當不同濃度氨海水處理組的處理時間相同時，受精率表現(xiàn)出濃度依賴關(guān)系。0.010%～0.015%氨海水處理組的卵子受精率顯著高于其他處理組(P<0.05)，其中0.015%氨海水處理浸泡60 min的卵子的受精率最高，達到41.28%。

采用不同濃度的氨海水處理液浸泡菲律賓蛤仔卵子可以顯著提高生發(fā)泡破裂發(fā)生率及受精率，但氨海水的毒性作用會導(dǎo)致受精卵的畸形率較高，其中一部分受精卵在胚胎發(fā)育過程中停滯。

3 討論

3.1 5-HT對海水貝類配子的體外促熟作用

5-HT是一種存在于動物神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)遞質(zhì)，通過相關(guān)受體調(diào)節(jié)生物體多種復(fù)雜行為[15]。Dahl E等[16]首次在雙殼類的神經(jīng)系統(tǒng)和性腺組織中發(fā)現(xiàn)5-HT。5-HT在海水貝類繁殖過程中起到重要作用，既可以促進海水貝類產(chǎn)卵、排精，也可以促使海水貝類解剖卵子成熟等[17]。Hamida L等[18]研究表明5-HT可以促進溝紋蛤仔(Ruditapesdecussatus)卵子的成熟和排放；王清等[19]也證明了5-HT對硬殼蛤(Mercenariamercenaria)卵子具有體外促熟作用。

本研究采用5-HT處理液浸泡菲律賓蛤仔的解剖卵子，表明5-HT可以有效促使卵子的生發(fā)泡破裂，生發(fā)泡破裂發(fā)生率最高達到79.31%；采用10 μmol/L 5-HT處理液浸泡卵子60 min的受精率最高，達到28.38%。這與櫛孔扇貝[14]、硬殼蛤[20]等的研究結(jié)果相似，高于櫛江珧[10]，低于鈍綴錦蛤(Tapesconspersus)[21]。這可能與卵子發(fā)育成熟度不一致有關(guān)，也可能是種間差異造成的。

3.2 氨海水對海水貝類配子的體外促熟作用

在海水貝類人工繁育過程中，采用氨海水等化學藥品浸泡誘導(dǎo)海水雙殼貝殼在排放精、卵以及促進配子成熟等方面發(fā)揮著重要作用[22]。氨海水處理液呈弱堿性，NH4OH提高了海水pH，同時增加了配子細胞膜的通透性，促進了配子物質(zhì)和能量的代謝，從而達到促熟配子的目的[23]。喻達輝等[24]認為氨海水處理液對合浦珠母貝(Pinctadamartensii)精子起激活作用的主要成分是NH4+。方永強[25]認為氨海水處理液對菲律賓蛤仔卵子起促熟作用的主要原理是通過促進細胞核和細胞器的物質(zhì)和能量代謝來起到促熟作用。

不同濃度的氨海水及不同處理時間可以顯著影響海水貝類卵子的生發(fā)泡破裂發(fā)生率、受精率和畸形率[26]。李浩浩等[13]采用0.008%～0.014%氨海水處理櫛江珧的解剖卵子，當浸泡40 min時，生發(fā)泡破裂發(fā)生率為90%，受精率最高達到88%。邸煒鵬等[14]采用0.005%氨海水處理櫛孔扇貝的解剖卵子，當浸泡30 min時，生發(fā)泡破裂發(fā)生率為100%，受精率最高達到15.88%。巫旗生等[21]采用0.020%氨海水處理鈍綴錦蛤的解剖卵子，當浸泡45 min時，生發(fā)泡破裂發(fā)生率為60.76%，受精率最高達到50.75%。本研究結(jié)果表明，采用0.015%氨海水處理菲律賓蛤仔的解剖卵子，當浸泡60 min時，生發(fā)泡破裂發(fā)生率為66.67%，受精率最高達到41.28%。采用氨海水浸泡解剖卵子可以取得較好的受精率，但是受精卵在胚胎發(fā)育過程中容易出現(xiàn)畸形、發(fā)育遲緩等現(xiàn)象。因此，在實際生產(chǎn)中，應(yīng)控制好氨海水的濃度以及處理時間，從而確保較高的受精率及較低的畸形率。