賈圓圓

(平潭綜合實驗區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村發(fā)展服務(wù)中心，福建 福州 350400)

牡蠣享有“海中牛奶”之美稱，其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，是一種高蛋白、低脂肪的健康海洋貝類[1]。牡蠣已成為中國乃至世界重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖貝類，據(jù)2022年《中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》，中國牡蠣2021年養(yǎng)殖產(chǎn)量高達581.9×104t，占海水貝類養(yǎng)殖產(chǎn)量的三分之一以上，其中福建省牡蠣養(yǎng)殖產(chǎn)量為211.2×104t，約占全國的36.29%，居全國首位[2]。隨著牡蠣養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的不斷擴大，牡蠣養(yǎng)殖病害問題日益嚴重。近年來，由牡蠣皰疹病毒1型 (Ostreid herpesvirus- 1，OsHV-1)引起的貝類大規(guī)模死亡事件給貝類養(yǎng)殖業(yè)帶來重大經(jīng)濟損失[3]。

OsHV-1通稱牡蠣皰疹病毒，隸屬皰疹病毒目(Herpesvirales)、軟體動物皰疹病毒科(Malacoherpesviridae)、牡蠣皰疹病毒屬(Ostreavirus)，是首個被發(fā)現(xiàn)的能夠感染無脊椎動物的皰疹病毒[4]。OsHV-1的感染宿主范圍較廣，能夠引起牡蠣、扇貝、蛤仔、蚶類等雙殼貝類的感染和死亡，其中牡蠣是受OsHV-1危害最嚴重的貝類[3]，研究[5]發(fā)現(xiàn)OsHV-1會感染牡蠣從貝苗到成貝的各個階段，通常幼貝的發(fā)病率和死亡率高于成貝。被OsHV-1感染發(fā)病的貝苗表現(xiàn)為活力減弱和食欲降低，癥狀出現(xiàn)5～6 d后開始死亡，通常于10 d內(nèi)全部死亡[6]。成貝發(fā)病后表現(xiàn)為食欲下降、閉殼肌收縮緩慢、黏液分泌增加等，死亡率較幼貝略低[7]。牡蠣皰疹病毒感染牡蠣各生長階段的感染部位差別不大，病變組織主要集中在外套膜、生殖腺等器官的結(jié)締組織上[8]。

OsHV-1的檢測方法一般分為形態(tài)學(xué)檢測和分子學(xué)檢測兩種。形態(tài)學(xué)檢測主要通過光鏡和透射電鏡觀察樣本的組織病理變化和病毒粒子形態(tài)結(jié)構(gòu)，1972年，F(xiàn)arley C A等[4]通過電鏡首次發(fā)現(xiàn)了牡蠣皰疹病毒。形態(tài)學(xué)檢測方法具有操作難度大、技術(shù)要求高及低病毒量時不易檢出等特點，一般需結(jié)合分子學(xué)技術(shù)確診[3，9]。分子學(xué)檢測方法主要包括PCR技術(shù)、原位雜交技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)等。PCR診斷技術(shù)具有特異性強、靈敏度高和檢測速度快等特點，已成為牡蠣以及其他水產(chǎn)動物疫病的主要檢測手段，且普通PCR、實時熒光定量PCR已成為OsHV-1的常用檢測方法。與普通PCR相比，實時熒光定量PCR能夠精確檢測病毒的感染量，因而被越來越多地應(yīng)用到OsHV-1的檢測中。本文通過普通PCR和實時熒光定量PCR等分子生物學(xué)手段對福建省具有一定代表性的牡蠣育苗場和主要成貝養(yǎng)殖海區(qū)的牡蠣開展檢測，以期為牡蠣皰疹病毒的分子學(xué)檢測及其防控方法的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

樣品采集于2020年3—5月，在福建省漳浦、詔安和莆田地區(qū)分別采集A育苗場長牡蠣(Crassostreagigas)苗5個樣本，編號1～5；B育苗場長牡蠣苗樣本5個，編號6～10；C育苗場福建牡蠣(C.angulata)苗樣品5個，編號11～15；D育苗場福建牡蠣苗樣品5個，編號16～20；E育苗場福建牡蠣5個，編號21～25；F育苗場福建牡蠣樣品5個，編號26～30。成貝采集于平潭海區(qū)、深滬灣海區(qū)和漳浦海區(qū)，每個海區(qū)采集牡蠣樣品20個。樣品取回后，于實驗室-80 ℃冰箱凍存(表1)。

表1 樣品采集信息表

1.2 引物合成

普通PCR引物的選取根據(jù)世界動物衛(wèi)生組織水生動物診斷手冊推薦使用的C2/C6特異性引物，該引物在普通PCR檢測OsHV-1中應(yīng)用最早、最廣泛，其擴增目的片段大小約700 bp，由上海美吉生物公司合成(表2)。

實時熒光定量PCR引物的選取根據(jù)世界動物衛(wèi)生組織推薦，借鑒Martenot C等[10]在TaqMan探針實時熒光定量PCR反應(yīng)中使用的BF/B4引物及B-P探針。

1.3 DNA模板的提取

稱取30 mg牡蠣樣本于1.5 mL無菌離心管中；加入Buffer ML1 350 μL、Pro K 25 μL，渦旋震蕩30 s，60 °C溫育1 h；加入氯仿∶異戊醇=24∶1的混合液350 μL，渦旋震蕩20 s，高速離心2 min(10 000 g)，取上清液250 μL至新的1.5 mL無菌離心管中；加入Buffer MBL 250 μL，渦旋震蕩15 s，70 °C溫育10 min；加入無水乙醇250 μL，渦旋震蕩15 s；取混合液700 μL轉(zhuǎn)移至柱子+2 mL收集器的組合中，高速離心1 min(10 000 g)，棄液體，收集管重復(fù)利用；加入HB Buffer 500 μL，高速離心30 s(10 000 g)，棄濾液；加入DNA Wash Buffer 700 μL，高速離心1 min(10 000 g)，棄濾液；加入DNA Wash Buffer 700 μL，高速離心2 min(15 000 g)，棄濾液；將柱子放入1.5 mL無菌離心管中，加入60 °C預(yù)熱的Elution Buffer 50 μL于柱子底部，室溫靜置2 min，高速離心1 min(10 000 g)，收集洗脫液；重復(fù)上一步，收集的洗脫液即為提取的DNA模板，立即用于實時定量PCR或保存于-20 ℃冰箱中待用。

表2 合成的引物序列

1.4 普通PCR反應(yīng)和電泳檢測

從冰箱中取出凍存的待檢測的DNA樣品1～90為模板，加入水樣為空白對照，通過普通PCR反應(yīng)擴增OsHV-1基因，反應(yīng)體系如表3所示。在PCR儀上通過如下程序進行擴增：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35個循環(huán)。通過1%瓊脂糖凝膠電泳(電壓120 V、20 min)對得到的PCR產(chǎn)物進行檢測，凝膠成像儀中觀察結(jié)果。

表3 普通PCR反應(yīng)體系

1.5 實時熒光定量PCR檢測

由于實時熒光定量PCR對低病毒載量的檢測不敏感[11]，本文根據(jù)普通PCR電泳結(jié)果，選取A、B、C育種場中電泳條帶最亮的3個陽性樣本進行實時熒光定量PCR檢測。在PCR儀上通過如下程序進行擴增：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，40個循環(huán)。反應(yīng)體系見表4。

表4 實時熒光定量PCR反應(yīng)體系

2 結(jié)果與分析

2.1 普通PCR電泳檢測結(jié)果

將提取的OsHV-1片段通過普通PCR擴增、1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如表5、圖1所示。電泳結(jié)果顯示，1～3、8～9、11～12、86～88樣本均在700 bp處出現(xiàn)電泳條帶，與目的條帶大小一致。其中1～3、8～9、11樣本中目的條帶較亮，12、86～88樣本出現(xiàn)微弱的電泳條帶，與目的條帶大小一致，其他樣本中未檢測出目的電泳條帶(圖1)。由表5可知，A、B、C育苗場和漳浦海區(qū)均檢測出OsHV-1，A育苗場陽性檢出率高達60%，B、C育苗場陽性檢出率均為40%，漳浦海區(qū)陽性檢出率為15%。此次檢測的90個樣本中，陽性檢出約10個，平均陽性檢出率為11.11%，其中幼苗樣本30個，平均陽性檢出率為23.33%，高于成貝5%的平均陽性檢出率。

表5 普通PCR電泳檢測結(jié)果

注：M為Marker；1～5為漳浦A育苗場長牡蠣樣品；8～10為漳浦B育苗場長牡蠣樣品；11～15為漳浦C育苗場福建牡蠣樣品；86～88為漳浦海區(qū)福建牡蠣成貝樣品。

2.2 實時熒光定量PCR結(jié)果

選取A、B、C育苗場中電泳條帶最亮的2、8、11三個陽性樣本進行實時熒光定量PCR檢測，檢測其取樣點的病毒最大拷貝數(shù)，結(jié)果如表6所示，2、8樣品長牡蠣的OsHV-1病毒感染量分別約為6.1×107、3.5×102copies/mg，11樣品福建牡蠣的OsHV-1病毒感染量約為3.7×102copies/mg。

表6 實時熒光定量PCR檢測結(jié)果

3 討論

瓊脂糖凝膠電泳是通過瓊脂凝膠的分子篩作用，分子量或分子形狀不同的核酸片段在電泳過程因移動速度不同而分離，通過電泳結(jié)果中產(chǎn)生的條帶強度可大致了解樣品中DNA的數(shù)量[12]。彭桂莊等[13]實驗發(fā)現(xiàn)電泳中條帶的明亮度與所測目的基因的濃度有關(guān)，電泳條帶的亮度隨著濃度的增大而增大。本研究結(jié)果顯示1～3、8～9、11樣本的牡蠣感染了OsHV-1，12、86～88樣本條帶微弱，因此上述牡蠣樣本雖然感染了OsHV-1，但其感染量相對較低。Oden E等[11]研究結(jié)果顯示，OsHV-1感染引起的宿主發(fā)病和死亡狀態(tài)主要與病毒在宿主內(nèi)的感染量相關(guān)，當(dāng)病毒感染量低于8.8×103個/mg組織時，宿主通常保持無癥狀感染狀態(tài)，當(dāng)感染量繼續(xù)增加，宿主則會發(fā)病或死亡。本文檢測結(jié)果顯示，2樣本感染的OsHV-1病毒感染量高達6.1×107copies/mg，8、11樣品的病毒感染量較低，分別為347.9、368.9 copies/mg。因此A育苗場1～3樣品長牡蠣苗種的死亡可能由OsHV-1感染引起發(fā)病所造成的，OsHV-1感染不是造成B、C育苗場牡蠣苗種死亡的主要原因。

此次檢測的90個樣本中，陽性檢出10個，平均陽性檢出率為11.11%。其中牡蠣幼苗樣本30個，平均陽性檢出率為23.33%，高于牡蠣成貝5%的平均陽性檢出率，這與于江南[14]的研究結(jié)果類似。漳浦海區(qū)的福建牡蠣成貝雖然有部分檢測出OsHV-1病毒，但電泳條帶極其微弱，電泳條帶亮度遠低于A、B、C 三個育苗場的陽性樣本亮度，成貝中OsHV-1含量均很低。Barbosa V等[15]和Lopez M等[16]對長牡蠣和福建牡蠣的流行病學(xué)調(diào)查也顯示，成貝往往無臨床癥狀，其病毒含量大多在103copies/mg以下，因此漳浦海區(qū)的牡蠣雖然感染了OsHV-1，但其不會對牡蠣的生長造成影響。本研究檢測的牡蠣樣本取自漳浦、詔安、泉州、莆田、平潭5個地區(qū)，結(jié)果顯示牡蠣陽性檢出點均位于漳浦地區(qū)，這可能與漳浦地區(qū)為福建主要的牡蠣苗種生產(chǎn)地有關(guān)，牡蠣苗種生產(chǎn)企業(yè)較多，一旦出現(xiàn)OsHV-1感染，則容易發(fā)生交叉感染；其次陽性感染也可能與親本攜帶有關(guān)，三家陽性檢出育苗場的親本來自不同地區(qū)。

4 牡蠣皰疹病毒的防控與建議

由于貝類多在開放海域養(yǎng)殖，這給貝類相關(guān)疾病的防控帶來了難度。OsHV-1的防控主要有以下幾點建議：1)開展育苗前的消毒工作?？赏ㄟ^海水加熱(50 ℃、5 min)、紫外線照射(10 min)、次氯酸鈉(0.05 g/L、15 min)、福爾馬林(40 g/L、30 min)等物理和化學(xué)方式殺滅海水中的OsHV-1。2)對育苗海水進行處理。海水中的浮游生物、組織碎片也能成為病毒的攜帶者，5 μm濾孔過濾海水可有效防止貝類感染[7]。Hick P等[17]研究發(fā)現(xiàn)，OsHV-1可以在海水中存活2 d，因此抽取的海區(qū)海水在育苗場靜置2 d可有效降低病毒的存活率。3)開展親貝的檢測。隨機選取待使用的親貝或者對親本熱應(yīng)激(21 ℃、2～3周)后[18]，進行PCR檢測，選取不攜帶病毒的親本可有效降低苗種感染率。4)干露可降低已感染的海區(qū)養(yǎng)殖貝類的死亡率。尤其能提高成貝的成活率，但對幼貝效果不明顯[7]。5)選育抗OsHV-1的新品系。De Lorgeril J等[19]對15個長牡蠣家系開展人工感染實驗，結(jié)果顯示家系之間的感染率(0%～97.4%)差別較大，這為病毒的選育提供了可能。Bai C M等[20]也在自然海區(qū)中發(fā)現(xiàn)了對OsHV-1不敏感的長牡蠣。因此建議牡蠣育苗企業(yè)在購買親本或苗種時，選購健康的親本進行育苗，育苗前開展相應(yīng)的OsHV-1檢測及處理；牡蠣養(yǎng)殖戶選購已開展OsHV-1檢疫的生產(chǎn)廠家苗種，為牡蠣育苗及養(yǎng)殖做好保障工作。