陳婷婷, 李文靜, 楊桂霞, 周賢軒, 石春紅

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

硫酸軟骨素(chondroitin sulfate,CS)是一類廣泛存在于動物結(jié)締組織中的酸性糖胺聚糖類大分子多糖,在生物體內(nèi)多以蛋白聚糖側(cè)鏈形式存在[1-2]。硫酸軟骨素及軟骨素的碳鏈骨架由葡糖醛酸(GlcA)和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)以β-1,3和β-1,4糖苷鍵(4-GlcA-β-1,3-GalNAc-β-1)交替連接而成的重復(fù)二糖單元組成,一般有二糖單元20～100個[3-4]。軟骨素經(jīng)硫酸化后得到硫酸軟骨素,根據(jù)其硫酸化位點的不同,可以將硫酸軟骨素分為以下不同類型[5]:硫酸化發(fā)生在GalNAc的C-4位、GalNAc的C-6位羥基上的分別是硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素C;硫酸軟骨素E的GalNAc的C-4位和C-6位羥基均發(fā)生硫酸化;硫酸軟骨素B一般稱為硫酸皮膚素(DS),其結(jié)構(gòu)是硫酸軟骨素A中GlcA被艾杜糖醛酸取代[6]。硫酸軟骨素因其結(jié)構(gòu)多樣性而具有各種不同功能[7],硫酸軟骨素及其低分子量衍生物在治療風(fēng)濕病、骨質(zhì)疏松癥、關(guān)節(jié)炎、腰間盤突出等方面具有重要作用[8-10]。

硫酸軟骨素裂解酶(ChSase)可以將硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸等糖胺聚糖裂解為不飽和二糖及寡糖[11],主要存在于微生物中。根據(jù)其作用底物的不同可以分為ChSase ABC、ChSase AC、ChSase B、ChSase C等類型。其中:ChSase ABC可以降解硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素B、硫酸軟骨素C及透明質(zhì)酸;ChSase AC可將軟骨素、硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素C及透明質(zhì)酸降解為不飽和二糖和寡糖[12];ChSase B可以降解硫酸軟骨素B和透明質(zhì)酸;ChSase C嚴(yán)格作用于硫酸軟骨素C和透明質(zhì)酸。本研究使用的裂解酶AsChnAC酶解機(jī)制同ChSase AC,是一種硫酸軟骨素AC外切酶[13]。

本研究提供了一種復(fù)雜培養(yǎng)液中軟骨素類多糖質(zhì)量濃度的定量檢測方法,通過多糖酶解與蒽酮-硫酸法相結(jié)合,測定軟骨素類多糖質(zhì)量[14],測定過程如圖1所示。

首先通過超濾去除培養(yǎng)基中小分子雜質(zhì),再用相應(yīng)的裂解酶將多糖分解為不飽和二糖或寡糖,這些低分子量糖可經(jīng)超濾截留住大分子雜質(zhì),最后結(jié)合蒽酮-硫酸法測定糖質(zhì)量濃度。

圖1 化學(xué)酶法定量示意圖

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

大腸桿菌 BL21、大腸桿菌K4ΔkfoE、大腸桿菌EcNΔkfiA∶∶Kan、大腸桿菌EcN、大腸桿菌BL21/pET28a(+)-AsChnAC,均由本實驗室保存。

1.1.2 材料與試劑

硫酸軟骨素C、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、氯化鈉、咪唑、苯甲基磺酰氟(PMSF)、蒽酮、濃硫酸、重水(D2O)、Bradford試劑、40%丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉(SDS)、過硫酸銨(APS)、TEMED、超濾管、透析袋等。

1.2 實驗方法

1.2.1 誘導(dǎo)純化硫酸軟骨素裂解酶AsChnAC

將攜帶表達(dá)硫酸軟骨素裂解酶AsChnAC質(zhì)粒的大腸桿菌BL21/pET28a(+)-AsChnAC單克隆過夜培養(yǎng)并轉(zhuǎn)移到2 L新鮮LB培養(yǎng)液中,37 ℃振蕩培養(yǎng)至A600>0.6。加400 μL 1 mol/L IPTG于22 ℃過夜誘導(dǎo)。誘導(dǎo)后的菌液在轉(zhuǎn)速6 000 r/min下4 ℃離心20 min,收集菌體。用BufferA(25 mmol/L Tris,500 mmol/L NaCl,30 mmol/L咪唑)重懸菌體。向上述溶液加100 mmol/L PMSF后超聲破碎,破碎的細(xì)胞液于12 000 r/min、4 ℃離心20 min,收集上清液。上清液以1 mL/min的流速通過Ni-NTA柱,用BufferA(25 mmol/L Tris,500 mmol/L NaCl,30 mmol/L咪唑)洗雜,BufferB(25 mmol/L Tris,500 mmol/L NaCl,250 mmol/L咪唑)洗脫。在25 mmol/L Tris、500 mmol/L NaCl溶液中透析,收集蛋白組分。純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,并使用Bradford法測其蛋白質(zhì)量濃度[15]。

1.2.2 蒽酮-硫酸法

樣品與蒽酮反應(yīng)試劑(含0.1%蒽酮和80%濃硫酸)以體積比1∶3混勻,每種樣品設(shè)置3個平行組,將混合液于100 ℃水浴15 min、冰浴15 min,測定620 nm處吸光度值。

1.2.3 硫酸軟骨素C標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取硫酸軟骨素C溶于ddH2O,配制成20 mg/mL的母液,將硫酸軟骨素C稀釋至0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、2.0 mg/mL,每個質(zhì)量濃度梯度設(shè)置3個平行組,蒽酮-硫酸法測620 nm處吸光度值,OriginPro繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算線性回歸方程。

1.2.4 AsChnAC裂解硫酸軟骨素C定量分析

將30 mg/ml 硫酸軟骨素C(溶于20 mmol/L Tris-HCl,pH值為7.0)與0.2 mg/mL AsChnAC等體積混合,在37 ℃下分別水浴反應(yīng)10、30、50、90、720、960 min,100 ℃煮沸3 min,13 000g離心2 min,收集上清液。取400 μL上清液加入0.5 mL 10 kDa超濾管,14 000g離心30 min,收集過濾液。倒置超濾管,1 000g離心2 min,收集濃縮液。蒽酮-硫酸法測硫酸軟骨素C質(zhì)量。

1.2.5 核磁共振氫譜分析

稱取20 mg 硫酸軟骨素C溶于500 μL D2O,將待測樣品裝入0.5 mm核磁管進(jìn)行核磁共振氫譜(proton nuclear magnetic resonance,1H NMR)檢測。分別稱取20 mg硫酸軟骨素C溶于1mL LB培養(yǎng)液和1 mL BL21菌液上清,干燥完全后,溶于500 μL D2O,將待測樣品裝入0.5 mm核磁管進(jìn)行1H NMR檢測。

1.2.6 質(zhì)譜分析

將20 mg/mL 硫酸軟骨素C與0.2 mg/mL AsChnAC等體積混合,37 ℃水浴反應(yīng)16 h。反應(yīng)液于100 ℃煮沸3 min,13 000g離心2 min,收集上清。上清用透析膜(MWCO 1 kDa)在去離子水中透析4 h。將上述樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.2.7 硫酸軟骨素C和軟骨素質(zhì)量濃度測定

分別挑取大腸桿菌K4ΔkfoE、大腸桿菌EcN、大腸桿菌EcNΔkfiA∶∶Kan單克隆于3 mL M9C中,37 ℃振蕩過夜。分別將上述菌液按1%的量轉(zhuǎn)接至50 mL M9C中,37 ℃振蕩培養(yǎng)約20 h。菌液于12 000 r/min離心10 min收集上清。稱取硫酸軟骨素C溶于EcNΔkfiA∶∶Kan菌液上清中配制成1 mg/mL的溶液。分別取3 mL上述硫酸軟骨素C溶液、K4ΔkfoE菌液上清、EcN菌液上清、EcNΔkfiA∶∶Kan菌液上清與300 μL 200 mmol/L Tris-HCl(pH值為7.0)溶液混勻?；靹蚝蠓謩e用0.22 μm濾器過濾,以去除殘余菌體。取上述過濾后的溶液加入10 kDa 0.5 mL超濾管,一次400 μL,14 000g離心30 min后棄濾液,重復(fù)此過程直至3 mL溶液加完。加400 μL 20 mmol/L Tris-HCl,14 000g離心20 min,重復(fù)2次,去除培養(yǎng)液中小分子雜質(zhì)。向超濾管加150 μL 20 mmol/L Tris-HCl(pH值為7.0),沖洗膜兩側(cè),倒置超濾管,1 000g離心2 min,再加20 mmol/L Tris-HCl(pH值為7.0)定容至200 μL。加300 μL 2 mg/mL AsChnAC于定容后的溶液中,37 ℃水浴反應(yīng)16 h后,100 ℃煮3 min,13 000g離心2 min,收集上清。將上清加入10 kDa 0.5 mL超濾管,14 000g離心30 min,得到過濾液。過濾液干燥完全,加100 μL ddH2O重懸,重懸液用蒽酮-硫酸法測其多糖質(zhì)量濃度。

1.2.8 樣品損失率及軟骨素質(zhì)量濃度的計算

以硫酸軟骨素C溶液計算樣品損失率,公式如下:

軟骨素質(zhì)量濃度計算公式為:

2 結(jié)果與分析

2.1 1H NMR結(jié)果分析

將硫酸軟骨素C進(jìn)行1H NMR檢測,結(jié)果如圖2所示。

圖2 硫酸軟骨素C的1H NMR分析

從圖2可以看出,圖譜無雜峰,且CS—C共有7個特征峰,其中化學(xué)位移在1.99×10-6處是硫酸軟骨素C中N-乙酰基甲基的特征峰,通?？梢杂脕泶致远吭撎琴|(zhì)量。LB培養(yǎng)液中硫酸軟骨素C的核磁共振圖譜和大腸桿菌 BL21培養(yǎng)液中硫酸軟骨素C的核磁共振圖譜與硫酸軟骨素C標(biāo)準(zhǔn)品的圖譜對比,發(fā)現(xiàn)復(fù)雜培養(yǎng)基中的硫酸軟骨素C的核磁共振圖譜有較多雜峰,特別是N-乙?；谆奶卣鞣逍盘柺艿絿?yán)重干擾,說明其中復(fù)雜成分干擾了NMR對硫酸軟骨素C的定量分析。因此,1H NMR法不能用于測定復(fù)雜培養(yǎng)基LB培養(yǎng)液中的硫酸軟骨素C質(zhì)量濃度。

2.2 硫酸軟骨素裂解酶的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

將表達(dá)得到的蛋白收集純化,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,AsChnAC酶蛋白SDS-PAGE分析結(jié)果如圖3所示,圖3中:泳道1為Protein Marker;泳道2為AsChnAC蛋白。

由圖3可知,純化后得到較單一的目的蛋白,純化后收集的AsChnAC蛋白用Bradford法測得,其質(zhì)量濃度為2 mg/mL。

圖3 AsChnAC酶蛋白SDS-PAGE電泳圖

2.3 硫酸軟骨素C標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

濃硫酸將多糖水解為單糖,與蒽酮反應(yīng)生成深綠色復(fù)合物,在620 nm處有最大吸光度值,吸光度值與糖質(zhì)量存在明顯線性關(guān)系。以硫酸軟骨素C質(zhì)量為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。硫酸軟骨素C的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。

圖4 硫酸軟骨素C標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖4可知,在所測質(zhì)量濃度范圍內(nèi),硫酸軟骨素C質(zhì)量與吸光度值呈正相關(guān)。

2.4 硫酸軟骨素C裂解的定量分析

硫酸軟骨素C在不同消化時間點超濾收集的寡糖質(zhì)量如圖5a所示。由圖5a可知,硫酸軟骨素C與AsChnAC裂解酶等體積混合,于37 ℃水浴反應(yīng)不同時間,酶解液上清經(jīng)超濾得到的過濾液用蒽酮-硫酸法定量。硫酸軟骨素C在被AsChnAC分解90 min后寡糖質(zhì)量不再明顯增加。

倒置超濾管得到未被分解的硫酸軟骨素C,未分解的硫酸軟骨素C質(zhì)量占總硫酸軟骨素C質(zhì)量的比例與時間呈負(fù)相關(guān),如圖5b所示。由圖5b可知,隨時間的增加,未分解的硫酸軟骨素C質(zhì)量占總硫酸軟骨素C質(zhì)量的比例逐漸下降,表明硫酸軟骨素C被AsChnAC裂解為寡糖。在酶解960 min后,酶解率可達(dá)96.5%。

圖5 不同消化時間硫酸軟骨素C定量分析

2.5 硫酸軟骨素C和軟骨素質(zhì)量濃度分析

硫酸軟骨素C經(jīng)AsChnAC酶解后的質(zhì)譜分析如圖6所示。由圖6可知,所得實測二糖的m/z值為457.7、480.1,符合預(yù)期二糖的m/z值(458.07和480.04)。質(zhì)譜分析結(jié)果顯示,高分子硫酸軟骨素被酶切成了二糖,其他寡糖成分極少,在質(zhì)譜分析中沒有明顯信號。

通過AsChnAC酶解法和蒽酮-硫酸法,測定了復(fù)雜培養(yǎng)基中的硫酸軟骨素C質(zhì)量濃度以及EcN、K4ΔkfoE菌株上清液中未純化的軟骨素質(zhì)量濃度。大腸桿菌EcNΔkfiA∶∶Kan為敲除了kfiA基因的EcN菌株,為本實驗室保存。由于kfiA基因的敲除,該菌株無法合成莢膜多糖,因此可以作為陰性對照。以硫酸軟骨素C標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為外標(biāo),反映了待測樣品的損失率,根據(jù)損失率算出軟骨素類多糖的質(zhì)量濃度如圖7所示。

圖6 硫酸軟骨素C酶解后質(zhì)譜分析

圖7 培養(yǎng)液中軟骨素類多糖的質(zhì)量濃度

將硫酸軟骨素C溶液的A620代入損失率計算公式,得到損失率為23.1%。將EcN、K4ΔkfoE上清的A620代入軟骨素質(zhì)量濃度計算公式,得到EcN上清中軟骨素類多糖質(zhì)量濃度為10.1 mg/L,K4ΔkfoE上清中軟骨素的質(zhì)量濃度為31.5 mg/L。

3 討 論

硫酸軟骨素的傳統(tǒng)制備方法主要是從動物的軟骨組織中提取[16],存在結(jié)構(gòu)不均勻、動物源致病菌等問題[17]。軟骨素與大腸桿菌K4的莢膜多糖結(jié)構(gòu)類似[18]。近年來,通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)軟骨素,并進(jìn)一步制備出硫酸軟骨素,逐漸成為研究熱點[19]。該方案具有潛在的顯著降低成本、低污染、工藝簡單、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點。大腸桿菌K4是軟骨素類似物的主要生產(chǎn)菌株,其產(chǎn)物是果糖軟骨素。本研究使用敲除了kfoE基因的K4ΔkfoE菌株,其產(chǎn)物去除了該菌莢膜多糖中的果糖基團(tuán),是制備硫酸軟骨素的重要原材料[20]。但是在測定該菌產(chǎn)生的軟骨素質(zhì)量時,微生物培養(yǎng)液中的復(fù)雜成分(如培養(yǎng)基單糖成分、代謝產(chǎn)物、肽聚糖成份等)會干擾軟骨素多糖的定量分析。因此,有必要開發(fā)一種方法快速定量檢測發(fā)酵液中硫酸軟骨素類多糖質(zhì)量濃度。

硫酸軟骨素的分子量范圍為20～80 kDa,AsChnAC酶蛋白屬于硫酸軟骨素裂解酶AC,在葡糖醛酸C4位斷裂β-1,4糖苷鍵,生成不飽和雙鍵[13,21]。本文使用專一性的酶解方法去除雜質(zhì)的干擾,結(jié)合蒽酮-硫酸法可以簡便準(zhǔn)確地測定復(fù)雜培養(yǎng)液中的多糖質(zhì)量濃度。使用截留分子量為10 kDa的超濾管先將培養(yǎng)液中的小分子干擾物去除,再用裂解酶AsChnAC將硫酸軟骨素類多糖降解為不飽和寡糖。通過超濾得到寡糖過濾液,進(jìn)一步排除了大分子雜質(zhì)的干擾,最后使用蒽酮-硫酸法可以方便地測出軟骨素類多糖質(zhì)量濃度。

該方法提供了一種發(fā)酵液中軟骨素類多糖質(zhì)量濃度的定量檢測方法。該方法偶聯(lián)了酶專一性分解軟骨素與化學(xué)分析方法,只需通過2個步驟,即可將復(fù)雜成分中造成定量干擾的小分子、大分子雜質(zhì)去除,可以快速地測定復(fù)雜培養(yǎng)液中的軟骨素類多糖質(zhì)量濃度。該方法具有普適性,利用不同專一性的多糖裂解酶,該方法也可以擴(kuò)展使用于其他多糖的定量分析。