聶 梅，黎 鵬，湯靜潔，張平軍，黃冬婷,

（1.廣東省科學(xué)院生物與醫(yī)學(xué)工程研究所，廣東廣州 510316；2.廣東省綠色制糖工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510316）

皮膚是人體的最外層器官，很容易暴露在紫外線下造成刺激。根據(jù)波長(zhǎng)的不同，紫外線可以分為UVA（320～400 nm）、UVB（280～320 nm）、UVC（100～280 nm）。大氣中的臭氧層對(duì)UVC 有較強(qiáng)的吸收能力，到達(dá)地球表面的紫外線主要是UVA 和UVB[1]。UVB 的波長(zhǎng)處于DNA 和蛋白質(zhì)的吸收峰附近，其輻射是皮膚光化學(xué)反應(yīng)中最活躍部分，誘發(fā)的炎癥在皮膚光老化中起核心作用[2-3]。過(guò)量的UVB 輻射導(dǎo)致皮膚組織中的ROS 被大量激活，超過(guò)了機(jī)體的清除能力，導(dǎo)致細(xì)胞膜受損，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生過(guò)量MDA，致使細(xì)胞凋亡從而引起光老化[4-5]。因此，開(kāi)發(fā)含有天然成分或配方的藥物、食物抑制UVB 對(duì)皮膚的損傷實(shí)現(xiàn)抗衰老受到越來(lái)越多人的關(guān)注。

人參作為一種被廣泛使用了幾千年的著名中藥材，其有效成分包括皂苷、多糖、揮發(fā)油和氨基酸等[6]。主要有效成分人參皂苷的研究比較完整，其生理功能已經(jīng)有了大量的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和證明[7-9]。然而，人參成分中最豐富的多糖（約占總含量的40%）還沒(méi)有得到充分的研究，此前對(duì)人參多糖的研究主要集中在其具有抗氧化作用[10]，通過(guò)降低組織過(guò)氧化程度，保護(hù)組織器官免受氧化損傷[11-13]。目前還缺乏人參多糖在皮膚抗衰老方面的研究?？顾ダ匣钚匝芯恐?，細(xì)胞模型和動(dòng)物模型都已有報(bào)道。董坤等[14]建立了UVB 致HFF-1 損傷模型，考察草莓葉水提物對(duì)UVB 致皮膚損傷的保護(hù)作用，結(jié)果表明草莓葉水提物有助于緩解氧化應(yīng)激造成的細(xì)胞損傷，達(dá)到延緩衰老的功效。王慧云[15]通過(guò)建立過(guò)氧化氫刺激人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)的衰老細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn)，黨參多糖干預(yù)后細(xì)胞血清中內(nèi)皮素-1（Endothelin-1，ET-1）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase，iNOS）、ROS 含量降低，內(nèi)皮型一氧化氮合酶（Endothelial nitric oxide synthase，eNOS）含量升高，DNMT1、EZH2、Bmi-1 蛋白與基因表達(dá)量、細(xì)胞DNA 甲基化水平也得到了調(diào)節(jié)，表明黨參多糖可以延緩內(nèi)皮細(xì)胞衰老。趙苑伶等[16]分離純化得到鐵皮石斛多糖，以秀麗隱桿線蟲(chóng)為模式生物，研究了鐵石斛多糖的抗衰老作用，結(jié)果表明鐵皮石斛多糖可以顯著延長(zhǎng)秀麗隱桿線蟲(chóng)的壽命，對(duì)高溫?fù)p傷和氧化應(yīng)激損傷有一定的抵御作用。朱秋軼等[17]利用秀麗隱桿線蟲(chóng)模型研究羊乳酪蛋白酶解物的抗衰老作用，實(shí)驗(yàn)表明羊乳酪蛋白酶解物能延長(zhǎng)線蟲(chóng)壽命，降低線蟲(chóng)體內(nèi)脂褐素積累，提高線蟲(chóng)在應(yīng)激條件下的抵抗能力和體內(nèi)抗氧化酶活力，具有較好的抗衰老活性。

由于對(duì)分離純化后的人參多糖在皮膚抗衰老方面的研究較為少見(jiàn)，因此，本文制備了人參精多糖，對(duì)其進(jìn)行均一性測(cè)定、波譜表征及延緩皮膚衰老功效評(píng)價(jià)，為人參多糖的分離純化及在延緩皮膚衰老方面的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人參的干燥根及根莖 河北省安國(guó)市藥材市場(chǎng)；α-淀粉酶（酶活力4000 U/g）、木瓜蛋白酶（酶活力3000 U/g） 分析純，麥克林試劑生化科技有限公司；無(wú)水乙醇 市售，分析純；窄分部普魯蘭多糖標(biāo)準(zhǔn)品 日本Shodex 公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒、人基質(zhì)活性氧（ROS）ELISA 試劑盒、人基質(zhì)丙二醛（MDA）ELISA 試劑盒、人基質(zhì)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）試劑盒、人基質(zhì)超氧化物歧化酶（SOD）ELISA 試劑盒 深圳子科生物科技有限公司；人基質(zhì)金屬蛋白酶1（MMP-1）ELISA 試劑盒、人基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）ELISA 試劑盒 杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司。

TDZ4-WS 離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DNM-9602 酶標(biāo)分析儀 北京普朗新技術(shù)有限公司；BHC-1300IIB2 生物安全柜 蘇州金凈凈化設(shè)備公司；Thermo Forma 3111 CO2恒溫培養(yǎng)箱美國(guó)Thermo 公司；XDS-500C 顯微鏡 上海蔡康光學(xué)儀器有限公司；UV-1750 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、GPC-20A 凝膠滲透色譜儀、RID-20A 示差折光檢測(cè)器 日本島津公司；iS10 紅外（FT-IR）光譜儀 美國(guó)尼高力公司；AVANCE III 400M 核磁共振波譜儀德國(guó)BRUKER；TSKgel GMPWXL 水相凝膠色譜柱東曹（上海）生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人參粗多糖（GPS）的制備 參考文獻(xiàn)[18]制備人參粗多糖。稱取干燥過(guò)篩后的人參樣品，置于玻璃燒杯內(nèi)，按料液比1:30（g/mL）加入去離子水，在70 ℃溫度、60 Hz 超聲功率下提取30 min。待溶液冷卻后離心（6000 r/min），取上清液。在上清液中加入約4 倍體積的無(wú)水乙醇溶液，放置在-20 ℃環(huán)境中醇沉24 h。過(guò)濾收集沉淀，將其放入真空干燥箱（70 ℃）中干燥至恒重，即得人參粗多糖（GPS），備用。

1.2.2 GPS 純化 參考文獻(xiàn)[19]對(duì)GPS 進(jìn)行純化。利用α-淀粉酶去除上述提取的GPS 的淀粉。精密稱取10.0 g GPS，用少量去離子水溶解后轉(zhuǎn)移至1000 mL 容量瓶中，用去離子水定容，得到10 mg/mL的GPS 溶液。向配制好的GPS 溶液中加入800 Uα-淀粉酶，50～60 ℃酶解30 min，然后轉(zhuǎn)移至沸水浴中加熱5 min 終止酶解反應(yīng)。溶液降至室溫后離心（4000 r/min，10 min），收集上清液。

利用木瓜蛋白酶去除上述提取的GPS 中的蛋白質(zhì)。將200 U 木瓜蛋白酶加入上述溶液中，30～40 ℃酶解2 h，然后轉(zhuǎn)移至沸水浴中加熱5 min 終止酶解反應(yīng)。溶液降至室溫后離心（4000 r/min，10 min），收集上清液。

將上清液加熱至70 ℃以蒸發(fā)除去過(guò)多的水分，濃縮至50 mL，向濃縮液加入200 mL 無(wú)水乙醇，搖勻，-20 ℃冰箱凍存靜置24 h，過(guò)濾得到白色固體，放置真空干燥箱中烘干（60 ℃）至恒重，得到4.8 g 酶解后的GPS。

取酶解后的GPS 4.0 g，配制成10 mg/mL 的溶液。溶液用DEAE-52 纖維素填料進(jìn)行柱層析洗脫，以去離子水為洗脫液，使用試管收集，每管收集10 mL。采用苯酚-硫酸法對(duì)每管溶液在490 nm 處吸光度進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)出現(xiàn)吸收峰的溶液進(jìn)行收集，將收集的溶液冷凍干燥（-40 ℃），得到2.5 g 人參精多糖（GPS-1）。

1.2.3 GPS-1 的均一性鑒定及相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定采用高效凝膠滲透色譜法測(cè)定GPS-1 的相對(duì)分子質(zhì)量和純度。采用TSKgel GMPWXL 水相凝膠色譜柱，以0.1 mol/L NaNO3+0.06% NaN3（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）水溶液為流動(dòng)相，流速0.6 mL/min，檢測(cè)溫度35 ℃，進(jìn)樣體積20 μL。采用示差折光檢測(cè)器，窄分部普魯蘭多糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)照，對(duì)GPS-1 的分子量分布進(jìn)行測(cè)試。

1.2.4 GPS-1 的初級(jí)結(jié)構(gòu)表征 采用溴化鉀壓片法對(duì)GPS-1 樣品進(jìn)行FT-IR 測(cè)試，波數(shù)范圍：400～4000 cm-1，光譜儀分辨率4 cm-1，信躁比50000:1，掃描64 次。采用核磁共振氫譜（1H NMR）和核磁共振碳譜（13C NMR）對(duì)GPS-1 的初級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征：稱取GPS-1 樣品5 mg，放入核磁管，加入1 mL 氘代試劑（重水）充分溶解樣品，檢測(cè)其1H NMR 和13C NMR譜圖。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞活力測(cè)試 采用含10%胎牛血清和1%雙抗（青霉素（10000 U/mL）與鏈霉素（10 mg/L）混合液）的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)HFF-1 細(xì)胞，將其置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中。顯微鏡下觀察HFF-1 細(xì)胞為貼壁細(xì)胞。

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化，顯微鏡下計(jì)數(shù)后制成3×104個(gè)細(xì)胞/L 的細(xì)胞懸液。分別取100 μL 至96 孔培養(yǎng)板，每種細(xì)胞每塊板設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，3×103個(gè)細(xì)胞/孔，然后添加100 μL 不同質(zhì)量濃度的GPS-1 溶液，同時(shí)以100 μL 培養(yǎng)液做空白對(duì)照，將培養(yǎng)板放置37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。分別處理細(xì)胞在0、48 h 后，按1:10 體積比混合CCK-8 和無(wú)血清必需基本培養(yǎng)基，每孔100 μL加入待測(cè)孔中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)下培養(yǎng)板每孔吸光度，記錄數(shù)值。

1.2.6 急性光損傷模型的建立及分組 參照文獻(xiàn)[14]建立急性光損傷細(xì)胞模型。選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HFF-1，接種密度3×104個(gè)/孔，建立實(shí)驗(yàn)分組，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔?？瞻讓?duì)照組：不照射UVB，不加GPS-1 溶液，細(xì)胞正常培養(yǎng)72 h；UVB 照射組：細(xì)胞正常培養(yǎng)48 h 后，在功率密度68 μW/cm2、照射距離10 cm 條件下，UVB 輻照100 s 后細(xì)胞培養(yǎng)24 h；GPS-1 高中低劑量組（200、500 和800 μg/mL）：細(xì)胞正常培養(yǎng)24 h 后，添加GPS-1 溶液和培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)24 h，然后在功率密度68 μW/cm2，照射距離10 cm條件下，UVB 輻照100 s 后，再進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)24 h。

1.2.7 GPS-1 對(duì)SOD、MDA、MMP-1、MMP-9、ROS、GSH-Px 的影響 培養(yǎng)后，收集細(xì)胞上清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)SOD、MDA、MMP-1、MMP-9、ROS、GSH-Px 含量進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS statistics 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行One-way ANOVA 檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)結(jié)果以±s 表示，以*P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，**P＜0.01 為差異極其顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 GPS-1 的純度及相對(duì)分子質(zhì)量分析

純化后的人參多糖GPS-1 的HPGPC 結(jié)果顯示，分子量分布圖（圖1）有兩個(gè)峰，其中峰1 峰面積占95.13%，此峰數(shù)均分子量（Mn）為1.079 kDa，重均分子量（Mw）為2.104 kDa，分布寬度指數(shù)PD（Mw/Mn）為1.95。峰2 峰面積占比4.87%，數(shù)均分子量（Mn）為0.055 kDa，重均分子量（Mw）為0.072 kDa，分布寬度指數(shù)PD（Mw/Mn）為1.29。結(jié)果表明GPS-1分子量分布相對(duì)均一，多糖純度為95.13%，相對(duì)分子質(zhì)量較低。

圖1 GPS-1 的分子量分布凝膠色譜圖Fig.1 GPC chromatogram of GPS-1 for molecular weight determination

2.2 GPS-1 的初級(jí)結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 GPS-1 的紅外光譜表征 圖2 為GPS-1 的FTIR 譜圖，該譜圖表現(xiàn)出多糖的特征吸收峰，分別在3385、2928、1632、1594、1413、1364、1153、1079、1024、931 和850 cm-1處出現(xiàn)特征吸收峰。在3385 cm-1附近出現(xiàn)相對(duì)較寬的強(qiáng)吸收峰，是由分子間或分子內(nèi)的O-H 伸縮振動(dòng)引起的，表明樣品含多糖羥基。2928 cm-1附近的肩峰，是由C-H 或O-H 的伸縮振動(dòng)引起的特征吸收峰[20]。1632 cm-1是C=O 非對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，是未酯化的糖醛酸羧基特征峰[21]；1413 cm-1處為C-H 的變形吸收峰。在1200～1000 cm-1區(qū)間的多糖特征吸收峰是由C-O-C 和C-O-H 的伸縮振動(dòng)引起的[20]。在1024、1079 和1153 cm-1處分別有三個(gè)吡喃糖特征吸收峰，表明該樣品多糖結(jié)構(gòu)為吡喃糖環(huán)狀結(jié)構(gòu)。α-型或β-型吡喃葡萄糖通常在960～730 cm-1內(nèi)有特征吸收峰，其中，在844±8 cm-1處有吸收峰為α-型異構(gòu)體，在891±7 cm-1處有吸收峰為β-型異構(gòu)體[22]。該樣品的紅外譜圖在891 cm-1處無(wú)吸收峰，在850 cm-1處出現(xiàn)明顯的吸收峰，表明存在α-D-吡喃葡萄糖[23]。紅外光譜分析結(jié)果表明GPS-1 存在α-D-吡喃葡萄糖構(gòu)型。

圖2 GPS-1 的紅外光譜圖Fig.2 FTIR spectra of GPS-1

2.2.2 GPS-1 的核磁表征 糖苷異頭氫的1H NMR信號(hào)一般處于δ4.2～5.8 ppm 范圍，其中，α-型糖苷的異頭質(zhì)子處于δ4.8～5.8 ppm 范圍內(nèi)，β-型糖苷的異頭質(zhì)子處于δ4.2～4.8 ppm 范圍[24]。圖3 顯示，δ4.7 ppm為重水溶劑峰，δ3.2～4.0 ppm 為人參多糖糖環(huán)上的質(zhì)子信號(hào)。人參多糖糖苷鍵的質(zhì)子化學(xué)位移在δ4.5～5.4 ppm 范圍內(nèi)，表明含有α-型和β-型兩類糖苷鍵。在糖苷鍵質(zhì)子共振區(qū)δ4.2～5.8 ppm 范圍內(nèi)出現(xiàn)7 個(gè)信號(hào)峰，表明樣品由7 種單糖組成。根據(jù)文獻(xiàn)[25]報(bào)道推斷氫譜上7 個(gè)信號(hào)δ5.31 ppm、δ5.27 ppm、δ5.14 ppm、δ5.13 ppm、δ4.88 ppm、δ4.57 ppm、δ4.56 ppm 分別歸屬為α-D-葡萄糖、α-D-半乳糖醛酸、α-D-阿拉伯糖、α-D-巖藻糖、α-D-核糖、β-D-甘露糖、β-D-阿拉伯糖糖苷鍵質(zhì)子信號(hào)。

圖3 GPS-1 在400 MHz 條件下的1H NMR 譜圖Fig.3 1H NMR spectrum of GSP-1 recorded at 400 MHz

13C NMR 譜圖中，糖苷碳的信號(hào)共振區(qū)通常在δ95～110 ppm 范圍內(nèi)。根據(jù)圖4 可知，δ100.33 ppm、δ99.94 ppm、δ99.69 ppm、δ99.58 ppm、δ98.57 ppm、δ98.25 ppm、δ95.75 ppm 分別對(duì)應(yīng)七種單糖的糖苷碳，表明GPS-1 含有七種單糖成分，與其1H NMR 結(jié)果一致。糖環(huán)上化學(xué)位移一般在δ50～85 ppm 范圍內(nèi)，其中，未發(fā)生取代的C6 在δ60～63 ppm 附近，連接到另一個(gè)糖殘基的C6 特征峰出現(xiàn)在δ65～70 ppm附近；糖環(huán)上C2、C3、C4 位置未發(fā)生取代時(shí)特征信號(hào)峰在δ70～77 ppm 范圍內(nèi)，糖環(huán)上C2、C3、C4 位置發(fā)生取代時(shí)特征信號(hào)峰在δ77 ppm 以上[26]。圖4中GPS-1 信號(hào)在δ68～69.5 ppm 范圍內(nèi)有特征峰，說(shuō)明C6 位發(fā)生取代；在δ70～77 ppm 范圍內(nèi)出現(xiàn)明顯的特征峰，可以判斷GPS-1 在C2、C3、C4 位置未發(fā)生取代。

圖4 GPS-1 在400 MHz 條件下的13C NMR 譜圖Fig.4 13C NMR spectrum of GSP-1 recorded at 400 MHz

2.3 GPS-1 對(duì)正常生長(zhǎng)HFF-1 細(xì)胞增殖的影響

本實(shí)驗(yàn)使用可快速高靈敏度檢測(cè)細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的CCK-8 試劑盒，考察GPS-1 對(duì)正常生長(zhǎng)HFF-1 細(xì)胞增殖情況的影響。細(xì)胞存活率是可直接表達(dá)各組細(xì)胞狀態(tài)的指標(biāo)，反映細(xì)胞增殖情況，細(xì)胞存活率越高說(shuō)明細(xì)胞狀態(tài)越好[27]。由圖5 可知，與對(duì)照組相比，當(dāng)GPS-1 的質(zhì)量濃度小于等于800 μg/mL時(shí)，對(duì)HFF-1 細(xì)胞存活率無(wú)顯著影響（P＞0.05）。當(dāng)GPS-1 的質(zhì)量濃度大于800 μg/mL 時(shí)，HFF-1 細(xì)胞存活率降低，GPS-1 質(zhì)量濃度增至2000 μg/mL 時(shí)，細(xì)胞活率降至87.1%（P＜0.01）。最終選取200、500 和800 μg/mL 三個(gè)質(zhì)量濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖5 GPS-1 對(duì)正常生長(zhǎng)HFF-1 細(xì)胞活力影響Fig.5 Effect of GPS-1 on the viability of normal growing HFF-1 cells

2.4 GPS-1 對(duì)UVB 致HFF-1 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

由圖6 可知，經(jīng)UVB 輻射后，與對(duì)照組相比，UVB 照射組細(xì)胞存活率下降了20.1%，細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.01），說(shuō)明UVB 致HFF-1 細(xì)胞損傷模型建立成功。而經(jīng)GPS-1 保護(hù)干預(yù)后，與UVB照射組相比，GPS-1 質(zhì)量濃度分別為200、500 和800 μg/mL 時(shí)，細(xì)胞存活率分別增加了1.9%（P＜0.05）、9.5%（P＜0.01）和18.8%（P＜0.01），均具有顯著性差異，說(shuō)明GPS-1 對(duì)UVB 損傷HFF-1 細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用，在GPS-1 質(zhì)量濃度為200～800 μg/mL范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度增高，對(duì)損傷細(xì)胞的保護(hù)作用隨之增強(qiáng)。

圖6 GPS-1 對(duì)UVB 照射組HFF-1 細(xì)胞活力影響Fig.6 Effect of GPS-1 on the viability of HFF-1 cells in UVB irradiation group

2.5 GPS-1 對(duì)UVB 照射組細(xì)胞內(nèi)SOD、MDA、ROS、GSH-Px、MMP-1、MMP-9 的影響

皮膚成纖維細(xì)胞是合成膠原及彈性纖維的主要場(chǎng)所，雖然此種細(xì)胞位于真皮層，但更易發(fā)生氧化損傷[28]。當(dāng)UVB 照射成纖維細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)SOD 和GSH-Px 抗氧化酶的活性受到抑制，當(dāng)大量的ROS未能得到及時(shí)清除出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，將破壞細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)，激活基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)，導(dǎo)致脂質(zhì)分解，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，形成過(guò)氧化脂質(zhì)產(chǎn)物（MDA）[14]。因此，測(cè)定MDA 含量，可間接反映細(xì)胞損傷程度，而SOD 作為衡量機(jī)體抗氧化能力大小的重要因素，可反映細(xì)胞消除ROS 的能力[29]。

如圖7 所示，與空白對(duì)照組相比，UVB 照射組HFF-1 細(xì)胞中ROS 和MDA 含量顯著增高（P＜0.01），SOD 和GSH-Px 酶活力顯著降低（P＜0.01），說(shuō)明UVB照射對(duì)HFF-1 有明顯損傷作用，大量的ROS 未能被細(xì)胞清除，同時(shí)導(dǎo)致生成過(guò)量的MDA，造成細(xì)胞氧化損傷，引起機(jī)體衰老。與UVB 照射組相比，經(jīng)GPS-1 保護(hù)干預(yù)后，HFF-1 中ROS 含量降低，GPS-1低、中、高劑量組分別下降了21.5%、42.8%、56.5%，且具有顯著性差異（P＜0.01），說(shuō)明GPS-1 可有效降低因UVB 刺激產(chǎn)生的ROS。同樣地，當(dāng)GPS-1 質(zhì)量濃度分別為200、500 和800 μg/mL 時(shí)，HFF-1 中MDA 含量降低，分別為4.9、3.4、2.9 nmol/mL（P＜0.01），呈劑量依賴性。與UVB 照射組相比，當(dāng)GPS-1 質(zhì)量濃度分別為200、500 和800 μg/mL 時(shí)，SOD 含量分別提高了32.5%、75.0%、128.9%（P＜0.01），說(shuō)明GPS-1 顯著提升HFF-1 細(xì)胞SOD 活力。與UVB 照射組相比，當(dāng)GPS-1 質(zhì)量濃度分別為200、500 和800 μg/mL 時(shí)，GSH-Px 含量分別提高了29.7%、59.9%、108.3%（P＜0.01），說(shuō)明GPS-1 可以調(diào)節(jié)HFF-1 細(xì)胞GSH-Px 含量。在衰老細(xì)胞中，ROS 和MDA 含量顯著增加，SOD 和GSH-Px 酶活力顯著降低，在該模型下，GPS-1 能有效減少細(xì)胞中ROS 和MDA 含量，有效提高SOD 和GSH-Px 酶活力，說(shuō)明GPS-1 能夠通過(guò)減少ROS 含量，防止細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，對(duì)MDA 的產(chǎn)生具有抑制作用，降低細(xì)胞氧化損傷，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)SOD 和GSH-Px 活力提升，提高細(xì)胞抗氧化能力，從而幫助細(xì)胞對(duì)抗由UVB 誘導(dǎo)引起的細(xì)胞衰老。

圖7 GPS-1 對(duì)HFF-1 細(xì)胞內(nèi)SOD（a）、MDA（b）、ROS（c）、GSH-Px（d）、MMP-1（e）和MMP-9（f）的影響Fig.7 Effects of GPS-1 on SOD (a), MDA (b), ROS (c), GSH-Px (d), MMP-1 (e) and MMP-9 (f) in HFF-1 cells

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一種具有廣泛特異性的而且?guī)缀蹩梢苑纸馑屑?xì)胞外基質(zhì)成分的水解酶。MMP-1 特異性降解I 型膠原蛋白，使得I、III 型膠原比例下降，MMP-9 作為一種明膠酶，可以繼續(xù)降解MMP-1 降解產(chǎn)物，導(dǎo)致皮膚膠原蛋白流失，繼而發(fā)生衰老發(fā)生[30]。如圖7e、圖7f 所示，與UVB線照射組相比，低劑量的人參多糖即可極顯著降低HFF-1 細(xì)胞內(nèi)MMP-1 和MMP-9 的含量（P＜0.01），而當(dāng)添加高劑量的人參多糖時(shí)，MMP-1 和MMP-9 含量接近正常未經(jīng)UVB 照射組細(xì)胞內(nèi)水平，說(shuō)明人參多糖可以抑制MMP-1 和MMP-9 的表達(dá)，達(dá)到減少膠原分解的功效，改善細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而具有延緩皮膚衰老的效果。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以人參為原料，通過(guò)提取分離純化得到人參精多糖。采用高效凝膠滲透色譜法對(duì)人參精多糖進(jìn)行分析，結(jié)果表明該人參多糖為均一性多糖，相對(duì)分子質(zhì)量為2.104 kDa，多糖純度為95.13%，另外通過(guò)紅外光譜、核磁譜圖對(duì)人參結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步分析。進(jìn)一步利用UVB 照射HFF-1 細(xì)胞模型，通過(guò)ROS、MDA、SOD、GSH-Px、MMP-1 和MMP-9 等指標(biāo)的測(cè)定，對(duì)人參精多糖進(jìn)行抗皮膚衰老的探究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明人參精多糖可有效去除細(xì)胞中的ROS，抑制MDA 的含量，緩解由外源條件（UVB）造成的細(xì)胞受損，同時(shí)，促進(jìn)SOD 和GSH-Px 抗氧化酶活提升，提高細(xì)胞抗氧化能力，通過(guò)維持氧化還原平衡來(lái)達(dá)到抗衰老的作用，為皮膚提供有利的組織環(huán)境；此外，人參精多糖還可抑制MMP-1 和MMP-9 的表達(dá)，達(dá)到減少膠原分解的功效，維持皮膚彈性，延緩皮膚衰老。因此，人參多糖具有一定的抗皮膚衰老作用，可作為一種延緩衰老功效原料，應(yīng)用于化妝品、保健品等領(lǐng)域，可以有力提升人參的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)能力，進(jìn)一步提高經(jīng)濟(jì)效益。