厲昌旭，李 爍，張意可，戚澤筠，湯威威，高 琪，劉嘉悅，邵夢婷，王艷艷，趙 宏

（佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江佳木斯 154007）

白術(shù)（Atractylodes macrocephalaKoidz）為多年生菊科草本植物，是我國傳統(tǒng)的中草藥，其味苦、甘，性溫，歸脾、胃經(jīng)，具有健脾益氣、燥濕利水等功效，且白術(shù)屬藥食同源性藥材，早在2002 年便被國家衛(wèi)健委納入可用于保健食品的中藥材，其在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣泛作用，古人常以白術(shù)為原料熬湯，用以驅(qū)除體寒，現(xiàn)代主要用于補(bǔ)脾胃，疏肝氣[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)中含有揮發(fā)油、多糖以及氨基酸等多種化學(xué)成分，其中，多糖是其主要活性成分之一，具有抗氧化、抗衰老、促進(jìn)胃腸黏膜損傷修復(fù)、保護(hù)肝臟等作用[3]。目前，白術(shù)多糖（AMP）在分離、純化、藥品及保健產(chǎn)品等方面擁有廣泛的研究報道，但對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾及修飾后活性研究等方面卻鮮有報道[4]。

中藥多糖是藥用植物中的主要活性成分之一，是生物體中繼蛋白質(zhì)、核酸之后的新一類信息分子[5]。現(xiàn)有研究表明，多糖的活性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，因此，對多糖進(jìn)行適當(dāng)修飾可改變其分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，從而可以提高或改變其原本的生物活性。目前，中藥多糖的各種修飾方法中，硫酸酯化、磷酸化和羧甲基化是最常見的方法[6-8]。其中硫酸酯化會取代中藥多糖中的羥基，使得C-6 位的單糖殘基更為活躍，相比于其他兩種修飾方法，硫酸酯化多糖的生物活性，如抗氧化、抗病毒等有明顯提高[9]。硫酸酯化常用的方法為濃硫酸法、三氧化硫-吡啶法、氯磺酸-吡啶法，其中濃硫酸法具有試劑方便易得、制備流程簡單易行、易分離、毒性低等優(yōu)點(diǎn)[10]。

研究證實，乳腺屬濕寒性器官，而現(xiàn)代人吃的食物又普遍性涼，進(jìn)而導(dǎo)致乳腺功能的失衡，引發(fā)乳腺增生，故在乳腺增生的日常保健中要避免攝入高脂性涼的食物，可適量服用一些養(yǎng)血、益氣、散瘀、溫?zé)犷惖臓I養(yǎng)保健品或食物，還應(yīng)保持心情舒暢，營造良好的內(nèi)外環(huán)境。而白術(shù)是可緩解人體濕寒性的食品原料，更有“白術(shù)茶”“參苓白術(shù)顆?！钡瓤缮⒑?，補(bǔ)脾益氣的保健佳品，故以白術(shù)為原材料用于乳腺增生的食療保健產(chǎn)品必將會有廣闊的市場[11]。故本文基于對天然活性成分衍生增效這一理念，結(jié)合多糖羥基是其重要修飾基團(tuán)的理論基礎(chǔ)，結(jié)合前期研究基礎(chǔ)，以增強(qiáng)白術(shù)多糖治療乳腺增生為目的，得到白術(shù)多糖硫酸酯制備工藝，所得參數(shù)穩(wěn)健可靠，重現(xiàn)性高，方便易得，所制備硫酸酯化白術(shù)多糖在改善MGH 大鼠病理及生理等方面有顯著提升，不僅為其它植物多糖的衍生物制備工藝研究提供了理論參考，為天然產(chǎn)物增效研究提供科學(xué)思路，同時也為白術(shù)在藥食兩用方面的開發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SD 大鼠（SPF 級） 50 只，雌性（200～220 g），長春億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司，（許可證號：SCXK（吉）-2020-0002）。飼養(yǎng)于佳木斯大學(xué)SPF 級實驗動物中心，動物使用許可證號：SYXK（黑）2021-018，飼養(yǎng)環(huán)境的溫度為（22±2）℃，濕度為60%±5%。所有實驗程序均經(jīng)佳木斯大學(xué)實驗動物中心倫理委員會審核通過（倫理批號：JMSU-242）；白術(shù) 哈爾濱普方藥業(yè)飲片有限公司，產(chǎn)地：浙江，批號：201001，經(jīng)佳木斯大學(xué)藥學(xué)院張宇教授鑒 定為菊科植物白術(shù)（Atractylodes macrocephalaKoidz.）的干燥根莖；二苯代苦味酰肼 天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；苯甲酸雌二醇、黃體酮注射液上海全宇生物科技動物藥業(yè)有限公司；枸櫞酸他莫昔芬片 揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)；所有分離用有機(jī)溶劑 均為國產(chǎn)分析純。

F-101S 型恒溫磁力攪拌器 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；FDU-1200 型冷凍干燥機(jī) 日本東京理化株式會社；FTIR-8400S 型紅外光譜儀 日本Shimadzu公司；Agilent-1260 高效液相色譜儀 美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 白術(shù)多糖（AMP）的制備 白術(shù)粉碎、干燥后，采用70%乙醇回流脫脂，陰干。取白術(shù)干燥粉末500 g，加入9 L 蒸餾水，90 ℃回流提取3 次，每次3 h，過濾，合并濾液，減壓濃縮，離心，取上清液加入無水乙醇至上層溶液乙醇濃度為80%，4 ℃靜置48 h，4000 r/min，離心10 min，收集沉淀，復(fù)溶濃縮，冷凍干燥后得白術(shù)總多糖，經(jīng)Sevag 法除蛋白，透析，冷凍干燥，得AMP。

1.2.2 硫酸酯化白術(shù)多糖（SAMP）的制備 將2.5 mL正丁醇按照一定物料體積比與濃硫酸混合后加入至干燥三頸瓶中，隨后加入125 mg 的（NH4）2SO4充分?jǐn)嚢?，再?.2 g AMP 緩緩加入，在一定溫度下，攪拌反應(yīng)一定時間。反應(yīng)結(jié)束后采用2.5 mol/mL 的NaOH 調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH 至中性（pH7.0～8.0）。透析48 h，加入無水乙醇至上清液濃度為80%，4 ℃靜置48 h，4000 r/min 離心15 min 收集沉淀，復(fù)溶濃縮，冷凍干燥得到SAMP。每組實驗重復(fù)3 次，計算SAMP 硫酸基取代度[12]。

1.2.3 硫酸基取代度的測定 采用氯化鋇-明膠濁度法，繪制硫酸基取代度（degree of substitution，DS）標(biāo)準(zhǔn)曲線[13-14]。稱取SAMP 10 mg 于10 mL 水解管中，加入1 mol/L 鹽酸溶液定容，振蕩溶解，100 ℃水解4 h，冷卻至室溫。吸取糖水解液0.2 mL，加1 mol/L鹽酸補(bǔ)至2 mL，依次加入3.8 mL 3%三氯乙酸、1 mL氯化鋇-明膠溶液（氯化鋇1%，明膠0.5%），室溫靜置15 min 后，于360 nm 下測定反應(yīng)吸光度值。按上述方法得硫酸基標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.06825x+0.03319，R2=0.99509，硫酸基含量在0.2～2.0 mg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

DS 參照以下公式（1）、（2）計算：

式中：S 為待測樣品硫酸基的含量，%；WS為糖解液吸光度對應(yīng)下的硫酸基質(zhì)量，mg；W 為所取多糖的質(zhì)量，mg；DS 為待測樣品硫酸基取代度。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 反應(yīng)試劑比對SAMP 取代度的影響 稱取0.5 g 白術(shù)多糖分別加入反應(yīng)試劑比為1:1、2:1、3:1、4:1 的濃硫酸和正丁醇溶液中，0 ℃下，反應(yīng)時20 min，按1.2.2 項下方法進(jìn)行操作，考察反應(yīng)試劑比對SAMP 取代度的影響[15]。

1.2.4.2 反應(yīng)時間對SAMP 取代度的影響 稱取0.5 g 白術(shù)多糖加入反應(yīng)試劑體積比為2:1 的濃硫酸和正丁醇溶液中，0 ℃下分別反應(yīng)10、20、30、40 min，按1.2.2 項下方法進(jìn)行操作，考察反應(yīng)時間對SAMP 取代度的影響。

1.2.4.3 反應(yīng)溫度對SAMP 取代度的影響 稱取0.5 g 白術(shù)多糖加入反應(yīng)試劑比為2:1 的濃硫酸和正丁醇溶液中，分別在-10、0、10、20 ℃下反應(yīng)20 min，按1.2.2 項下方法進(jìn)行操作，考察反應(yīng)溫度對SAMP取代度的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果選取因素水平，以SAMP 取代度為響應(yīng)值建立三因素三水平的Box-Behnken 實驗。結(jié)果如表1 所示。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.6 AMP 及SAMP 的基本組成分析

1.2.6.1 苯酚-濃硫酸法測定糖含量 參考肖恩來等[16]的方法，以0.1 mg/mL 葡萄糖溶液為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制0.1 mg/mL 的AMP 與SAMP 樣品溶液，按文獻(xiàn)方法處理。

1.2.6.2 考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量 參考李哲明等[17]的方法，以0.1 mg/mL 牛血清白蛋白溶液為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制1 mg/mL 的AMP 與SAMP 樣品溶液，按文獻(xiàn)方法處理。

1.2.6.3 硫酸-咔唑法測定糖醛酸含量 參考劉良偉等[18]的方法，以1 mg/mL 葡萄糖醛酸溶液為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制1 mg/mL 的AMP 與SAMP樣品溶液，按文獻(xiàn)方法處理。

1.2.7 傅里葉紅外光譜測定 參考蔣茂婷等[19]的方法，取AMP 與SAMP 樣品，使用紅外光譜儀，在500～4000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)掃描，確定AMP 硫酸酯的合成情況。

1.2.8 AMP 及SAMP 的分子量測定1.2.8.1 色譜條件 儀器：Agilent 1260 高效液相色譜儀；檢測器：UM4800 蒸發(fā)光檢測器；色譜柱：Ultrahydrogel TM linear（7.8 mm×300 mm）色譜柱；柱溫：50 ℃；檢測器溫度：50 ℃；流動相：超純水；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量15 μL。

1.2.8.2 右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 參考何坤明[20]的方法，分別稱取不同分子量標(biāo)準(zhǔn)品右旋糖酐（3000、12000、25000、50000、80000、150000、270000 Da），進(jìn)HPLC 分析；以保留時間（min）為x 軸，標(biāo)準(zhǔn)品相對分子質(zhì)量對數(shù)（lgMW）為y 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；AMP 與SAMP 分析條件同上，根據(jù)保留時間計算相應(yīng)樣品分子量。

1.2.9 抗氧化活性測定 根據(jù)梁中煥等[21]的方法進(jìn)行DPPH、ABTS+、OH 自由基測定，以L（+）-抗壞血酸（VC）溶液作為陽性對照，按照公式（3）、（4）、（5）分別計算其自由基清除能力。

式中：A0表示空白對照組吸光度值；A1表示乙醇代替DPPH 溶液吸光度值；A2表示樣品組吸光度值。

式中：A0表示空白對照組吸光度度值；A1表示蒸餾水代替ABTS 工作液吸光度值；A1表示樣品吸光度度值。

式中：A0表示空白對照組的吸光度值；A1表示加入樣品及H2O2的吸光度值；A2表示以蒸餾水代替H2O2的吸光度值。

1.2.10 AMP 與SAMP 抗乳腺增生作用

1.2.10.1 動物分組、造模及給藥 雌性SD 大鼠40 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，隨機(jī)分為空白組（Con）、模型組（Mod）、陽性藥物組（Pos）、AMP 組、SAMP 組，每組8 只。參照黃越等[22]的造模方法，除Con 外，其余各組大鼠肌注苯甲酸雌二醇0.5 mg/（kg·d），連續(xù)25 d，繼而注射黃體酮5 mg/（kg·d），連續(xù)5 d，大鼠毛色微黃，乳頭紅腫，體重增長迅速表示造模成功。

他莫昔芬給藥量換算：按照說明書上70 kg 成人每日最大用藥量換算大鼠的給藥劑量為4 mg/（kg·d）；AMP 及SAMP 給藥劑量換算：根據(jù)《中國藥典》（2022 版）中記載70 kg 成人每日攝取白術(shù)最大用藥量為12 g，換算大鼠的生藥劑量為白術(shù)生藥量1.575 g/kg；根據(jù)白術(shù)生藥劑量換算多糖給藥劑量，AMP 組（278 mg/（kg·d）），SAMP 組（278 mg/（kg·d））。于造模結(jié)束后，第31 d 起，于每日下午Con 組、Mod 組大鼠給予生理鹽水，Pos 組給予他莫昔芬混懸液，AMP、SAMP 組給予相應(yīng)多糖，連續(xù)30 d。

1.2.10.2 指標(biāo)檢測 每7 d 對大鼠體重進(jìn)行測量，末次給藥24 h 后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉動物，用游標(biāo)卡尺測量第二對乳頭直徑，剖取第2 對乳腺組織，用PBS 洗滌并固定在4%多聚甲醛溶液中。將固定的組織包埋在石蠟塊中，將每個樣品切成4 μm 厚的切片并用蘇木精伊紅（H&E）染色進(jìn)行組織學(xué)檢查。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)使用GraphPad 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較均采用單因素方差分析（One Way ANOVA），數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（MEAN±SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 反應(yīng)試劑比對SAMP 取代度的影響 由圖1可知，SAMP硫酸基取代度隨濃硫酸含量增加而上升，并且在濃硫酸與正丁醇體積比為2:1 時，取代度達(dá)到最大為0.64。但當(dāng)濃硫酸含量繼續(xù)增大后，產(chǎn)物的取代度反而降低，這可能因為濃硫酸過量后，酸性增強(qiáng)，極易引起SAMP 的碳化，造成取代度的下降。故選擇反應(yīng)試劑比2:1（v/v）為響應(yīng)面設(shè)計的中心值。

圖1 反應(yīng)試劑比對SAMP 取代度的影響Fig.1 Effect of reagent proportion on the degree of substitution of SAMP

2.1.2 反應(yīng)時間對SAMP 取代度的影響 由圖2 可知，隨反應(yīng)時間增加，SAMP 硫酸基取代度呈上升趨勢，20 min 時，取代度達(dá)到最大為0.54。當(dāng)反應(yīng)超20 min，取代度逐漸下降。這可能由于反應(yīng)時間的延長有利于多糖與酯化試劑的充分吸附和反應(yīng)，當(dāng)反應(yīng)時間持續(xù)延長時，反應(yīng)趨于平衡，繼續(xù)反應(yīng)致使多糖發(fā)生降解，極易在醇沉、透析時造成損耗，導(dǎo)致SAMP 取代度降低。故選擇反應(yīng)時間20 min 為響應(yīng)面設(shè)計的中心值。

圖2 反應(yīng)時間對SAMP 取代度的影響Fig.2 Effect of reaction time on the degree of substitution of SAMP

2.1.3 反應(yīng)溫度對SAMP 取代度的影響 由圖3 可知，隨反應(yīng)溫度上升，SAMP 硫酸基取代度呈先上升后下降的趨勢，0 ℃時取代度最高為0.51，隨溫度繼續(xù)上升，取代度反而下降，其原因可能為多糖的硫酸酯化反應(yīng)為可逆性放熱過程，過高的反應(yīng)溫度阻礙化學(xué)平衡向產(chǎn)物生成的方向發(fā)展，從而造成SAMP 取代度的下降。故選擇反應(yīng)溫度0 ℃為響應(yīng)面設(shè)計的中心值。

圖3 反應(yīng)溫度對SAMP 取代度的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on the degree of substitution of SAMP

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

Box-Behnken 設(shè)計實驗結(jié)果見表2。利用Design-Expert 12 對優(yōu)化實驗結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合，得回歸方程：

表2 Box-Behnken 試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Box-Behnken experiment design and the results

由回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3 所示。由表3 可知在實驗設(shè)計范圍內(nèi)，該擬合模型的P＜0.01 為極顯著，失擬項P＞0.05，說明該模型具有統(tǒng)計學(xué)顯著性，模型決定系數(shù)R2=0.9884，表明試驗響應(yīng)值與預(yù)測值的相關(guān)度高。數(shù)據(jù)中沒有異常點(diǎn)，擬合程度良好，可用此模型對白術(shù)多糖硫酸酯制備工藝進(jìn)行預(yù)測和分析。模型一次項A 和B 對響應(yīng)值綜合評分影響達(dá)到顯著（P＜0.05），交互項AB 對響應(yīng)值影響顯著（P＜0.05），AC、BC 無顯著影響（P＞0.05），二次項A2、B2、C2對響應(yīng)值綜合評分影響均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）；根據(jù)回歸模型作出相應(yīng)的響應(yīng)面及等高線，結(jié)果見圖4。分析反應(yīng)試劑比、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度三個因素交互作用對響應(yīng)值的影響，曲面越陡則表明該因素對響應(yīng)值的影響越大，等高線圖為橢圓形表示兩因素交互影響顯著，圓形反之。其中，反應(yīng)試劑比對響應(yīng)值影響較強(qiáng)，曲面較陡，等高線呈橢圓；反應(yīng)時間與反應(yīng)溫度對響應(yīng)值影響較弱，曲面較緩，曲面圖為圓形。綜上，3 個因素對響應(yīng)值的影響大小依次為：反應(yīng)試劑比＞反應(yīng)時間＞反應(yīng)溫度。

圖4 響應(yīng)曲面圖Fig.4 Response surface plots

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Analysis of variance (ANOVA) of regression equations

2.3 驗證試驗結(jié)果

結(jié)合實際實驗條件需要，確定最佳硫酸酯化工藝優(yōu)化為：反應(yīng)試劑比2:1（V:V），反應(yīng)溫度-4 ℃，反應(yīng)時間21 min，并進(jìn)行三次平行實驗驗證所得優(yōu)化工藝。三次平行實驗得平均取代度為0.59±0.00391，誤差較小，實際測量值與預(yù)測值基本一致，表明該模型預(yù)測有效、準(zhǔn)確度高。

2.4 AMP 及SAMP 基本組成分析

2.4.1 糖含量測定結(jié)果 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=7.25653x+0.11191，R2=0.9996，在0.02～0.10 mg/mL范圍內(nèi)線性良好，經(jīng)計算AMP 糖含量為64.23%，SAMP 糖含量為54.75%。

2.4.2 蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=7.31466x+0.08008，R2=0.9977，在0.02～0.10 mg/mL 范圍內(nèi)線性良好，經(jīng)計算AMP 蛋白含量為3.38%，SAMP 蛋白含量為2.98%。

2.4.3 糖醛酸含量測定結(jié)果 得葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=1.45271x-0.00891，R2=0.9926，在0.02～0.10 mg/mL 范圍內(nèi)線性良好，經(jīng)計算AMP 糖醛酸含量為5.36%，SAMP 糖醛酸含量為3.17%。

2.5 AMP 及SAMP 的紅外光譜分析結(jié)果

AMP 在3353 cm-1附近處有O-H 伸縮振動吸收峰，2925 cm-1附近處有C-H 伸縮振動吸收峰，1641 cm-1附近有C=O 非對稱收縮振動峰，說明AMP 具有多糖特征吸收峰[23]；1432 cm-1附近處為糖分子C-H 鍵變角振動峰，1029 cm-1附近為吡喃糖環(huán)（C-O-H）伸縮振動吸收峰，933 cm-1附近為C-OC 不對稱伸縮振動峰[24]。SAMP 不僅在3403、2942、1617 cm-1具有多糖特征吸收峰，且在833 cm-1處出現(xiàn)C-O-S 特征吸收峰，在1226 cm-1處出現(xiàn)S=O 特征吸收峰，證明硫酸根基團(tuán)已經(jīng)成功連接到AMP 的糖殘基上，白術(shù)多糖硫酸酯制備成功[25]。結(jié)果如圖5所示。

圖5 AMP 和SAMP 紅外光譜圖Fig.5 IR spectrum of AMP and SAMP

2.6 AMP 及SAMP 分子量測定結(jié)果

由圖6 可知，右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸方程：y=-0.51368x+12.73243，R2=0.99174，分子量在3000～2700000 Da 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。由此得AMP 與SAMP 分子量分別為2719、33524 Da。與AMP 比較，SAMP 分子量明顯增加，說明AMP 糖鏈上的羥基被硫酸基取代，證實硫酸酯化成功[26]。

圖6 AMP 和SAMP 分子量測定結(jié)果Fig.6 Molecular weight determination results of AMP and SAMP

2.7 AMP 及SAMP 抗氧化活性測定結(jié)果

由圖7 可知，AMP 與SAMP 對DPPH、ABTS+和OH 自由基均具有較好的清除作用，與濃度呈正相關(guān)，且SAMP 的清除能力均優(yōu)于AMP。當(dāng)溶液質(zhì)量濃度達(dá)到0.5 mg/mL 時，SAMP 對自由基的清除能力最大，對DPPH、ABTS+、OH 自由基清除率分別為54.91%、38.21%、42.23%；AMP 對DPPH、ABTS+和OH 自由基清除率分別為41.88%、34.64%、36.90%；研究表明，經(jīng)硫酸酯化修飾的多糖，其自由基清除能力高于未修飾多糖，與本文研究結(jié)果一致[27-29]。由此可以推斷出硫酸基對自由基的清除起到重要作用，其機(jī)理可能是經(jīng)硫酸酯化修飾后，多糖分子中部分-OH被-OSO3H 取代，從而使自由基清除能力增強(qiáng)[30]。

圖7 AMP 和SAMP 對DPPH、ABTS+和OH 自由基清除率Fig.7 Scavenging activity of AMP and SAMP on DPPH,ABTS+, and hydroxyl free radical rate rate

2.8 乳頭直徑及體重測定結(jié)果

根據(jù)Liu 等[31]的造模結(jié)果，造模后大鼠體重增長迅速，乳頭紅腫且高挺，證明造模成功。如圖8A所示，與Con 組比較，Mod 組大鼠乳頭直徑極顯著增大（P＜0.01）；與Mod 組比較，AMP 組大鼠乳頭直徑顯著減?。≒＜0.05），SAMP 組大鼠乳頭直徑極顯著減小（P＜0.01）。如圖8B 所示，Con 組體重始終平穩(wěn)增長并逐漸趨于穩(wěn)定，其余各組在造模時體重增長迅速，給藥干預(yù)后體重逐漸恢復(fù)正常，Mod 組與治療組大鼠體重有極顯著性差異（P＜0.01），Pos 組接近正常大鼠體重，AMP 與SAMP 組的大鼠體重有所改善。這可能是因為造模后大鼠體內(nèi)雌激素水平升高，導(dǎo)致大鼠代謝紊亂，而多糖給藥后能通過調(diào)理大鼠體內(nèi)雌激素水平，改善大鼠代謝水平，使大鼠體重恢復(fù)正常。

圖8 大鼠乳房直徑及體重變化Fig.8 Changes of mammary breast diameter and body weight in rats

2.9 乳腺組織病理學(xué)結(jié)果

Con 組大鼠乳腺組織細(xì)胞形狀規(guī)則，乳腺小葉腺泡數(shù)少，導(dǎo)管細(xì)長，無增生性病變和分泌物。Mod 組導(dǎo)管增生擴(kuò)張明顯，小葉內(nèi)腺泡密集，大小不等，形狀不規(guī)則，內(nèi)含分泌物；與Mod 組比較，Pos 組小葉內(nèi)腺泡形狀規(guī)則，導(dǎo)管為細(xì)長狀，無分泌物；AMP 組大鼠小葉內(nèi)腺泡數(shù)量減少，腔內(nèi)少量分泌物，導(dǎo)管擴(kuò)張程度減輕；SAMP 組小葉內(nèi)腺泡排列較規(guī)則，腔內(nèi)分泌物不可見，導(dǎo)管擴(kuò)張程度明顯減輕。說明白術(shù)多糖可降低大鼠乳腺增生程度，且其硫酸酯化后作用更為明顯。結(jié)果如圖9 所示。

圖9 大鼠乳腺組織病理切片圖（HE，×100）Fig.9 Histopathological section of rat mammary gland（HE,×100）

3 討論與結(jié)論

據(jù)報道，天然多糖的活性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，通過結(jié)構(gòu)修飾將部分基團(tuán)進(jìn)行替換可有效改善其生物活性，如硫酸酯化，是利用硫酸根基團(tuán)取代多糖側(cè)鏈上的羥基，進(jìn)而改變多糖的分子量、電荷或鏈構(gòu)象等，使其抗氧化、抗炎等活性得到明顯提高[32]。本文采用濃硫酸法對AMP 進(jìn)行硫酸酯化修飾，但其取代度往往因反應(yīng)試劑比例、反應(yīng)時間、溫度等因素的不同而有較大差異，進(jìn)而影響其生物活性，因此可通過響應(yīng)面法優(yōu)化白術(shù)多糖硫酸酯制備工藝。相較于傳統(tǒng)的正交設(shè)計，響應(yīng)面法得到的回歸方程精度更高，并可評價各因素的交互作用。實驗結(jié)果表明，白術(shù)多糖硫酸酯最佳制備工藝條件準(zhǔn)確度好、精密度高、與實際值貼合。

在正常狀態(tài)下，人體內(nèi)自由基的產(chǎn)生及清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，一旦這種平衡被打破，疾病就會被誘發(fā)或加重。據(jù)相關(guān)報道，在乳腺組織中雌激素含量的增加伴隨著脂質(zhì)過氧化的發(fā)生，其產(chǎn)物MDA 大量生成，自由基產(chǎn)生和清除之間的平衡被打破，并由于MDA 具有細(xì)胞毒性，可引起乳腺細(xì)胞的損傷，導(dǎo)致乳腺間質(zhì)水腫反復(fù)發(fā)作，并形成不同程度的導(dǎo)管上皮和纖維結(jié)締組織增生，引發(fā)囊腫，最終發(fā)展為乳腺增生[33]。本實驗結(jié)果顯示，AMP 與SAMP 對DPPH、ABTS+、OH 自由基均具有良好的清除能力，且可減小MGH 大鼠乳頭直徑、減少腺泡數(shù)量、減輕導(dǎo)管的異常擴(kuò)張、平穩(wěn)大鼠體重。表明AMP 及SAMP 均具有良好的抗氧化作用與治療MGH 作用，且AMP經(jīng)硫酸酯化修飾后活性顯著增強(qiáng)。

綜上所述，本實驗通過響應(yīng)面優(yōu)化法獲得白術(shù)多糖硫酸酯的最佳制備工藝，初步評價白術(shù)多糖硫酸酯的體外抗氧化與抗MGH 兩個方面的生物活性，為進(jìn)一步闡明天然產(chǎn)物衍生化的構(gòu)效關(guān)系奠定基礎(chǔ)，為探討白術(shù)多糖及其衍生物治療MGH 的作用機(jī)制提供前期數(shù)據(jù)，對臨床中藥治療MGH 具有參考價值。但本實驗仍需對白術(shù)多糖與白術(shù)多糖硫酸酯的構(gòu)效關(guān)系作進(jìn)一步闡明以及兩者通過抗氧化途徑治療MGH 的具體作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。