楊 舒，黃徐英，屠 寒，劉 忠，柳 鑫

（武漢市第四醫(yī)院藥劑科，湖北武漢 430034）

隨著經(jīng)濟水平的快速提升，社會競爭愈趨激烈，超長時間、高強度、大負荷的工作節(jié)奏使疲勞逐漸成為普遍的社會健康問題。疲勞是亞健康的主要表現(xiàn)之一，常伴隨身體乏力、肌肉酸痛、內(nèi)分泌紊亂、免疫力下降等癥狀，嚴重影響人們的工作效率和生活質量。諸多研究表明，疲勞的產(chǎn)生與體內(nèi)積累過量的自由基，導致氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡密切相關[1-2]。因此，諸多學者開發(fā)了多糖、多酚、黃酮等抗氧化成分，以清除體內(nèi)自由基，減少機體氧化損傷，改善機體的生理機能，緩解機體疲勞[3]。從藥食兩用的桑葚資源挖掘開發(fā)安全性高、資源豐富、抗疲勞功效顯著的產(chǎn)品，已逐漸成為當前國內(nèi)學者的研究熱點，如桑葚多糖[4]、桑椹果醋[5]、襄荷桑葚復合飲料[6]等。

桑葚（Mulberry），是?？粕洌∕orus albaLinn.）的聚花果，又名烏葚、桑果等；因口味酸甜可口，色澤鮮亮，有“民間圣果”的美譽，備受消費者的信賴與喜愛。桑葚中含豐富的花色苷、維生素、氨基酸、多糖等活性成分，具有極高的食用價值和營養(yǎng)價值[7-8]。作為中藥資源入藥歷史悠久，桑葚收錄于《唐本草》、《本草綱目》等中藥典籍，具有滋陰補血、生津潤燥的功效[9]。花色苷是桑葚中一類重要的多酚成分，常作為天然色素、營養(yǎng)成分、活性成分等功能因子，用于食品、化妝品和藥品等，如矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-蕓香糖苷和飛燕草素-3-O-葡萄糖苷等[7]。因吡喃環(huán)存在未配對電子，花色苷具有超強的抗氧化活性[10]。同時，桑葚花色苷還可抗脂質氧化、抗衰老等，預防視疲勞、糖尿病、肥胖等[11-12]。因此，桑葚花色苷富有營養(yǎng)保健價值，極具抗疲勞的潛力。然而，桑葚極易腐敗，易造成較大的資源浪費。在桑葚抗疲勞的報道中，關于桑葚花色苷抗疲勞作用的研究較少，其資源價值未被充分開發(fā)利用。本研究采用AB-8 大孔樹脂、HPLC 分別制備、分析桑葚花色苷提取物，并通過研究桑葚花色苷體內(nèi)外的抗氧化活性，以探討桑葚花色苷抗疲勞的作用機制，為進一步開發(fā)桑葚資源及其營養(yǎng)保健價值提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑葚鮮果（Mulberry） 2019 年5 月購自湖北省武漢市江岸區(qū)水果批發(fā)市場，清潔級C57BL6J 雄性小鼠 60 只，7 周，體重（20.8±1.03） g，北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號SCXK（京）2019-0008；小鼠分籠飼養(yǎng)，自由攝食和飲水，飼養(yǎng)溫度22～24 ℃，相對濕度為40%～60%；乳酸（Lac）、尿素氮（BUN）、活性氧（ROS）試劑盒 南京建成生物工程有限公司；乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）試劑盒 上海臻科生物科技有限公司；TRIzol 試劑北京百奧萊博科技有限公司；引物、實時熒光定量聚合酶鏈式反應試劑盒 杭州聯(lián)科美訊生物醫(yī)藥技術有限公司；矢車菊素-3-O-葡萄糖（C3G，純度≥98%）、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷（P3G，純度≥98%）、飛燕草素-3-O-葡萄糖苷（D3G，純度≥98%） 上海源葉生物科技有限公司；甲醇（色譜純）、甲酸（色譜純） 北京市通廣精細化工公司；磷酸緩沖鹽水溶液、蒸餾水自制。

多功能酶標儀（Spectramax i3x）、高速冷凍離心機（Sorvall ST16R）、流式細胞儀（Attune NxT） 賽默飛世爾科技有限公司；高效液相色譜儀（Agilent 1260） 安捷倫科技有限公司；電子精密天平（New Classic ME） 瑞士梅特勒-托利多集團；電泳槽（Mini-PROTEAN? Tetra） 伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司；實驗室超純水機（Direct-Q3） 美國默克集團；超凈臺（SW-CJ-2FD） 上海涵今儀器儀表有限公司；實驗室超低溫冰箱（DW-HL340） 中科美菱低溫科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 桑葚花色苷餾分制備 將桑葚鮮果清洗除雜后，加入4 倍體積的60%乙醇溶液（含0.05%醋酸）提取，碾碎成漿液，過濾，得濾液；濾液7000 r/min 離心10 min，取上清液，凍干，作桑葚粗提物（凍干粉）備用；取凍干粉加水溶解，配制成100 mg/mL 水溶液，作桑葚溶液（MY）冷藏備用。將AB-8 大孔樹脂（2.6 cm×60 cm）活化，垂直裝柱，徑高比為1:15，備用；桑葚溶液（MY）上樣，靜置30 min；隨后依次用3 倍柱體積水、40%、60%、80%乙醇依次洗脫，流速3 BV/h，每瓶20 mL收集洗脫液，備用[7,13]。

分別精密稱取適量的C3G、P3G、D3G 標準品，配制成混合標品溶液，各成分濃度為1.0 mg/mL；精密吸取不同體積的混合標品溶液，梯度稀釋，制備不同濃度混合標品溶液（0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL）進行HPLC 分析，繪制C3G、P3G、D3G濃度與吸收峰面積的標準曲線回歸方程。

HPLC 測定桑葚花色苷色譜條件[14]：Kromasil 100-5C18色譜柱（5 μm, 250×4.6 mm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）和甲醇（B）；梯度洗脫程序為0～5 min 93%→90% A，5～10 min 90%→80% A，10～15 min 80%→75% A，15～20 min 75%→65%%，20～25 min 65%→65% A，25～30 min 65%→60% A，30～32 min 60%→92% A，32～35 min 92%→92% A；流速、柱溫、進樣量分別設置為1.0 mL/min、25 ℃、525 nm 和10 μL。

通過上述HPLC 色譜條件，分析桑葚洗脫液中花色苷（C3G、P3G、D3G）含量，合并餾分，濃縮、冷凍干燥，獲得桑葚花色苷提取物，用于小鼠實驗。

1.2.2 抗氧化活性測定 采用DPPH 自由基清除率法[15]，取1.2.1 項下純化前后的桑葚花色苷提取物，配制成水溶液，維生素C 作為陽性藥物組，濃度設置為10 μg/mL，分析各提取物抗氧化活性。

1.2.3 實驗動物分組、給藥與飼養(yǎng) 小鼠（60 只）經(jīng)適應性飼養(yǎng)后，隨機分為安靜組、有氧運動組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，共6 組，每組10 只。低、中、高劑量組小鼠用桑葚花色苷餾分灌胃給藥，根據(jù)課題組前期預實驗結果，劑量分別設置為100、200、400 mg/kg，其它組小鼠灌胃等體積的生理鹽水。

安靜組小鼠正常飼養(yǎng)；有氧運動組小鼠每天游泳10 min，隨即吸干皮膚水分正常飼養(yǎng)；模型組和低、中、高劑量組小鼠每天進行負重游泳運動力竭實驗，飼養(yǎng)周期4 周。本實驗通過湖北中醫(yī)藥大學倫理委員會審批（批號：HUCMS202111089），實驗操作符合國家制定的實驗動物管理和使用指南。

1.2.4 負重游泳力竭實驗 在給藥30 min 后，模型組和低、中、高劑量組小鼠尾部系上5%體質量的鉛絲，依次放入游泳箱（水深30 cm、水溫24±2 ℃）中進行負重游泳實驗。當小鼠頭部沉浸入水10 s，無法浮出水面，即為小鼠力竭時間。每間隔1 周，記錄小鼠負重游泳力竭時間[16]。

1.2.5 小鼠血清及組織樣本收集 在末次訓練結束30 min 后，采用2%戊巴比妥鈉溶液麻醉小鼠，摘眼球取血，置于抗凝管中7000 r/min 離心10 min，得上清液，儲藏備用。

頸椎脫臼處死小鼠，取小鼠腿部骨骼肌，用4 ℃生理鹽水漂洗，吸水紙吸干表面水分，置于-80 ℃冰箱中凍存，儲藏備用。

1.2.6 血清生化指標測定 取上述血清，參照各試劑盒說明書，測定血清中Lac、BUN 的含量，LDH、CK 的酶活力。

1.2.7 小鼠骨骼肌氧化應激指標測定 取上述骨骼肌，參照各試劑盒說明書，測定骨骼肌中ROS 和MDA、8-OHdG 含量、SOD 和GSH-Px 的酶活力。

1.2.8 小鼠骨骼肌mRNA 相對表達水平測定 取適量骨骼肌組織勻漿碾碎后，采用TRIZOL 法提取骨骼肌組織總RNA[17]。通過紫外-分光光度測定OD260/OD280比值（1.8～2.0），確定總RNA 濃度。隨后按照反轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄，以其cDNA 產(chǎn)物測定Nrf2 和HO-1 mRNA 轉錄表達水平（表1）。選取β-actin 作為內(nèi)參，以Nrf2 和HO-1 mRNA 與βactin 表達含量比值作為該因子相對表達水平。

表1 Nrf2、HO-1 和β-actin 的引物序列Table 1 Primer sequence of Nrf2, HO-1 and β-actin

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 桑葚花色苷的制備與分析

C3G、P3G、D3G 是桑葚主要的抗氧化活性成分，極具抗疲勞潛力[2,7,17]。對純化前后桑葚提取物中C3G、P3G、D3G 的含量及其抗氧化活性進行了分析，C3G、P3G、D3G 的標準曲線如表2 所示，其HPLC 圖譜如圖1 所示。經(jīng)大孔樹脂分離純化后，桑葚花色苷中雜質峰明顯較少或降低，其C3G、P3G、D3G 含量分別為9.1%、20.9%、7.6%。與桑葚粗提物比較，純化后桑葚花色苷中C3G、P3G、D3G 的含量分別增加了193.5%、190.3%、171.4%。DPPH 自由基清除實驗表明，桑葚粗提物、純化后桑葚花色苷、維生素C 的DPPH 自由基清除率分別為46.1%、88.4%、90.6%。桑葚花色苷具有良好的抗氧化活性，遠優(yōu)于桑葚粗提物的抗氧化活性?？赡茉蚴牵诨ㄉ仗崛∵^程中，大量的蛋白質、氨基酸、多糖等雜質成分亦被提取，降低了桑葚粗提物中花色苷的含量，從而影響了花色苷的抗氧化活性[18]。因此，通過高效的精制方式處理桑葚粗提物以減少雜質，提升花色苷的含量，以增強其抗氧化活性，是挖掘桑葚花色苷抗疲勞潛力的必要步驟。

圖1 桑葚花色苷提取物色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of mulberry anthocyanin extract

表2 C3G、P3G、D3G 含量測定的標準曲線方程與含量Table 2 Standard curve equation and the content of C3G, P3G, D3G

2.2 桑葚花色苷對小鼠負重游泳時間的影響

過量運動后，機體能量供應和代謝能力不足，出現(xiàn)身體乏力、肌肉酸痛等疲勞癥狀，使得機體運動能力、耐力下降等。負重游泳實驗常用于評價食品藥品的抗疲勞作用，力竭運動時間的長短客觀、直接的反映了運動能力[19-20]。由表3 可知，模型組小鼠的游泳力竭時間呈現(xiàn)先增加后逐漸降低的趨勢。第1 周小鼠適量的運動，增強了機體運動能力與忍耐力，從而延長了游泳力竭時間。然而，第2 周開始，小鼠游泳的運動量倍增，超過了身體負荷，從而產(chǎn)生疲勞導致力竭時間降低。在末次給藥后，低、中、高劑量組小鼠的游泳力竭時間分別為13.85±1.23、15.91±1.15、19.48±1.04 min。與模型組比較，低、中、高劑量組小鼠的游泳力竭時間分別延長了94.5%、125.6%、176.3%（P＜0.05），且與桑葚花色苷存在劑量依賴關系。同桑葚多糖抗疲勞研究的結果一致[4]，上述研究結果表明了桑葚花色苷作為桑葚的重要活性成分，可有效提高小鼠的運動耐力，延長小鼠運動時間，具有顯著的抗疲勞作用。

表3 桑葚花色苷對小鼠負重游泳時間的影響Table 3 Effect of mulberry anthocyanin on the loading swimming time of mice

2.3 桑葚花色苷對能量代謝的影響

Lac、BUN 分別是糖、蛋白質代謝的產(chǎn)物，其水平的高低反應機體糖類、蛋白質的消耗程度，客觀體現(xiàn)疲勞積累程度[21]。由圖2 可知，與安靜組比較，有氧運動組小鼠血清中Lac、BUN 含量無顯著性差異（P＞0.05）。與有氧運動組比較，模型組小鼠血清中Lac、BUN 含量分別顯著升高了102.3%、64.6%（P＜0.05）。在正常的情況下，機體內(nèi)的Lac、BUN 均處于動態(tài)平衡的狀態(tài)。有氧運動過程中，肌肉組織的糖原、蛋白質等物質代謝加快，以補充機體能量的消耗。Lac、BUN 的生成速率小于其分解或排出的速率。因此，有氧運動組小鼠體內(nèi)的Lac、BUN 水平較低，未產(chǎn)生相關的疲勞癥狀。然而，當運動過度時，體內(nèi)糖和蛋白質分解迅速加快。同時，機體處于缺氧狀態(tài)，大量的Lac、BUN 無法分解，堆積于體內(nèi)，破壞體內(nèi)酸堿平衡，從而使得模型組小鼠體內(nèi)Lac、BUN 濃度迅速升高，產(chǎn)生疲勞癥狀[22]。

圖2 桑葚花色苷對小鼠血清中Lac、BUN 濃度的影響Fig.2 Effect of mulberry anthocyanin on the concentration of Lac、BUN in serum of mice

低、中、高劑量組小鼠的清中Lac、BUN 濃度依次降低，與桑葚花色苷存在劑量依賴關系。與模型組比較，低劑量組Lac 和BUN 濃度無顯著性差異（P＞0.05）；中、高劑量組Lac 濃度分別顯著降低了18.8%、35.3%（P＜0.05），BUN 濃度分別顯著降低了28.9%、36.4%（P＜0.05）。高劑量組BUN 濃度與有氧運動組無顯著性差異（P＞0.05）。上述研究與百香果、胡蘿卜花色苷抗疲勞的研究結果一致[23-24]，可能由于低劑量的桑葚花色苷總量太低，而花色苷結構不穩(wěn)定，導致機體吸收的桑葚花色苷較少，無法發(fā)揮顯著的功效[25]。隨著劑量的增加，桑奢花色苷逐漸被吸收，減少了運動中糖類和蛋白質分解，使得Lac、BUN 濃度降低。因此，桑葚花色苷可改善體內(nèi)糖類、蛋白質和氨基酸的分解代謝，減少代謝產(chǎn)物的堆積，發(fā)揮抗疲勞作用。

2.4 桑葚花色苷對運動損傷的影響

LDH 是糖酵解的關鍵酶，催化乳酸氧化成丙酮酸。CK 是促進能量代謝的酶，與細胞內(nèi)能量運轉密切相關。LDH、CK 常存在于肌肉組織中，其活性作為運動損傷程度的指標，反映機體對運動負荷的適應能力[23]。由圖3 可知，與安靜對照組比較，有氧運動組小鼠血清中CK 和LDH 活性無顯著性差異（P＞0.05）。與有氧運動組比較，模型組小鼠血清中CK和LDH 活性顯著升高了26.9%、42.2%（P＜0.05）。有氧運動的強度較低，機體的負荷較小，不易造成運動損傷。當過度運動時，對骨骼肌造成了損傷，使得細胞膜通透性增強，LDH 和CK 易滲透至血液中，并大量的積累。因此，有氧運動組小鼠血清中LDH 和CK 活力較低，模型組小鼠血清中CK 和LDH 活性則快速升高[25]。

圖3 桑葚花色苷對小鼠血清中LDH 和CK 活力的影響Fig.3 Effect of mulberry anthocyanin on the activity of LDH and CK in serum of mice

低、中、高劑量組小鼠的清中CK 和LDH 活性均依次降低，與桑葚花色苷存在劑量依賴關系。與模型組比較，中、高劑量組LDH 活性分別顯著降低了21.2%、28.9%，CK 活性分別顯著降低了22.9%、28.2%（P＜0.05）。高劑量組LDH、CK 活性與有氧運動組無顯著性差異（P＞0.05）。機體疲勞、運動損傷等與氧化應激密切相關，通過抗氧化、抗炎、抗凋亡等方式可改善氧化應激，減輕氧化損傷，預防疲勞[26]。桑葚花色苷具有良好的體內(nèi)外抗氧化活性，有助于改善機體氧化應激能力，預防心血管疾病、保護視網(wǎng)膜、保護神經(jīng)細胞等[27]。因此，劑量組肌肉組織損傷減輕，細胞膜通透性降低，滲透至血液中LDH 和CK的活性降低。綜合上述結果表明，桑葚花色苷可能是通過改善機體氧化應激能力，從而預防運動損傷，發(fā)揮抗疲勞的作用。

2.5 桑葚花色苷對氧化因子的影響

ROS 是一類有超強氧化性的自由基，易攻擊細胞膜、脂質、蛋白質和DNA 等，導致氧化應激損傷。因此，通過抑制ROS 的產(chǎn)生或積累，可改善氧化應激損傷，有利于緩解疲勞[16]。由圖4 可知，與安靜組比較，有氧運動組、模型組小鼠骨骼肌ROS 含量顯著升高（P＜0.05）。在運動過程中，肌肉組織的血流量增加，以滿足機體的氧氣消耗，會伴隨大量自由基的產(chǎn)生與清除。然而，當過度運動時，機體抗氧化和氧化系統(tǒng)失衡，從而使得模型組小鼠體內(nèi)ROS 大量堆積而顯著升高（P＜0.05），導致肌肉組織穩(wěn)態(tài)紊亂，造成氧化應激損傷和疲勞[16]。

圖4 桑葚花色苷對小鼠骨骼肌中ROS 含量的影響Fig.4 Effect of mulberry anthocyanin on the content of ROS in skeletal muscle of mice

低、中、高劑量組小鼠的骨骼肌ROS 含量依次降低，與桑葚花色苷存在劑量依賴關系。與模型組比較，低、中、高劑量組ROS 含量分別降低了20.6%、43.3%、54.4%，且存在顯著性差異（P＜0.05）。高劑量組ROS 含量與有氧運動組無顯著性差異（P＞0.05）。諸多桑葚花色苷抗氧化活性研究結果表明，桑葚花色苷可清除自由基，具有良好的抗氧化效果[9,28]。綜合上述結果表明，桑葚花色苷作為抗氧劑，可抑制體內(nèi)ROS 氧化因子的產(chǎn)生或積累，改善氧化應激，發(fā)揮抗疲勞的作用。

2.6 桑葚花色苷對氧化應激的影響

SOD 和GSH-Px 是機體內(nèi)重要的酶系抗氧化劑和自由基清清除劑，可催化自由基轉化為過氧化氫，阻斷自由基引發(fā)的組織損傷，從而發(fā)揮抗氧化功能[29]。MDA、8-OHdG 作為體內(nèi)氧化能力的標志物，是脂質、DNA 分別與自由基反應的產(chǎn)物[29]。由圖5可知，與安靜組小鼠相比，有氧運動組小鼠骨骼肌SOD 和GSH-Px 活性、MDA 和8-OHdG 含量無顯著性差異（P＞0.05）。與有氧運動組比較，模型組小鼠骨骼肌SOD、GSH-Px 活性顯著降低（P＜0.05），MDA 和8-OHdG 含量顯著升高（P＜0.05）。在運動過程中，機體內(nèi)產(chǎn)生并堆積了大量的自由基，同時調(diào)節(jié)體內(nèi)抗氧化體系活性，以改善機體的氧化應激能力，保護細胞組織[30]。因此，有氧運動組小鼠SOD、GSH-Px 活性顯著升高，MDA、8-OHdG 含量基本不變。然而，過度運動破壞了模型組小鼠體內(nèi)氧化平衡體系，消耗大量的SOD、GSH-Px 抗氧劑，使其活性降低。另外，大量自由基在體內(nèi)堆積，使得脂質、DNA 過氧化反應增加，對機體造成氧化應激損傷，模型組小鼠MDA、8-OHdG 含量升高[30]。

低、中、高劑量組小鼠的骨骼肌SOD、GSHPx 活性依次升高，MDA 和8-OHdG 含量依次降低，且與桑葚花色苷存在劑量依賴關系。與模型組比較，高劑量組小鼠SOD、GSH-Px 活性顯著升高了27.8%、51.4%（P＜0.05）；中、高劑量組MDA 含量分別顯著降低了26.3%、40.1%，8-OHdG 含量分別顯著降低了23.6%、52.5%（P＜0.05）。高劑量組MDA 和8-OHdG 含量與有氧運動組無顯著性差異（P＞0.05）。上述研究結果與百香果、胡蘿卜花色苷抗疲勞的研究結果一致[23-24]，桑葚花色苷作為良好的抗氧劑，有助于清除體內(nèi)自由基，阻止MDA 和8-OHdG 的生成，減小細胞氧化損傷程度，發(fā)揮抗疲勞作用[25]。同時，隨著桑葚花色苷劑量的增加，SOD 和GSH-Px 的消耗減少，維護了機體的穩(wěn)態(tài)平衡。因此，桑葚花色苷可通過清除自由基，減少脂質過氧化和DNA 損傷，提高骨骼肌SOD、GSH-Px 抗氧化活性，改善機體氧化應激損傷，發(fā)揮抗疲勞的作用。

2.7 桑葚花色苷對小鼠骨骼肌Nrf2 和HO-1 相對表達水平的影響

核因子E2 相關因子2（Nrf2）可激活下游多個抗氧化因子和GSH 氧化還原系統(tǒng)，是增強細胞抗氧化應激作用的調(diào)節(jié)因子，參與細胞物質與能量代謝、細胞氧化應激等，有助于緩解機體疲勞[30]。血紅素氧合酶1（HO-1）是抗炎、抗氧化、具有神經(jīng)保護作用的誘導酶，作為抗氧化因子，在抗氧化損傷中具有重要的作用[31]。因此，Nrf2、HO-1 是重要的抗疲勞分子靶點。由圖6 可知，與安靜組比較，有氧運動組小鼠骨骼肌Nrf2 和HO-1 mRNA 相對表達水平無顯著性差異（P＞0.05）。與有氧運動組比較，模型組小鼠骨骼肌Nrf2 和HO-1 mRNA 相對表達水平顯著降低（P＜0.05）。在非運動狀態(tài)下，Nrf2 常與其負調(diào)節(jié)因子Keap1 形成二聚體，從而抑制Nrf2 的表達。然而，在運動過程中，機體產(chǎn)生了大量的ROS，使得Keap1 結構加速解偶聯(lián)，從而刺激Nrf2 的轉移和表達，激活下游HO-1 相關的抗氧化應答過程，以清除ROS。Nrf2 和HO-1 表達的調(diào)節(jié)作用存在一定劑量效應，過度運動使機體抗氧化和氧化體系失衡；過量的ROS 加劇了細胞損傷或凋亡，一定程度抑制了Nrf2 和HO-1 mRNA 的表達[32]。因此，模型組小鼠Nrf2、HO-1mRNA 相對表達水平降低。

圖6 桑葚花色苷對小鼠骨骼肌Nrf2 和HO-1 mRNA相對表達水平的影響Fig.6 Effect of mulberry anthocyanin on the relative expression levels of Nrf2 and HO-1 mRNA in skeletal muscle of mice

低、中、高劑量組小鼠骨骼肌Nrf2 和HO-1 mRNA 相對表達水平含量依次升高，與桑葚花色苷存在劑量依賴關系。與模型組比較，低、中、高劑量組Nrf2 mRNA 相對表達水平分別顯著升高了73.3%、84.4%、113.3%（P＜0.05），HO-1 mRNA 分別顯著升高了29.5%、50.1%、61.4%（P＜0.05）?？赡茉蚴?，體內(nèi)ROS 刺激了Nrf2 的轉移和表達，激活了下游HO-1 相關的抗氧化應答過程。同時，桑葚花色苷作為良好的抗氧劑，有助于清除體內(nèi)自由基，減少細胞的氧化損傷，保護了細胞[25]。因此，劑量組小鼠Nrf2、HO-1 mRNA 相對表達水平升高。矢車菊素-3-O-葡萄糖苷可通過激活Nrf2/HO-1 信號通路保護ROS 介導的細胞損傷[33]；藍莓花青素可通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1 信號傳導改善視網(wǎng)膜氧化應激和炎癥[34]；花青素作為抗氧劑，通過PI3K/Akt/Nrf2/HO-1 途徑降低HT22 細胞中神經(jīng)毒性而保護神經(jīng)細胞[35]。諸多研究表明花色苷可通過激活Nrf2/HO-1 信號通路，增加Nrf2 和HO-1 蛋白表達，增強細胞抗氧化應激的能力，以保護細胞。綜合上述研究結果表明，桑葚花色苷可通過促進Nrf2/HO-1 的表達，增強機體抗氧化作用，改善氧化應激能力，發(fā)揮抗疲勞的作用機制。

3 結論

經(jīng)過大孔樹脂純化后，桑葚花色苷中C3G、P3G、D3G 含量達到9.1%、20.9%、7.6%，顯示出良好的抗氧化活性。隨著給藥時間的增加，桑葚花色苷表現(xiàn)出良好的抗疲勞作用。在末次給藥后，與模型組比較，低、中、高劑量組小鼠的游泳力竭時間分別延長了94.5%、125.6%、176.3%（P＜0.05）。血清和骨骼肌生化指標分析顯示，桑葚花色苷可改善體內(nèi)物質和能量代謝，減少Lac、BUN 等代謝物的堆積，降低LDH、CK 活性；并通過清除自由基，提高SOD 和GSH-Px 的活力，減少脂質過氧化和DNA 損傷，改善機體氧化應激損傷，提升運動耐力，從而發(fā)揮抗疲勞作用。其中，高劑量組BUN 濃度、LDH 和CK 活性、MDA 和8-OHdG 含量，與有氧運動組無顯著性差異（P＞0.05）。Nrf2/HO-1 mRNA 表達的增加，表明桑葚花色苷可通過調(diào)控Nrf2/HO-1 信號通路，改善氧化應激能力，增強機體抗氧化作用，以發(fā)揮抗疲勞的作用機制。以上研究初步確定了桑葚花色苷具有良好的抗疲勞作用，與其抗氧化能力、調(diào)控Nrf2/HO-1 信號通路的作用機制密切相關，為進一步深度開發(fā)桑葚資源及其應用提供了理論依據(jù)。然而，高純度桑葚花色苷單體的抗疲勞能力、具體的作用蛋白靶點仍需探索。