陽(yáng) 瑾，丁 宇，于呂健，范盈盈，劉峰娟，趙雪祺，焦子偉 ，王 成,

（1.伊犁師范大學(xué)生物與地理科學(xué)學(xué)院，新疆伊犁 835000；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部荒漠綠洲生態(tài)區(qū)特色農(nóng)產(chǎn)品功能營(yíng)養(yǎng)與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（部省共建），農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（烏魯木齊），新疆農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 830091；3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

以擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）為主的植物病原菌感染導(dǎo)致每年都會(huì)有大量的水果被侵蝕腐爛，造成大量的經(jīng)濟(jì)損失，大概有25%的農(nóng)產(chǎn)品會(huì)受到真菌毒素的污染，部分國(guó)家受污染比例可達(dá)到農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量的一半及以上[1]。擴(kuò)展青霉產(chǎn)生的展青霉素具有腸、肝、腎、免疫、基因毒性等[2]，對(duì)多種人體器官造成傷害，被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）認(rèn)定為“第三類可疑致癌物”[3]。早年就有研究者發(fā)現(xiàn)切除腐爛部位并不能完全去除展青霉素，擴(kuò)展青霉和毒素會(huì)向未腐爛的組織遷移，并且未腐爛組織中的毒素含量可能會(huì)超過(guò)最低限量[4]，展青霉素遷移遠(yuǎn)慢于擴(kuò)展青霉菌落的遷移[5]。根據(jù)毒素含量與菌落濃度之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系可以通過(guò)菌落濃度來(lái)反映毒素含量[6]。近年來(lái)越來(lái)越多研究者開(kāi)始利用qPCR 技術(shù)對(duì)擴(kuò)展青霉進(jìn)行檢測(cè)從而研究毒素含量。Tannous 等[7]創(chuàng)建了利用qPCR 檢測(cè)蘋果中擴(kuò)展青霉菌DNA 從而估計(jì)展青霉素含量的方法。Rodríguez 等[8]也利用SYBR Green和TaqMan 兩種方法進(jìn)行qPCR 技術(shù)檢測(cè)展青霉素含量。從控制展青霉素污染角度來(lái)說(shuō)對(duì)擴(kuò)展青霉菌活菌檢測(cè)具有重要意義。但普通的qPCR 技術(shù)并不能分辨出活菌和死菌的區(qū)別，極易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。

反壟斷法中縱向壟斷協(xié)議的解釋學(xué)澄清——兼評(píng)全國(guó)首例縱向壟斷協(xié)議行政訴訟案...........................................................................................吳佩乘 11.44

PMA 和疊氮溴化乙錠（Ethidium Monoazide Bromide，EMA）都屬于對(duì)DNA 有著高親和力的光敏DNA 染料[9]。PMA 可以選擇性穿過(guò)死菌破損細(xì)胞膜，在鎢燈強(qiáng)光照射下，PMA 的疊氮基團(tuán)生成的nitrene 基，在結(jié)合部位與DNA 中的碳?xì)溲蹑I結(jié)合生成穩(wěn)共價(jià)氮碳鍵，從而抑制了死菌DNA 擴(kuò)增，qPCR檢測(cè)中假陽(yáng)性信號(hào)的產(chǎn)生[10]。PMA 比EMA 多一個(gè)正點(diǎn)荷，更加溫和、更難進(jìn)入活菌細(xì)胞膜[11]，近年來(lái)研究者更傾向用PMA 結(jié)合qPCR 技術(shù)研究活菌檢測(cè)。目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于藥物活性檢測(cè)[12]、醫(yī)源及食源性病原菌檢測(cè)[13-14]、污水處理檢測(cè)[15]、植物病原菌檢測(cè)[16]等。對(duì)于利用PMA-qPCR 這一技術(shù)對(duì)植物病原菌進(jìn)行研究，已應(yīng)用于青枯菌（Pseudomonas solanacearum）[11]、十字花科黑斑病菌（Pseudomonas syringaepv.maculicola）[17]、梨火疫病菌（Erwinia amylovory）[9]、丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）[18]的活菌檢測(cè)等，但該技術(shù)對(duì)擴(kuò)展青霉菌活菌檢測(cè)及相關(guān)的研究較少。

因此，為了深入研究擴(kuò)展青霉菌活菌在蘋果上的遷移規(guī)律，本文將以產(chǎn)自新疆阿克蘇的紅富士蘋果為材料，人工接種擴(kuò)展青霉進(jìn)行常溫培養(yǎng)，改進(jìn)Crespo-Sempere 等[19]的PMA 處理方法，利用PMAqPCR 技術(shù)快速、準(zhǔn)確地對(duì)擴(kuò)展青霉活菌數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，為蘋果中擴(kuò)展青霉的防控提供了理論依據(jù)，為食品中擴(kuò)展青霉活菌檢測(cè)提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

擴(kuò)展青霉菌ACCC 31688 中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心；紅富士蘋果（Malus domesticaBorkh.CV.Red Fuji） 同一批次的成熟的大小相近、無(wú)創(chuàng)傷，新疆烏魯木齊市；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；PMA 染料 北京百瑞極生物科技有限公司；真菌DNA 提取試劑盒、CTAB 緩沖液、蛋白酶K 溶液、RNase A 溶液、DNA 提取液、核酸提取液 北京索萊寶公司；2×Taq PCR MasterMixⅡ、2×SuperReal PreMix Plus 天根生化科技（北京）有限公司；異丙醇 分析醇，天津永晟精細(xì)化工有限公司。

取10 mL 稀釋好的孢子懸浮液放入水浴鍋，99.9 ℃水浴30 min 進(jìn)行熱滅活處理。取1 mL 經(jīng)熱滅活處理的孢子懸浮液涂布于PDA 培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)72 h，驗(yàn)證滅活效果。PDA 培養(yǎng)基上無(wú)菌生長(zhǎng)則認(rèn)為已完全滅活，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 霉菌孢子懸浮液配制 無(wú)菌條件下，向已培養(yǎng)7 d 的擴(kuò)展青霉菌的PDA 培養(yǎng)基中加入10 mL無(wú)菌水，利用無(wú)菌涂布器刮下真菌孢子，四層紗布過(guò)濾，將濾液轉(zhuǎn)至50 mL 錐形瓶中，旋渦30 s，使孢子分布均勻后加入無(wú)菌水進(jìn)行梯度稀釋。采用血球計(jì)數(shù)板法計(jì)算孢子濃度，最終將孢子懸浮液稀釋至4.0×107CFU/mL。

生物安全柜ESCO 生命科學(xué)集團(tuán)；霉菌培養(yǎng)箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Thermo Fisher Scientific 離心機(jī) 德國(guó)賀利氏公司；PCR 儀（SureCycle 8800） 安捷倫科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（LightCycler? 96） 德國(guó)羅氏診斷有限公司。

2.2.2.1 藥劑拌種該病除選用上述技術(shù)原則外，還可用種子100kg，營(yíng)養(yǎng)液5kg，溶入58%甲霜靈可濕性粉劑300g，（營(yíng)養(yǎng)液可以用含微量元素葉面肥尿素、磷酸二氫鉀各100g代替）對(duì)種子均勻噴灑翻拌，悶種3h～4h，即可播種。有預(yù)防霜霉病和壯苗的雙重作用。

1.2.2 霉菌及蘋果樣品DNA 提取

1.2.2.1 霉菌DNA 提取 取500 μL 孢子懸浮液，12000 r/min 條件下離心2 min，棄上清，沉淀按照真菌DNA 提取試劑盒說(shuō)明書提取DNA。檢測(cè)前放入-20 ℃保存。

1.2.2.2 蘋果樣品DNA 提取 參考Crespo-Sempere 等[19]的方法，根據(jù)樣品略有改動(dòng)。取5 g 樣品（受擴(kuò)展青霉侵染的蘋果病斑）裝入50 mL 試管，加入5 mL 的磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS）。勻質(zhì)3 min，4 層紗布過(guò)濾。將濾液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000 r/min 離心10 min，棄去上清。沉淀重懸于1 mL PBS 緩沖液后進(jìn)行PMA 處理。PMA 處理后，12000 r/min 離心2 min，棄去上清。

在開(kāi)展施工安裝及施工后的模板拆除工作前，要讓工作人員參與安全技術(shù)交底中，申明施工操作中的各種規(guī)范，如要求工人持證件上崗，高空作業(yè)時(shí)做好安全措施，在危險(xiǎn)區(qū)域設(shè)置安全標(biāo)示等。

1.2.3.3 曝光時(shí)間優(yōu)化 分別添加PMA 溶液于500 μL 濃度為4.0×107CFU/mL 的熱滅活孢子懸浮液，充分混勻，獲得PMA 最終濃度為10 μg/mL，隨后置于黑暗處孵育5 min，設(shè)置曝光時(shí)間分別為0、5、10、15 和20 min。之后步驟按1.2.3.1 進(jìn)行。

目前高師院校創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)的教師多由本校教師擔(dān)任，絕大多數(shù)教師不具備創(chuàng)業(yè)能力，創(chuàng)新意識(shí)也不夠強(qiáng)，對(duì)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)的理解有待進(jìn)一步深化，他們?cè)趧?chuàng)新創(chuàng)業(yè)課程教學(xué)中，主要偏重于創(chuàng)業(yè)理論的闡述、創(chuàng)業(yè)案例的分析，而未將注意力集中在師范生創(chuàng)新意識(shí)的培育上。此外，絕大多數(shù)高師院校教師認(rèn)為，師范生的創(chuàng)新意識(shí)的培育是創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)課程教師的任務(wù)。殊不知每門課程的教學(xué)都有責(zé)任去培育師范生的創(chuàng)新意識(shí)。全體高師院校的教師要轉(zhuǎn)變觀念，適應(yīng)新時(shí)代創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)發(fā)展的需求，除了要傳授師范生的知識(shí)、訓(xùn)練師范生的技能、培育師范生的職業(yè)情懷外，還要在課程教學(xué)中注重滲透培育師范生的創(chuàng)新意識(shí)。

1.2.3 PMA 處理?xiàng)l件優(yōu)化

1.2.3.1 PMA 濃度優(yōu)化 稱取1 mg PMA 加入1 mL的無(wú)菌水，制備濃度為2 mmol/L 的PMA 溶液，4 ℃儲(chǔ)存。取500 μL 濃度為4.0×107CFU/mL 的熱滅活孢子懸浮液，加入不同體積的PMA 溶液，使最終每管的PMA 濃度分別為0、5、10、15、20 和 25 μg/mL。充分混勻后黑暗孵育20 min，然后將試管放置冰上在鎢燈強(qiáng)光下照射10 min。12000 r/min 離心 2 min，棄上清，取沉淀提取孢子DNA，具體步驟同1.2.2.1。所提DNA 按照1.2.5 中的反應(yīng)體系及條件進(jìn)行qPCR 檢測(cè)，獲得循環(huán)閾值（Cycle Threshold，Ct 值），根據(jù)Ct 值變化來(lái)研究能夠抑制死菌DNA 擴(kuò)增的PMA 最小濃度。同樣方法處理活孢子懸浮液，研究不影響活菌DNA 擴(kuò)增的PMA 最大濃度。

(2)第二個(gè)階段：從“校內(nèi)實(shí)踐環(huán)境”到“企業(yè)財(cái)務(wù)工作環(huán)境”。新經(jīng)濟(jì)環(huán)境對(duì)會(huì)計(jì)業(yè)務(wù)影響較大，如營(yíng)改增等政策變化、新會(huì)計(jì)政策制訂和執(zhí)行都會(huì)影響到《中級(jí)財(cái)務(wù)會(huì)計(jì)》課程內(nèi)容。所以要了解企業(yè)最新的經(jīng)濟(jì)業(yè)務(wù)，使校內(nèi)實(shí)踐環(huán)境與企業(yè)財(cái)務(wù)工作環(huán)境結(jié)合更為密切。通過(guò)“引進(jìn)來(lái)”和“走出去”的方式，使企業(yè)專家、學(xué)校任課老師在實(shí)踐環(huán)節(jié)得到有效融合，也寒暑假社會(huì)實(shí)踐、頂崗實(shí)習(xí)等途徑來(lái)檢驗(yàn)校內(nèi)實(shí)踐部分有效性，對(duì)實(shí)際崗位操作中出現(xiàn)的新趨勢(shì)、新內(nèi)容保持同步更新，防止校內(nèi)實(shí)踐教學(xué)內(nèi)容過(guò)于陳舊。

1.2.3.2 黑暗孵育時(shí)間優(yōu)化 分別添加PMA 溶液于500 μL 濃度為4.0×107CFU/mL 的熱滅活孢子懸浮液，充分混勻，使PMA 最終濃度為10 μg/mL，隨后置于黑暗處孵育。設(shè)置孵育時(shí)間分別為5、10、15、20 和25 min，黑暗孵育后放置冰上在鎢燈下照射10 min，之后步驟按1.2.3.1 進(jìn)行。

參考Tannous 等[7]的方法，根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件略做修改，提取沉淀DNA。將沉淀重懸于經(jīng)95 ℃預(yù)熱100 μL 無(wú)菌水中并在冰上放置10 min。加入500 μL CTAB 緩沖液，10 μL 蛋白酶K 溶液，65 ℃水浴1 h，4 ℃條件下13000 r/min 離心10 min。吸取上清，加等體積的DNA 提取液（酚/氯仿/異戊醇25:24:1）靜置5 min，4 ℃條件下1000 r/min 離心20 min。吸取上清，加入10 μL RNase A 溶液（10 mg/mL），37 ℃恒溫水浴1 h。水浴后，加等體積的核酸提取液（氯仿/異戊醇24:1），4 ℃條件下13000 r/min 離心5 min。取上清液用等體積的異丙醇-20 ℃沉淀過(guò)夜。4 ℃條件下13000 r/min 離心20 min，棄去上清，沉淀中加入500 μL 的75%乙醇進(jìn)行洗脫，12000 r/min 離心5 min，重復(fù)洗脫2 次。棄上清，加入室溫干燥5～10 min，加入30 μL 的dd H2O，-20 ℃保存。

1.2.4 引物選擇及驗(yàn)證 實(shí)驗(yàn)所用的4 種引物均參考已發(fā)表文獻(xiàn)，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，詳情見(jiàn)表1。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 參考Crespo-Sempere 等[19]的標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法，略有改動(dòng)。挑選無(wú)病害的蘋果，用清水清洗，75%酒精消毒，晾干后打漿。取5 g樣品裝入50 mL 試管，加入5 mL 的PBS 緩沖液。配制106CFU/mL 的擴(kuò)展青霉孢子懸浮液，加入無(wú)菌水梯度稀釋至濃度為105、104、103CFU/mL。加入孢子懸浮液，使樣品中孢子最終濃度達(dá)到105、104、103、102CFU/mL。按照1.2.2.2 提取DNA，通過(guò)qPCR測(cè)定對(duì)應(yīng)的Ct 值，反應(yīng)體系參照1.2.5，重復(fù)3 次。建立菌落濃度（log10CFU/mL）與Ct 值之間的線性關(guān)系，并通過(guò)公式E=10-1/s-1 計(jì)算擴(kuò)增效率，其中s 為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

1.2.7 人工染菌樣品活菌檢測(cè) 用清水清洗蘋果晾干后，用75%酒精擦拭表面。用滅菌過(guò)的移液槍頭在每個(gè)蘋果赤道部位對(duì)稱刺2 個(gè)直徑2～3 mm、深度5～7 mm 的傷口，每個(gè)傷口接種10 μL 孢子懸浮液（1.0×105CFU/mL），待孢子懸浮液晾干后，放入經(jīng)紫外滅菌的紙箱中。在室溫條件下培養(yǎng)3 d 后，以病斑為中心，分別取外擴(kuò)0.5、1、2 cm 處蘋果組織為樣品（如圖1 所示）。取1 g 樣品參照尉冬梅等[23]的方法進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。

以所提的擴(kuò)展青霉菌DNA 作為模板，各引物經(jīng)PCR 擴(kuò)增后，用1%瓊脂糖凝膠電泳法驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的大小及引物的特異性，PCR 反應(yīng)體系詳情見(jiàn)表2。PCR 總共35 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94 ℃預(yù)熱 4 min，94 ℃變性30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃延伸45 s，72 ℃最后延伸10 min。

預(yù)制裝配式混凝土結(jié)構(gòu)有多種形式，如剪力墻結(jié)構(gòu)，框架結(jié)構(gòu)，框架剪力墻結(jié)構(gòu)和部分框架剪力墻結(jié)構(gòu)。由于預(yù)制裝配式結(jié)構(gòu)的預(yù)制構(gòu)件全部通過(guò)連接節(jié)點(diǎn)連接，所以混凝土結(jié)構(gòu)在大范圍內(nèi)尚未廣泛使用。與傳統(tǒng)建筑方法相比，預(yù)制建筑物具有更多的連接界面和接縫，而裝配式混凝土結(jié)構(gòu)中的節(jié)點(diǎn)是裝配式建筑的薄弱環(huán)節(jié)，在連接節(jié)點(diǎn)的處理問(wèn)題上，國(guó)內(nèi)的技術(shù)手段目前并不是很成熟。但裝配式建筑結(jié)構(gòu)在環(huán)保、節(jié)能和施工上與現(xiàn)澆相比優(yōu)點(diǎn)比較突出。

普通工頻電機(jī)在正常運(yùn)行時(shí)產(chǎn)生的軸電流大多是由于磁路不對(duì)稱，主要表現(xiàn)為低頻循環(huán)電流。變頻電機(jī)會(huì)額外增加軸電流的來(lái)源，主要是受變頻器共模電壓的影響，表現(xiàn)為高頻循環(huán)電流、容性共模電流及放電電流、軸與機(jī)座電位差產(chǎn)生的脈沖式容性電流。在大型電機(jī)設(shè)計(jì)時(shí)，需盡量減少磁路的不對(duì)稱，從源頭上遏制軸電流的產(chǎn)生。同時(shí)，當(dāng)機(jī)組中含有電機(jī)尤其是變頻電機(jī)時(shí)，需要特別注意整個(gè)機(jī)組對(duì)軸電流的預(yù)防措施，這樣才能保證機(jī)組平穩(wěn)、可靠、安全運(yùn)行。

1.2.5 擴(kuò)展青霉菌熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn) 選取實(shí)驗(yàn)1.2.4 選擇出特異性最好的引物按照表3 中的體系用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。熱循環(huán)條件為：95 ℃作用3 min，40 個(gè)循環(huán)95 ℃作用20 s，65 ℃作用20 s（在此期間測(cè)量熒光），57～95 ℃繪制熔解曲線，升溫速率為1 ℃/min。

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用OriginPro 2019 作圖，Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，IBM SPSS Statistics 23 軟件進(jìn)行單因素ANOVA 檢驗(yàn)及獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析差異顯著性。

圖1 蘋果取樣示意圖Fig.1 Sampling diagram of apple

冰浴研磨后，稱取5g 樣品裝入50 mL 試管，加入5 mL PBS 緩沖液。勻質(zhì)3 min，4 層紗布過(guò)濾。將濾液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000 r/min 離心10 min，棄去上清。沉淀中加入1 mL PBS 緩沖液，按照優(yōu)化后的PMA 處理?xiàng)l件進(jìn)行處理。按照1.2.2.2 的方法提取樣品DNA 后，進(jìn)行qPCR 反應(yīng)。反應(yīng)條件及體系同1.2.5。所有DNA 樣品在qPCR 檢測(cè)之前都經(jīng)過(guò)常規(guī)PCR 和凝膠電泳檢測(cè)，以防后期因蘋果DNA樣品問(wèn)題出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

基于以上分析，廣西大學(xué)行健文理學(xué)院專創(chuàng)融合的市場(chǎng)營(yíng)銷專業(yè)師資隊(duì)伍的建設(shè)已有較好的基礎(chǔ)，未來(lái)應(yīng)有效利用面臨的機(jī)遇充分發(fā)揮挖掘現(xiàn)有優(yōu)勢(shì)、彌補(bǔ)不足，同時(shí)盡力以優(yōu)勢(shì)去迎接挑戰(zhàn)。以科學(xué)發(fā)展觀主動(dòng)適應(yīng)經(jīng)濟(jì)新常態(tài)發(fā)展、區(qū)域經(jīng)濟(jì)、產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)型升級(jí)的需求，堅(jiān)持復(fù)合應(yīng)用型市場(chǎng)營(yíng)銷人才培養(yǎng)的辦學(xué)理念，深化有地域特色的專創(chuàng)融合的師資隊(duì)伍的打造。

2 結(jié)果與分析

2.1 PMA 條件優(yōu)化

2.1.1 PMA 濃度優(yōu)化 添加不同濃度的PMA 對(duì)擴(kuò)展青霉熱滅活孢子懸浮液和活孢子懸浮液進(jìn)行處理，研究不同濃度PMA 對(duì)擴(kuò)展青霉熱滅活孢子和活孢子qPCR 擴(kuò)增的影響。圖2 結(jié)果顯示使用PMA 溶液能夠明顯抑制熱滅活擴(kuò)展青霉的DNA 擴(kuò)增，當(dāng)PMA 濃度=0 時(shí)，Ct 值與PMA 處理組Ct 值具有顯著差異（P＜0.05）；當(dāng)PMA 濃度＜10 μg/mL 時(shí)，Ct 值隨著PMA 濃度增加而增大，這說(shuō)明低濃度的PMA不能完全抑制熱滅活孢子DNA 擴(kuò)增；當(dāng)PMA 濃度＞10 μg/mL 時(shí)，Ct 值不存在顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明10 μg/mL 的PMA 能完全與熱滅活孢子DNA 結(jié)合，并完全抑制熱滅活孢子DNA 擴(kuò)增。不同濃度的PMA 對(duì)活孢子進(jìn)行處理，對(duì)活孢子qPCR 擴(kuò)增無(wú)顯著抑制作用（P＞0.05）。故選10 μg/mL 為最佳PMA處理濃度。

圖2 不同濃度PMA 處理對(duì)擴(kuò)展青霉熱滅活及活孢子qPCR 擴(kuò)增的影響Fig.2 Effects of different concentrations of PMA treatment on the qPCR amplification of Penicillium expansum dead spores and live spores

2.1.2 黑暗孵育時(shí)間優(yōu)化 如圖3 所示，黑暗孵育處理5、10、15、20 和25 min 的Ct 值無(wú)顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明黑暗孵育5 min 時(shí)PMA 就能夠完全與熱滅活孢子DNA 結(jié)合，抑制熱滅活孢子DNA 的擴(kuò)增；同時(shí)不同黑暗孵育處理，對(duì)活孢子DNA 擴(kuò)增并無(wú)顯著抑制作用（P＞0.05），說(shuō)明黑暗處理5～25 min均不會(huì)對(duì)活孢子產(chǎn)生毒性，且不會(huì)影響活孢子DNA的擴(kuò)增，黑暗孵育5 min 處理能夠抑制熱滅活孢子DNA 的擴(kuò)增，但不影響活孢子DNA 的擴(kuò)增，故選5 min 為最佳黑暗孵育時(shí)間。

3)γCa/γCl系數(shù)。由表3的γCa/γCl系數(shù)結(jié)果可知，所有的水樣的γCa/γCl都較大。充分說(shuō)明了榆林市礦區(qū)第四系潛水含水層水動(dòng)力條件較好，更新循環(huán)較好，導(dǎo)致Cl-含量相對(duì)較低。

圖3 不同黑暗孵育時(shí)間處理對(duì)擴(kuò)展青霉熱滅活及活孢子qPCR 擴(kuò)增的影響Fig.3 Effects of different dark incubation time treatments on the qPCR amplification of Penicillium expansum dead and live spores

2.1.3 曝光時(shí)間優(yōu)化 如圖4 所示，使用PMA 對(duì)擴(kuò)展青霉熱滅活孢子進(jìn)行處理，曝光時(shí)間＜10 min 時(shí)，Ct 值會(huì)隨著曝光時(shí)間的增加而增大，說(shuō)明不足的曝光時(shí)間，不能使殘留的PMA 充分光解，從而不能完全抑制熱滅活孢子DNA 擴(kuò)增；當(dāng)曝光時(shí)間＞10 min時(shí)，Ct 值無(wú)顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明曝光10 min 就能夠使殘留的PMA 充分光解。使用PMA 處理擴(kuò)展青霉活菌處理，不同的曝光時(shí)間組的Ct 值無(wú)顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明不同的曝光時(shí)間并不影響活孢子DNA 擴(kuò)增。故選10 min 為最佳曝光時(shí)間。

圖4 不同曝光時(shí)間處理對(duì)擴(kuò)展青霉熱滅活及活孢子qPCR 擴(kuò)增的影響Fig.4 Effects of different exposure time treatments on qPCR amplification of Penicillium expansum dead and live spores

本研究最終發(fā)現(xiàn)10 μg/mL 為PMA 最佳濃度，5 min 為最佳黑暗孵育時(shí)間，10 min 為最佳曝光時(shí)間，與于璇等[17]設(shè)計(jì)檢測(cè)十字花科黑斑病原菌的最佳處理?xiàng)l件一致，與王帥等[11]建立的青枯菌PMAqPCR 檢測(cè)的最佳處理?xiàng)l件（PMA 濃度為15 ng/μL、黑暗孵育處理10 min、曝光處理5 min）不同。兩種方法的處理?xiàng)l件不同可能是菌種品類不同、PMA 產(chǎn)品不同、鎢燈型號(hào)不同所致[9]。

2.2 引物特異性

通過(guò)對(duì)各引物PCR 擴(kuò)增、凝膠電泳驗(yàn)證，結(jié)果（圖5）顯示Pexp-patF引物擴(kuò)增出的片段大小與Tannous 等[7]方法中擴(kuò)增片段大小一致，為92 bp，且其只產(chǎn)生一條帶，并無(wú)引物二聚體的存在，與本實(shí)驗(yàn)所用菌株基因特異性結(jié)合，特異性最強(qiáng)，而PG、POL、HHJ等3 個(gè)引物擴(kuò)增產(chǎn)物為多個(gè)條帶，另外，對(duì)Pexp-patF進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增，觀察反應(yīng)熔解曲線在熔解溫度（Melting Temperature，Tm）為87.4 ℃時(shí)有單一的熔解峰，無(wú)引物二聚體和非特異性出現(xiàn)（圖6），因此，Pexp-patF可以用于后期PMA-qPCR實(shí)驗(yàn)。Pexp-patF是Tannous 等[7]通過(guò)展青霉素合成調(diào)控基因PatF所設(shè)計(jì)，PatF基因是調(diào)控新棒曲霉素合成酶的基因，展青霉素合成的中間物質(zhì)葉點(diǎn)霉素在新棒曲霉素合成酶作用下會(huì)生成新棒曲霉素，新棒曲霉素在乙醇脫氫酶、葡萄糖-甲醇-膽堿氧化還原酶的作用下最終轉(zhuǎn)化為展青霉素[24]，這可能是PexppatF能夠與擴(kuò)展青霉基因結(jié)合、且特異性良好的原因。PG引物實(shí)驗(yàn)所用菌株是從腐爛柑橘中分離，POL菌株來(lái)源于加拿大國(guó)家食品安全研究所，HHJ菌株來(lái)源于中國(guó)微生物中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心中分離均與該實(shí)驗(yàn)所用菌株不同。PG、POL、HHJ引物沒(méi)有跟本實(shí)驗(yàn)所用擴(kuò)展青霉基因特異性結(jié)合可能與引物設(shè)計(jì)所用擴(kuò)展青霉的菌株與本實(shí)驗(yàn)不同所致。以后的引物設(shè)計(jì)中，可選擇菌種的合成代謝物基因來(lái)設(shè)計(jì)引物，從而設(shè)計(jì)出具有更高的特異性的引物用于qPCR 檢測(cè)中，能夠減少假陽(yáng)性結(jié)果的產(chǎn)生，并提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

圖5 4 對(duì)引物qPCR 擴(kuò)增擴(kuò)展青霉DNA 結(jié)果Fig.5 qPCR amplification electrophoresis results by 4 pairs of primers with P. expansum DNA

圖6 擴(kuò)展青霉DNA 與Pexp-patF qPCR 反應(yīng)熔解曲線Fig.6 Melting curve of P. expansum DNA reaction with Pexp-patF qPCR

2.3 PMA-qPCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限的評(píng)價(jià)

利用擴(kuò)展青霉孢子懸浮液梯度稀釋進(jìn)行PMAqPCR 擴(kuò)增，菌落濃度與Ct 值的相關(guān)性如圖7 所示。兩者之間具有良好的線性相關(guān)關(guān)系，y=-2.023x+35.925，R2=0.9948，標(biāo)準(zhǔn)曲線的重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。經(jīng)計(jì)算PMA-qPCR 擴(kuò)增效率（E）為90%。檢測(cè)限（Limit of Detection，LOD）通過(guò)公式Ct（LOD）=Ct（空白）–3 計(jì)算[25]，為102.6CFU/mL。該檢測(cè)限比王銀環(huán)等[26]利用PMA-qPCR 對(duì)地衣芽孢桿菌活菌制品中金黃色葡萄球菌最低檢測(cè)限（104CFU/mL）低，與Crespo-Sempere 等[19]建立的PMA-qPCR 檢測(cè)人工接種番茄樣品中鏈格孢菌檢出限（102CFU/g）類似。與Frisch 等[27]優(yōu)化的一種環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)擴(kuò)展青霉的方法的檢測(cè)下限（103CFU/mL）相比較，本研究采用的PMA-qPCR 檢測(cè)擴(kuò)展青霉檢出限更低，具有更高的靈敏度。

圖7 PMA-qPCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 PMA-qPCR standard curve

2.4 人工染菌蘋果樣品活菌檢測(cè)

對(duì)人工接種擴(kuò)展青霉蘋果樣品進(jìn)行PMA-qPCR檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算人工染菌蘋果樣品中擴(kuò)展青霉活菌數(shù)。結(jié)果如表4 和圖8 所示，PMA-qPCR 檢測(cè)出人工污染3 d 后病斑處擴(kuò)展青霉活菌數(shù)已達(dá)到1.61×106CFU/g，平板菌落計(jì)數(shù)按照國(guó)標(biāo)進(jìn)行計(jì)數(shù)[28]結(jié)果為1.4×106CFU/g。距離病斑0.5、1 cm 處，PMA-qPCR 檢測(cè)出結(jié)果及平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)出活菌。這與Wei 等[5]利用平板菌落計(jì)數(shù)方法發(fā)現(xiàn)當(dāng)病斑直徑為1 cm 時(shí)仍可在距病斑2 cm 處檢測(cè)出擴(kuò)展青霉活菌類似，這結(jié)果再次驗(yàn)證了擴(kuò)展青霉菌會(huì)向未腐爛組織遷移。距離病斑2 cm 處提取的DNA 未檢測(cè)出熒光信號(hào)，含量低于最低檢測(cè)線，同時(shí)平板菌落計(jì)數(shù)法結(jié)果小于10。兩者方法結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，無(wú)顯著差異，這一發(fā)現(xiàn)與Dias 等[29]的結(jié)果一致，這證明該本實(shí)驗(yàn)方法結(jié)果可靠，可利用PMA-qPCR來(lái)檢測(cè)定量擴(kuò)展青霉活菌。在實(shí)際操作過(guò)程中，PMA-qPCR 具有顯著的優(yōu)勢(shì)。傳統(tǒng)的平板菌落計(jì)數(shù)需將樣品稀釋液與未凝固培養(yǎng)基混合均勻后，凝固倒置培養(yǎng)。若培養(yǎng)基溫度過(guò)高會(huì)燙死原本活的孢子，從而影響結(jié)果。除此之外，樣品的破碎不均勻、環(huán)境污染都會(huì)影響平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果，然而利用PMAqPCR 技術(shù)檢測(cè)則會(huì)很好地避免這些影響因素。傳統(tǒng)的平板菌落計(jì)數(shù)法需花費(fèi)3～4 d 進(jìn)行菌落培養(yǎng)，而PMA-qPCR 僅需花1 d 時(shí)間便可得到準(zhǔn)確結(jié)果。與平板菌落計(jì)數(shù)這一傳統(tǒng)活菌檢測(cè)手段相比PMAqPCR 檢測(cè)更便捷，且具有高度敏感性和特異性[30]。

圖8 人工染菌蘋果樣品PMA-qPCR 檢測(cè)結(jié)果Fig.8 PMA-qPCR detection results of artificially infected apple samples

表4 人工染菌樣品 PMA-qPCR 結(jié)果與平板法計(jì)數(shù)比較Table 4 Comparison of PMA-qPCR results and plate counts results of artificially infected samples

3 結(jié)論

PMA-qPCR 能夠彌補(bǔ)PCR、qPCR 不能檢測(cè)活菌的缺陷，同時(shí)比傳統(tǒng)平板菌落計(jì)數(shù)方法更快捷，且具有特異性。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)篩選特異引物并優(yōu)化PMA 的處理?xiàng)l件，最終建立了以10 μg/mL PMA、黑暗孵育5 min、曝光處理10 min 為最優(yōu)處理?xiàng)l件的PMA-qPCR 檢測(cè)擴(kuò)展青霉活菌方法，該方法具有較高的靈敏性和可靠性，能夠快速檢測(cè)出樣品中的擴(kuò)展青霉活菌數(shù)，最低檢測(cè)限為102.6CFU/mL。將其應(yīng)用到人工染菌樣品活菌檢測(cè)，其結(jié)果與傳統(tǒng)的平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果無(wú)明顯差異，并且在未腐爛的蘋果組織中發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展青霉活菌。未來(lái)將該方法應(yīng)用于食品加工檢測(cè)中，可進(jìn)一步降低人們暴露在展青霉素的潛在危險(xiǎn)，為擴(kuò)展青霉防控提供一種新的技術(shù)支持。但本研究中樣品DNA 提取步驟較為繁瑣，花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，后期可優(yōu)化樣品DNA 提取方法，從而提高PMA-qPCR 檢測(cè)擴(kuò)展青霉活菌的便捷性。