陳 偲，張 明，付竹賢，王淑敏，羅 璠1,,

（1.西南民族大學(xué)青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610041；2.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川成都 610041；3.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川成都 610041）

乳酸菌和酵母菌是發(fā)酵產(chǎn)品中發(fā)揮重要作用的微生物類群，它們通過相互作用，共同發(fā)酵促成發(fā)酵食品成熟，提高揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，改善感官評(píng)價(jià)[1]，增加發(fā)酵食物不飽和脂肪酸、促進(jìn)消化、增加食欲等[2]。這種天然混合發(fā)酵體系在傳統(tǒng)食品發(fā)酵中廣泛存在，例如酸面團(tuán)[1]、泡菜[2]、傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬[3]、傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶[4]、葡萄酒[5]等。在食品工業(yè)生產(chǎn)中也多有應(yīng)用，利用乳酸菌和酵母菌發(fā)酵飼料[6]、蘋果汁[7]、雜糧面包[8]、富麩饅頭[9]等。但乳酸菌和酵母菌相互作用研究表明，在共培養(yǎng)體系中既存在協(xié)同（互促）作用，也存在拮抗（互抑）作用[10]。如Xu 等[11]在水開菲爾中發(fā)現(xiàn)霍爾迪乳酸桿菌（Lactobacillus hordei）和釀酒酵母（Sacchromyces cerevisiae）通過代謝產(chǎn)物的交換促進(jìn)各自的生長。Branco 等[12]通過質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)釀酒酵母細(xì)胞凋亡可產(chǎn)生抗微生物肽（antimicrobial peptides，AMPs），并對(duì)葡萄酒中的乳酸菌等產(chǎn)生抑制作用[13]。Carbonetto 等[14]通過面團(tuán)的共培養(yǎng)發(fā)酵發(fā)現(xiàn)乳酸菌的存在阻礙了酵母菌的生長，在碳代謝過程中表現(xiàn)出潛在的競爭關(guān)系。

在乳酸菌與酵母菌混合發(fā)酵體系中，當(dāng)菌株間作用為相互促進(jìn)時(shí)，可提高發(fā)酵效率并獲得更為豐富的代謝產(chǎn)物，菌株之間的良性互動(dòng)也有益于提升發(fā)酵食品的品質(zhì)[15]。但乳酸菌與酵母菌之間的互作關(guān)系，也可能表現(xiàn)為營養(yǎng)競爭、相互抑制的拮抗作用，影響最終發(fā)酵效果[16]。因此在乳酸菌與酵母菌混合發(fā)酵應(yīng)用前，應(yīng)深入分析復(fù)配菌組間的互作關(guān)系，使發(fā)酵應(yīng)用效果最佳化。

泡菜口感脆爽，風(fēng)味獨(dú)特，是主要的蔬菜發(fā)酵產(chǎn)品。泡菜發(fā)酵過程中，乳酸菌起主導(dǎo)作用并含有酵母菌輔助發(fā)酵，其熟制加工方式為冷加工，對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)有較好保留，同時(shí)富含益生菌，使其具有開胃、健脾、促消化、降低膽固醇、抗動(dòng)脈硬化、抗肥胖作用等功效[17-18]，目前國內(nèi)發(fā)酵泡菜中微生物研究多集中于菌群分布及自然發(fā)酵泡菜與人工接種發(fā)酵泡菜發(fā)酵效果比較[19-20]，篩選復(fù)配優(yōu)勢(shì)菌株組合再進(jìn)行泡菜人工接種發(fā)酵的研究鮮有報(bào)道。基于此，本研究擬分析不同組合乳酸菌和酵母菌復(fù)配的相互關(guān)系，篩選菌株組合，將其應(yīng)用在泡菜發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，為篩選發(fā)酵性能較強(qiáng)的菌株組合及人工接種發(fā)酵泡菜的工業(yè)化生產(chǎn)，提供一定的理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)菌株 信息見表1，采用傳統(tǒng)分離純化方法從自然發(fā)酵泡菜及酸乳樣品中，分離得到13 株乳酸菌和酵母菌，通過形態(tài)學(xué)特征、生理生化實(shí)驗(yàn)、16S rDNA 和26S rDNA 序列分析，對(duì)菌株種屬進(jìn)行鑒定，前期實(shí)驗(yàn)表明，同類型所選菌株生長速度與產(chǎn)酸性能較接近[21]；新鮮大白菜（Brassica rapa pekinensis）、泡菜鹽 均為市售；MRS 培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，YPD）、改良查爾莫斯培養(yǎng)基（Modified Chalmers Agar，MC），孟加拉紅培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；水葡萄糖 分析純，天津奧普升有限公司；鹽酸 分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司；亞甲藍(lán)、硫酸銅、冰乙酸、氫氧化鈉、乙酸鋅、酚酞、亞鐵氰化鉀、正辛醇、硫酸鋅、氨水、活性炭、酒石酸鉀鈉均為分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司。

表1 實(shí)驗(yàn)菌種信息Table 1 Experimental strains information

ST16R 高速冷凍離心機(jī) 賽默飛世爾科技有限公司；GH6000 電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津泰斯特設(shè)備有限公司；SHKE6000-8CE 恒溫振蕩搖床 美國Thermo Scientific 有限公司；紫外可見分光光度計(jì)UV1900上海佑科儀器；ELX-800 酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司；R40-IIB2 超凈工作臺(tái) 中國青島海爾有限公司；GI54DW 高壓蒸汽滅菌鍋 廈門致微儀器有限公司；雷磁pHS-25 酸度計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；WY-01 電熱爐 浙江偉遠(yuǎn)工貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 無菌代謝產(chǎn)物制備 參照劉敏敏等[22]方法并改進(jìn)。將活化好的乳酸菌（1×108CFU/mL）以1%的接種量接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h；將活化好的酵母菌（4×106CFU/mL）以1%的接種量接種于YPD 液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h。發(fā)酵液在6000 r/min 離心15 min，取上清，用1 mol/L 的NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 至6.0，0.22 μm 濾膜過濾除菌，得無菌代謝產(chǎn)物，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌種初篩 將制備好的酵母菌代謝產(chǎn)物按體積分?jǐn)?shù)30%加入到MRS 液體培養(yǎng)基中，以同樣比例在MRS 液體培養(yǎng)基中添加pH6.0 的YPD 液體培養(yǎng)基為對(duì)照組，以1%接種量接種乳酸菌（1×108CFU/mL），30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，振蕩混勻在600 nm處測(cè)定吸光度。

將制備好的乳酸菌代謝產(chǎn)物按體積分?jǐn)?shù)30%加入到Y(jié)PD 液體培養(yǎng)基中，以同樣比例在YPD 液體培養(yǎng)基中添加pH6.0 的MRS 液體培養(yǎng)基作為對(duì)照組，以1%接種量接種酵母菌（4×106CFU/mL），30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，振蕩混勻后在 600 nm 處測(cè)定吸光度。選取乳酸菌和酵母菌菌體濃度較對(duì)照差異顯著組吸光度顯著大于對(duì)照組，P＜0.05）作為復(fù)篩的出發(fā)菌組。

1.2.3 菌種復(fù)篩 以篩選出來的促進(jìn)生長的菌組作為研究對(duì)象。將乳酸菌（1×108CFU/mL）和酵母菌（4×106CFU/mL）以1%的接種量接種在MRS 液體培養(yǎng)基中30 ℃靜置共培養(yǎng)12 h 后，將共培養(yǎng)菌液用無菌生理鹽水按10 倍進(jìn)行梯度稀釋，取適當(dāng)稀釋度的發(fā)酵液進(jìn)行平板涂布法計(jì)數(shù)，使用改良MC 培養(yǎng)基平板測(cè)定乳酸菌活菌數(shù)，使用孟加拉紅培養(yǎng)基平板測(cè)定酵母活菌數(shù)，于30 ℃靜置培養(yǎng)48 h，每個(gè)稀釋度做3 個(gè)重復(fù)，取菌落數(shù)在30～300 的平板計(jì)數(shù)，取平均值。

1.2.4 培養(yǎng)方式的確定 將酵母菌（4×106CFU/mL）以1%的接種量接種于YPD 液體培養(yǎng)基中，于30 ℃下分別進(jìn)行靜置與振蕩兩種培養(yǎng)方式培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液以6000 r/min 離心15 min，取上清，0.22 μm 濾膜過濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆?。MRS 液體培養(yǎng)基中添加體積分?jǐn)?shù)為30%的兩種不同培養(yǎng)方式的酵母菌無菌代謝產(chǎn)物為實(shí)驗(yàn)組；添加等量的YPD 液體培養(yǎng)基作為對(duì)照組。將植物乳桿菌（1×108CFU/mL）以1%接種量接種在上述液體培養(yǎng)基，4、8、12、16、20、24 h 測(cè)定菌液在600 nm 處的吸光度。

1.2.5 接種順序的確定 將乳酸菌（1×108CFU/mL）以1%接種量接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)12 h，然后接種1%的酵母菌（4×106CFU/mL），共培養(yǎng)至24 h；以乳酸菌單菌于第0 h 和酵母菌單菌于第12 h 以同接種量接種至MRS 液體培養(yǎng)基為對(duì)照。每隔4 h 使用pH 計(jì)測(cè)定pH，使用改良MC 培養(yǎng)基平板測(cè)定乳酸菌活菌數(shù)，使用孟加拉紅培養(yǎng)基平板測(cè)定酵母活菌數(shù)。

將酵母菌（4×106CFU/mL）以1%接種量接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)12 h，然后接種1%的乳酸菌（1×108CFU/mL），共培養(yǎng)至24 h，以酵母菌單菌于第0 h 和乳酸菌單菌于第12 h 以同接種量接種至MRS 液體培養(yǎng)基為對(duì)照。每隔4 h 測(cè)定活菌數(shù)和pH。

1.2.6 接種比例的確定 乳酸菌與酵母菌活菌數(shù)以10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、100:1 的比例接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，其中酵母菌菌體濃度固定為（4×106CFU/mL），乳酸菌菌體濃度隨比例調(diào)節(jié)，先接種酵母菌后接種乳酸菌；以相同菌體濃度的乳酸菌和酵母菌單菌接種于MRS 培養(yǎng)基為對(duì)照組，30 ℃靜置培養(yǎng)，在12、18、24 h 測(cè)定活菌數(shù)。

1.2.7 發(fā)酵效果比對(duì)實(shí)驗(yàn)

1.2.7.1 菌懸液制備 將互促菌組植物乳桿菌J05和釀酒酵母Y21 以及互抑組合乳酸乳球菌RQ 和畢赤酵母Y1，分別接入MRS 與YPD 培養(yǎng)基進(jìn)行活化，活化兩代之后，4500 r/min 離心15 min，棄去上清，無菌生理鹽水重懸沉淀，調(diào)節(jié)菌體濃度為前期篩選出的最佳比例乳酸菌:酵母菌=30:1（此時(shí)乳酸菌菌體濃度為1.2×108CFU/ml；酵母菌菌體濃度為4×106CFU/mL）。

1.2.7.2 泡菜制作工藝與實(shí)驗(yàn)處理 泡菜工藝流程參考熊濤等[23]的方法并加以改進(jìn)，制作流程如下：

泡菜原料挑選→整理篩選→泡菜壇預(yù)處理→沖洗控水→切塊裝壇→接種發(fā)酵劑→鹽水封口→發(fā)酵→成品。

取45 個(gè)320 mL 的玻璃密封罐，洗凈，烘箱烘干。分別稱取50 g 白菜樣品放入玻璃密封罐中。用冷沸水配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 4%的泡菜鹽水，以2%的接種量（以白菜質(zhì)量計(jì)）添加菌液發(fā)酵。按照1:2 的料液比，分別量取100 mL 泡菜鹽水完全淹沒樣品，保鮮膜加蓋密封，室溫條件下自然發(fā)酵。從腌制之日起，每隔 2 d 取樣測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)5 個(gè)處理：單菌植物乳桿菌J05 組，單菌釀酒酵母Y21 組，互促組植物乳桿菌J05 和釀酒酵母Y21，互抑組乳酸乳球菌RQ 和畢赤酵母Y1 以及空白對(duì)照組（自然發(fā)酵）。

1.2.7.3 泡菜理化指標(biāo)測(cè)定 泡菜發(fā)酵液pH 采用pH 計(jì)直接測(cè)定?？偹釡y(cè)定參照GB/T 12456-2021《食品中總酸的測(cè)定》直接滴定法；還原糖含量測(cè)定參照GB 5009.7-2016《食品國家安全標(biāo)準(zhǔn)食品中還原糖的測(cè)定》直接滴定法；亞硝酸鹽含量測(cè)定參照GB 5009.33-2016《食品國家安全標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》紫外分光光度法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS.20 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用ANOVA 對(duì)各組間差異進(jìn)行單因素方差分析，采用t檢驗(yàn)對(duì)兩組之間的差異進(jìn)行分析，P＜0.05 表示有顯著性差異，平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示結(jié)果，使用Origin 2021 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 互促乳酸菌和酵母菌的初篩

由表2、表3 可得，通過比較乳酸菌、酵母菌在添加代謝產(chǎn)物培養(yǎng)基和單一培養(yǎng)基的生長情況，從所有菌株組合中篩選出具有偏利關(guān)系的組合23 對(duì)，占比28.75%；相互促進(jìn)的組合4 對(duì)（P＜0.05），即植物乳桿菌J05 和釀酒酵母Y21，植物乳桿菌J05 和畢赤酵母Y163，屎腸球菌HR 和畢赤酵母Y163 以及屎腸球菌B2 和畢赤酵母Y163，占比5.00%；僅對(duì)一方有抑制作用的組合24 對(duì)，占比30.00%；相互抑制的組合8 對(duì)（P＜0.05），包括乳酸乳球菌RQ 和畢赤酵母Y1 等，占比10.00%。由此可見，乳酸菌和酵母菌復(fù)配，菌株間會(huì)表現(xiàn)出不同的菌間關(guān)系，而能夠互相促進(jìn)的組合占比較低。在劉敏敏等[22]的實(shí)驗(yàn)中有相似結(jié)果，其從分離自酸馬奶的8 株乳酸菌和7 株酵母菌中僅篩選出3 對(duì)具有相互促進(jìn)作用的乳酸菌和酵母菌組合。許多研究表明乳酸菌能產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物如有機(jī)酸、抗真菌肽等對(duì)酵母菌的生長產(chǎn)生不同影響[24-25]。酵母菌的代謝產(chǎn)物（游離氨基酸和維生素）大多對(duì)乳酸菌產(chǎn)生促進(jìn)作用，部分酵母菌的代謝產(chǎn)物甚至?xí)せ钊樗峋腖uxS/AI-2 QS 系統(tǒng)[26]，從而調(diào)節(jié)群體密度，影響菌群生長。但也有報(bào)道證明一些酵母菌會(huì)分泌抑菌物質(zhì)抑制乳酸菌的生長[27]。

表2 乳酸菌代謝產(chǎn)物對(duì)酵母菌生長影響Table 2 Effects of lactic acid bacteria metabolites on yeast growth

表3 酵母菌代謝產(chǎn)物對(duì)乳酸菌生長影響Table 3 Effects of yeast metabolites on the growth of lactic acid bacteria

2.2 互促乳酸菌和酵母菌的復(fù)篩

表4 結(jié)果表明，對(duì)初篩中選出的4 對(duì)乳酸菌和酵母菌組合進(jìn)行菌組共培養(yǎng)復(fù)篩，只有植物乳桿菌J05 和釀酒酵母Y21 顯示出明顯穩(wěn)定的相互促進(jìn)關(guān)系（P＜0.05），因此選該菌株組合作為后續(xù)篩選實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。

表4 乳酸菌和酵母菌復(fù)篩活菌數(shù)Table 4 The viable number of lactic acid bacteria and yeast

2.3 培養(yǎng)方式的確定

結(jié)果如圖1 所示，釀酒酵母Y21 靜置培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)的無菌代謝產(chǎn)物都可以促進(jìn)植物乳桿菌J05 的生長，且對(duì)該菌的促進(jìn)作用表現(xiàn)在4～16 h 之間，而靜置培養(yǎng)的無菌代謝產(chǎn)物對(duì)植物乳桿菌J05 的促進(jìn)作用更加明顯。酵母菌屬于兼性厭氧菌，靜置培養(yǎng)過程中酵母菌與空氣接觸較少，可將糖分分解成乙醇和CO2等代謝產(chǎn)物，振蕩培養(yǎng)過程中酵母菌主要進(jìn)行耗氧代謝，此時(shí)糖分降解較徹底，酵母菌在不同氧含量情況下代謝產(chǎn)物不同，對(duì)乳酸菌的影響也可能不同。郭倩茹[28]使用振蕩培養(yǎng)酵母無細(xì)胞上清液與乳酸菌共培養(yǎng)，篩選出了互利的乳酸菌和酵母菌；趙小麗[29]使用厭氧發(fā)酵的酵母培養(yǎng)物來測(cè)定對(duì)植物乳桿菌的促進(jìn)效果，并建立了酵母菌厭氧發(fā)酵體系。

圖1 釀酒酵母不同代謝產(chǎn)物對(duì)植物乳桿菌的生長的影響Fig.1 Effects of different metabolites of S. cerevisiae on the growth of L. plantarum

2.4 接種順序?qū)晟L情況的影響

從圖2A 的結(jié)果分析，先接種植物乳桿菌J05 培養(yǎng)12 h，后接種釀酒酵母Y21，結(jié)果顯示與單菌J05 組相比，共培養(yǎng)J05 的生長無明顯差異，與單菌Y21 組相比，共培養(yǎng)Y21 在16 h 時(shí)生長受到抑制，20 h 后恢復(fù)正常。結(jié)合圖2C 中pH 結(jié)果，釀酒酵母Y21 在接種前期可能受到酸抑制，適應(yīng)環(huán)境后，利用植物乳桿菌J05 的部分代謝產(chǎn)物加速生長。從圖2B與圖2D 的結(jié)果分析，先接種釀酒酵母Y21 培養(yǎng)12 h，后接種植物乳桿菌J05，結(jié)果顯示與單菌Y21組相比，共培養(yǎng)Y21 的生長狀態(tài)改善，且在16 和20 h時(shí)活菌數(shù)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），表明加入植物乳桿菌J05 后促進(jìn)了釀酒酵母Y21 的生長；接入植物乳桿菌J05 后，共培養(yǎng)J05 活菌數(shù)較單菌對(duì)照組提高，在20 h 時(shí)差異顯著（P＜0.05），表明此時(shí)釀酒酵母Y21 的代謝產(chǎn)物可以促進(jìn)植物乳桿菌J05 的生長。在共培養(yǎng)菌株的接種順序研究中，周鈺涵等[30]研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母與球擬酵母接種順序不同，對(duì)發(fā)酵體系中還原糖含量及CO2總失重有不同程度影響；吳軒德[31]在對(duì)釀酒酵母與巴氏醋桿菌相互作用的研究中表明，在酵母菌發(fā)酵24 h 后接種醋酸菌對(duì)酵母酒精發(fā)酵影響最大。因此本實(shí)驗(yàn)中不同接種順序下菌株表現(xiàn)出不同的生長情況，推測(cè)與共培養(yǎng)體系中不同時(shí)段的代謝產(chǎn)物的差異相關(guān)。

圖2 不同接種順序下植物乳桿菌和釀酒酵母的活菌數(shù)及pHFig.2 Number of viable strains and pH of L. plantarum and S.cerevisiae in different inoculation sequences

2.5 接種比例對(duì)菌株生長情況的影響

結(jié)果如圖3 所示，菌株復(fù)配比例對(duì)菌株生長有一定影響，在12 h 時(shí)，與單菌對(duì)照組相比，各復(fù)配組的活菌數(shù)出現(xiàn)明顯差異（P＜0.05），而在18 h 和24 h時(shí)沒有明顯差別，該結(jié)果與閆彬等[32]的研究結(jié)果較為接近，而與Xu 等[11]的結(jié)果有一定差異，可能是各菌株分泌有利代謝物質(zhì)的時(shí)間有差異所致[33]。在12 h 時(shí)，不同菌株比例對(duì)復(fù)配組中植物乳桿菌J05 的生長均有促進(jìn)作用，對(duì)釀酒酵母Y21 的生長影響有差異，說明復(fù)配對(duì)植物乳桿菌J05 生長促進(jìn)效果明顯，而對(duì)釀酒酵母Y21 的影響有限。其中30:1和40:1 的比例是菌株復(fù)配的較佳比例，在這兩個(gè)比例下，復(fù)配組的活菌數(shù)均顯著高于單菌組。

圖3 不同接種比例植物乳桿菌和釀酒酵母的活菌數(shù)Fig.3 Number of viable strains of L.plantarum and S.cerevisiae under different inoculation ratios

2.6 泡菜發(fā)酵過程中pH 和總酸的變化

pH 作為泡菜發(fā)酵過程中一項(xiàng)重要指標(biāo)，對(duì)微生物生長和代謝產(chǎn)物形成具有重要影響[34]。由表5 可知，除酵母組外，所有組在0～2 d 之間pH 均急速下降，第10 d 至發(fā)酵過程完結(jié)，各組pH 趨于穩(wěn)定，互促組pH 最低（P＜0.05），而互抑組和對(duì)照組的pH 最高。由圖4 可知，在發(fā)酵過程中，各組總酸含量均逐漸增加到10 d 后趨于穩(wěn)定，其中互促組總酸含量維持在較高水平，穩(wěn)定期與其他組相比總酸含量最高（P＜0.05）。所有組別在發(fā)酵過程中總酸含量均低于國內(nèi)貿(mào)易行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10439-2007（≤2 g/100 g），結(jié)果與pH 變化情況基本一致。對(duì)照組與互抑組總酸增加緩慢，在2～10 d 內(nèi)，總酸含量均低于互促組和單菌組。各實(shí)驗(yàn)組接種菌量相同的情況下，互促組產(chǎn)酸量大，說明發(fā)酵能力最強(qiáng)，互抑組從第8 d 開始，酸產(chǎn)量不再增加，總酸產(chǎn)量比空白對(duì)照組低，說明發(fā)酵能力最差。

表5 泡菜發(fā)酵過程中pH 變化Table 5 Change of pH during pickle fermentation

研究表明，在泡菜發(fā)酵過程中，其pH 達(dá)到3.5～3.8 可認(rèn)為發(fā)酵結(jié)束，泡菜此時(shí)為成熟狀態(tài)，理論上風(fēng)味最佳，可進(jìn)行食用[35]。本實(shí)驗(yàn)中，互促組pH 在第6 d 下降到3.66，且一直維持在最低水平，結(jié)合總酸含量變化情況分析，隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，各組發(fā)酵泡菜中總酸含量不斷增加，在總酸的積累量上，互促組都要高于其他組別，這是因?yàn)榛ゴ俳M乳酸菌與酵母菌為互利共生菌組，生長繁殖速度更快，產(chǎn)酸更多。而其他組別中的乳酸菌與酵母菌未能形成互促關(guān)系，相比于互促組，發(fā)酵繁殖周期較長，成為優(yōu)勢(shì)菌種所需時(shí)間更久，產(chǎn)酸量和產(chǎn)酸速率都要低于互促組，所以到達(dá)發(fā)酵結(jié)束時(shí)間也就越久。凌榮秀等[36]研究表明泡菜酸性環(huán)境可抑制有害菌的生長和代謝，有利于乳酸菌的發(fā)酵，陳影等[37]研究表明，泡菜發(fā)酵體系中乳酸菌量增加有助于降低pH 與提升總酸含量，縮短泡菜發(fā)酵時(shí)間。

2.7 泡菜發(fā)酵過程中還原糖含量變化

由圖5 所示，發(fā)酵泡菜的還原糖含量均呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)，除對(duì)照組外，添加菌組都在第2 d 到達(dá)峰值。泡菜發(fā)酵初期，微生物活動(dòng)較弱，泡菜葉中淀粉、多糖類物質(zhì)被降解成還原糖，當(dāng)還原糖溶解速度大于微生物利用的速度，導(dǎo)致泡菜液中的還原糖含量上升，隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，大量的微生物生長繁殖消耗碳源，導(dǎo)致還原糖含量逐漸降低[38]，符合微生物對(duì)碳源分解利用的規(guī)律[39]。其中釀酒酵母單菌Y21 組的還原糖含量最高，有利于其后期的發(fā)酵利用。而互促組的還原糖含量在整個(gè)發(fā)酵過程中均維持在較低水平，表明該組別中微生物對(duì)還原糖利用率較高，因此發(fā)酵充分，該結(jié)果與產(chǎn)酸結(jié)果相一致?；ゴ俳M的還原糖含量在第2 d 時(shí)處于各組別中最低值，可能由于酵母產(chǎn)的還原糖被乳酸菌快速利用，兩菌在代謝上存在相互作用，有利于發(fā)酵的進(jìn)行。而互抑組在整個(gè)發(fā)酵過程中還原糖含量較高，而產(chǎn)酸量較低，說明發(fā)酵能力較差。

圖5 泡菜發(fā)酵過程中還原糖含量的變化Fig.5 Changes of reducing sugar content in the fermentation of pickle

2.8 泡菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量變化

亞硝酸鹽含量作為判斷泡菜產(chǎn)品是否可以安全食用的一項(xiàng)重要指標(biāo)，得到消費(fèi)者關(guān)注[40]，在《食品中污染物限量國家標(biāo)準(zhǔn)》中有明確規(guī)定，其殘留量在醬菜中不得超過20 mg/kg[41]。由圖6 可知，各組中“亞硝峰”都出現(xiàn)在第2 d，其中對(duì)照組峰值最高為8.03 mg/kg，互促組峰值含量為5.38 mg/kg，均未超過20 mg/kg；發(fā)酵第10 d，所有組別中亞硝酸鹽含量都下降到3 mg/kg 以下，遠(yuǎn)低于標(biāo)準(zhǔn)限量值。

圖6 泡菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量的變化Fig.6 Changes of nitrite content in the fermentation of pickle

本實(shí)驗(yàn)各處理組亞硝酸鹽含量均在發(fā)酵第2 d達(dá)到高峰，隨后逐漸下降。泡菜發(fā)發(fā)酵過程中產(chǎn)酸可抑制硝酸鹽還原菌的生長，逐漸降低亞硝酸鹽含量；且在酸性條件下，亞硝酸根離子可與氫離子結(jié)合形成亞硝酸，發(fā)生自身歧化反應(yīng)生成二氧化氮和一氧化氮，從而降低亞硝酸鹽含量[42]。在所有實(shí)驗(yàn)組中，自然發(fā)酵的對(duì)照組亞硝酸鹽含量最高，說明添加發(fā)酵微生物有利于抑制泡菜亞硝酸鹽的生成，互促組與釀酒酵母Y21 組中亞硝酸鹽含量較低，結(jié)合pH 和總酸發(fā)酵結(jié)果分析，說明發(fā)酵充分，能有效抑制硝酸鹽還原菌生長，有利于降低亞硝酸鹽含量。較多研究表明，人工接種復(fù)合乳酸菌進(jìn)行泡菜發(fā)酵，可起到抑制亞硝酸鹽含量的作用。任亭等[34]研究復(fù)合菌種對(duì)青菜頭泡菜品質(zhì)的影響，結(jié)果顯示，接種組亞硝酸鹽峰值為2.61 mg/kg，對(duì)照組為6.12 mg/kg，接種組較對(duì)照組低。陳大鵬等[38]以娃娃菜的尾菜為原料，接種混合菌種發(fā)酵泡菜，自然發(fā)酵泡菜的“亞硝峰”出現(xiàn)在發(fā)酵的第3 d，為32.1 mg /kg，而人工接種發(fā)酵泡菜的“亞硝峰”出現(xiàn)在發(fā)酵第2 d，峰值較低，為9.03 mg /kg。本實(shí)驗(yàn)得到結(jié)果與上述相似。

3 結(jié)論

本研究通過代謝產(chǎn)物與菌株共培養(yǎng)初篩，乳酸菌與酵母菌共培養(yǎng)復(fù)篩，篩選出一對(duì)具有相互促進(jìn)作用的植物乳桿菌J05 與釀酒酵母Y21，對(duì)該菌組間培養(yǎng)方式、接種順序、接種比例等進(jìn)行探究，再將篩選得到的菌組應(yīng)用到人工接種發(fā)酵泡菜中，研究各菌組的發(fā)酵性能。發(fā)現(xiàn)互促組可較快進(jìn)入發(fā)酵成熟期，縮短泡菜發(fā)酵周期，其還原糖含量在整個(gè)發(fā)酵過程中均維持在較低水平，各添加菌組亞硝酸鹽含量均要低于自然發(fā)酵組，其中互促組在整個(gè)發(fā)酵過程亞硝酸鹽含量較低，提高了泡菜食用的安全性。上述結(jié)果為乳酸菌與酵母菌互作關(guān)系研究及人工接種發(fā)酵泡菜的工業(yè)化生產(chǎn)，提供了一定的科學(xué)理論依據(jù)。