蘆慧勤，梅議文，謝琦藍(lán)，王琳琳，蔡自建，秦 斐，冷坪蔚

（西南民族大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041）

牦牛常年生活在高原地區(qū)，牦牛肉具有高蛋白、低脂肪、氨基酸比例適宜、富含礦物質(zhì)等特點(diǎn)，有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，近年來(lái)廣受消費(fèi)者歡迎。但肉在宰后貯藏和加工過(guò)程中會(huì)不可避免地接觸氧氣，使蛋白和脂質(zhì)發(fā)生氧化，導(dǎo)致肉制品出現(xiàn)顏色變暗、口感和風(fēng)味劣變等不良現(xiàn)象。在肉品這一復(fù)雜體系中，蛋白氧化與脂質(zhì)氧化并不是孤立發(fā)生的，二者往往相互促進(jìn)相互影響。就實(shí)際而言，脂質(zhì)往往比蛋白更快也更易發(fā)生氧化，脂質(zhì)氧化過(guò)程中產(chǎn)生的自由基和氧化產(chǎn)物可直接或間接攻擊蛋白，誘導(dǎo)并參與蛋白氧化變性，最終影響蛋白功能特性及產(chǎn)品質(zhì)量[1-2]。

有研究發(fā)現(xiàn)，相較于初級(jí)產(chǎn)物，脂質(zhì)的次級(jí)產(chǎn)物更易與蛋白反應(yīng)[3]。丙二醛（Malondialdehyde，MDA）是脂肪氧化的一種典型次級(jí)產(chǎn)物，是脂肪過(guò)氧化反應(yīng)中產(chǎn)生最多的醛類，對(duì)蛋白有高度反應(yīng)性[4]。MDA可誘導(dǎo)蛋白氧化，改變蛋白結(jié)構(gòu)，對(duì)肉品品質(zhì)和安全性造成潛在威脅[5]。因此，如何延緩肌肉中脂肪和蛋白氧化，提高其氧化穩(wěn)定性已成為近年研究的熱點(diǎn)。L-賴氨酸（L-lysine，L-Lys）是一種堿性氨基酸，其作為蛋白質(zhì)基本組成成分，安全無(wú)毒，來(lái)源廣泛。將其添加到肉制品中可起到嫩化、改善色澤、提高出品率等效果[6]。除此以外，L-Lys 還有一定的抗氧化能力：Hwang 等[7]的研究結(jié)果表明，5.5 mmol/L L-Lys 可顯著抑制大豆油高溫氧化；Zhang 等[8]發(fā)現(xiàn)L-Lys 能夠有效延緩乳化香腸氧化進(jìn)程；Cao 等[9]發(fā)現(xiàn)L-Lys對(duì)肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)氧化損傷具有明顯修復(fù)作用。綜上所述，L-Lys 在肉及肉制品的加工中應(yīng)用前景廣闊，本課題組前期研究也證明，L-Lys 可提高牦牛肉制品色澤、保水性等品質(zhì)，但對(duì)于L-Lys 在MDA 誘導(dǎo)氧化條件下對(duì)牦牛肉品質(zhì)特性和氧化程度的影響情況及其機(jī)理尚不明確，因此有必要開(kāi)展相關(guān)研究。

本文以牦牛肉背最長(zhǎng)肌為研究對(duì)象，以MDA 作為誘導(dǎo)劑建立模擬氧化體系，對(duì)牦牛肉注射不同濃度的L-Lys 和MDA 混合溶液，通過(guò)測(cè)定貯藏過(guò)程中牦牛肉食用品質(zhì)、脂質(zhì)氧化、蛋白氧化及肌肉組織學(xué)特性等指標(biāo)，探究L-Lys 在MDA 誘導(dǎo)氧化條件下對(duì)牦牛肉品質(zhì)特性和氧化程度的影響，以明確在氧化脅迫條件下L-Lys 對(duì)牦牛肉品質(zhì)的影響作用及潛在機(jī)制，以期為保持和提高牦牛肉及肉制品品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮牦牛肉背最長(zhǎng)肌 選取屠宰場(chǎng)2～4 歲、發(fā)育良好、健康無(wú)病的牦牛6 頭，屠宰后2 h 內(nèi)取背最長(zhǎng)肌，剔除表面筋膜，切分成塊，每塊約40 g，4 ℃條件下帶回實(shí)驗(yàn)室，采自廣漢向陽(yáng)江南屠宰場(chǎng)；L-Lys食品級(jí) 河南萬(wàn)邦化工科技有限公司；1,1,3,3-四甲氧基丙烷（TMP）、二硝基苯甲酸（DTNB） 阿拉??；尿素、鹽酸胍、乙酸、三氯甲烷、碘化鉀、硫代硫酸鈉成都市科隆化學(xué)品有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS） 德國(guó)Biofroxx；2,4-二硝基苯肼（DNPH）西亞試劑；以上試劑均為分析純。

PH-STAR 手持pH 計(jì) 德國(guó)麥斯特有限公司；CM-700D 色差儀 柯尼卡美能達(dá)股份有限公司；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華（常州）儀器制造有限公司；XHF-D 高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；Centrifuge 5804R 高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf 公司；V-1000 紫外分光光度計(jì) 翱藝儀器上海有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MDA 溶液的制備 參考Wang 等[10]的方法制備丙二醛溶液。取8.4 mL TMP 于10 mL 5 mol/L HCl 溶液中，加水定容至50 mL，40 ℃避光振蕩30 min，冷卻后用6 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)溶液pH 至6.0，最后將溶液用磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH6.0）定容至250 mL，即得MDA 儲(chǔ)備液。使用前參考Wang 等[10]的方法測(cè)定MDA 濃度：將儲(chǔ)備液稀釋105倍后測(cè)定其在267 nm 波長(zhǎng)處的吸光度，ε=31500L/（mol·cm）。

1.2.2 樣品前處理 將L-Lys 溶液和MDA 溶液1:1（V/V）混合后注射在肉品中。KB 組：蒸餾水；L0 組：10 mmol/L MDA；L5 組：5 mmol/L L-Lys、10 mmol/L MDA；L10 組：10 mmol/L L-Lys、10 mmol/L MDA，注射量為肉重10%。注射完成后立即用自封袋包裝，手動(dòng)排出空氣后，置于4 ℃冰箱內(nèi)避光貯藏，分別于第1、3、5、7 d 時(shí)取對(duì)應(yīng)肉樣測(cè)定指標(biāo)。

1.2.3 食用品質(zhì)測(cè)定1.2.3.1 pH 手持pH 計(jì)校準(zhǔn)后，將探頭插入肉樣，待讀數(shù)穩(wěn)定后記錄數(shù)值。

1.2.3.2 肉色穩(wěn)定性 色度：將肉樣切開(kāi)，用色差儀測(cè)定肉樣中心色度。結(jié)果表示為亮度值L*、紅度值a*、黃度值b*。

肌紅蛋白（myoglobin，Mb）氧化狀態(tài)：參考Krzywicki[11]的方法，并略作修改。取5 g 肉糜，加入20 mL 磷酸鈉緩沖液（0.04 mol/L，pH6.8），勻漿后4 ℃靜置1 h 離心30 min（3300 r/min，15 ℃）。取上清液進(jìn)行過(guò)濾，濾液用緩沖液定容至25 mL，測(cè)定其在525、545、565、572 nm 處吸光度并按以下公式計(jì)算：

氧合肌紅蛋白含量（Oxymyoglobin，OMb）（%）=（0.882R1-1.267R2+0.809R3-0.361）×10

高鐵肌紅蛋白含量（Methemoglobin，MMb）（%）=（2.514R1+0.777R2+0.800R3+1.098）×100

式中：R1，A572/A525；R2，A565/A525；R3，A545/A525。

1.2.3.3 蒸煮損失 將肉樣切塊后稱重，80 ℃水浴加熱至肉樣中心溫度達(dá)到75 ℃后保持15 min，冷卻，擦干表面水分后再次稱重并按下式計(jì)算：

式中：m1，肉樣蒸煮前質(zhì)量，g；m2，肉樣蒸煮后質(zhì)量，g。

1.2.3.4 肌原纖維小片化指數(shù)（Myofibril fragmentation index，MFI） 參考李文博等[12]的方法，并略作修改。取2 g 肉糜，加入20 mL MFI 緩沖液，勻漿后離心15 min（1000×g，4 ℃），棄上清后加入15 mL 緩沖液相同條件再次離心，棄上清后用10 mL 緩沖液充分懸浮沉淀，然后用200 目篩網(wǎng)過(guò)濾，并用5 mL緩沖液幫助過(guò)濾。所得濾液用雙縮脲法測(cè)定蛋白濃度，并調(diào)節(jié)蛋白濃度至0.5 mg/mL，最后在540 nm處測(cè)定吸光度并按下式計(jì)算：

式中：A540，溶液在540 nm 波長(zhǎng)處的吸光度。

1.2.3.5 質(zhì)構(gòu)特性 參考毛云等[13]的方法，并略作改動(dòng)。將測(cè)定蒸煮損失后的肉樣修整成2 cm×2 cm×1 cm 的肉塊。參數(shù)設(shè)定：采用P/0.5 探頭，測(cè)試前速度2 mm/s，測(cè)試速度1 mm/s，測(cè)試后速度5 mm/s，壓縮比50%，觸發(fā)力5 g。測(cè)定硬度、黏性、彈性、咀嚼性。

1.2.4 脂質(zhì)氧化1.2.4.1 過(guò)氧化物值（Peroxide value，POV） 參照姚崢[14]的方法，并略作改動(dòng)。取3.0 g 肉糜，加入30 mL 三氯甲烷-乙酸混合溶液（2:3，V/V），勻漿后轉(zhuǎn)移到具塞錐形瓶中，加入1 mL 飽和碘化鉀溶液，立即加塞、振搖1 min，置于暗處反應(yīng)5 min，加入75 mL 蒸餾水和1 mL 0.5%的淀粉溶液，混勻后用0.002 mol/L 的Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)液滴定并按下式計(jì)算：

式中：V，試樣消耗的Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)液體積，mL；V0，空白試驗(yàn)消耗的Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)液體積，mL；c，Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，mol/L；m，試樣質(zhì)量，g；1000，換算系數(shù)。

1.2.4.2 硫代巴比妥酸（Thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值 參考Jhonberg 等[15]的方法，并略作改動(dòng)。取5 g 肉糜，加入25 mL 7.5%三氯乙酸（含0.1% EDTA），冰浴勻漿后離心5 min（5000 r/min，4 ℃），過(guò)濾后取5 mL 濾液加5 mL 0.02 mol/L 硫代巴比妥酸溶液，混勻后在沸水浴中反應(yīng)40 min，冷卻后在532 和600 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度并按下式計(jì)算：

式中：A532，532 nm 波長(zhǎng)處吸光度；A600，600 nm波長(zhǎng)處吸光度；V，上清液體積，mL；M，丙二醛的摩爾質(zhì)量，72.063 g/mol；m，樣品質(zhì)量，kg；l，光程，1 cm；ε，摩爾消光系數(shù)，156000 L/（mol·cm）。

1.2.5 蛋白氧化測(cè)定

1.2.5.1 肌原纖維蛋白的提取 參考Huang 等[16]的方法，并略作改動(dòng)。向肉糜中加入4 倍體積標(biāo)準(zhǔn)鹽溶液（10 mmol/L 磷酸鈉緩沖液，0.1 mol/L NaCl，1 mmol/L EGTA，2 mmol/L MgCl2，pH7.0），冰浴勻漿后離心15 min（2000×g，4 ℃），棄上清，重復(fù)上述步驟3 次。最后一次離心后向沉淀中加入4 倍體積0.1 mol/L NaCl 溶液，勻漿后用4 層紗布過(guò)濾，將濾液再次離心15 min（2000×g，4 ℃），沉淀即為肌原纖維蛋白。用雙縮脲法測(cè)定蛋白濃度。

1.2.5.2 羰基含量 參考瞿丞等[17]的方法，并略作改動(dòng)。用25 mmol/L 的磷酸鈉緩沖液（PBS，pH6.25）將肌原纖維蛋白溶液稀釋至2 mg/mL。取1 mL 蛋白溶液加入1 mL 2 mol/L HCl 溶液（含0.02 mol/L DNPH），混勻后室溫下避光反應(yīng)40 min，再加入4 mL 20%三氯乙酸，混勻后離心5 min（11000×g，4 ℃），用2 mL 乙醇-乙酸乙酯溶液（1:1，V/V）洗滌沉淀3 次后，再加入6.0 mL 6.0 mol/L 鹽酸胍溶液，37℃水浴30 min 后在370 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.2.5.3 巰基含量 參考瞿丞等[17]的方法，測(cè)定總巰基和活性巰基含量。取1 mL 2 mg/mL 蛋白溶液依次加入4 mL 尿素-SDS 溶液（含8.0 mol/L 尿素，30 g/L SDS，0.1 mol/L PBS，pH7.4）和1 mL 10 mmol/L DTNB 溶液（溶于0.1 mol/L PBS 中，pH7.4），混勻后室溫下避光反應(yīng)15 min 后在412 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。用不含尿素的緩沖液以相同方法測(cè)定活性巰基含量。

1.2.6 肌肉組織學(xué)特性 參考吳盈茹等[18]的方法，并略做改動(dòng)。取對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的肉樣，垂直肌纖維切成約1 cm×0.5 cm×0.5 cm 的肉塊，用4%多聚甲醛固定72 h 后再用梯度乙醇溶液脫水1 h，再經(jīng)包埋、修片、切片、蘇木精-伊紅染液染色后進(jìn)行顯微觀察，放大倍數(shù)為400 倍。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft 2016 Excel 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理與計(jì)算，用SPSS 23 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05，差異顯著），用Origin 9.0 軟件作圖。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3 次取平均值，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 L-Lys 對(duì)MDA 誘導(dǎo)氧化下牦牛肉食用品質(zhì)的影響

2.1.1 L-Lys 對(duì)MDA 誘導(dǎo)氧化下牦牛肉pH 的影響pH 是預(yù)測(cè)肉品質(zhì)的重要指標(biāo)，對(duì)顏色、風(fēng)味、口感等品質(zhì)都有較大影響。由圖1 可知，在貯藏過(guò)程中，KB 組由于動(dòng)物宰后體內(nèi)發(fā)生糖酵解生成乳酸，pH 不斷下降。添加MDA 后，L0 組pH 呈波動(dòng)趨勢(shì)但并不顯著，1 d 時(shí)，L0 組pH 低于KB 組。類似地，劉彩華等[19]也發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)氧化處理的魚(yú)肉pH 下降更快，其具體原因有待進(jìn)一步探究。3、7 d 時(shí)，L0 組pH 顯著高于KB 組（P＜0.05），這可能是由于MDA誘導(dǎo)脂質(zhì)氧化后促進(jìn)了蛋白降解[20]，導(dǎo)致微生物大量滋生，產(chǎn)生胺類等堿性物質(zhì)使pH 升高。L5 和L10組pH 則呈先上升后下降變化。前5 d 內(nèi)，L-Lys作為胺類的前體物質(zhì)在體系中不斷轉(zhuǎn)化成胺類，pH 上升；7 d 時(shí)由于內(nèi)源氨基酸以及外源添加LLys 解離產(chǎn)生羧酸、酮酸等物質(zhì)[21]，且胺類物質(zhì)發(fā)生氧化，當(dāng)羧酸、酮酸含量大于胺類時(shí)，pH 開(kāi)始下降。同時(shí)，L-Lys 還具有抑菌作用[22]，可延緩胺類生成。綜上所述，本試驗(yàn)條件下體系pH 變化是動(dòng)物宰后體內(nèi)生化反應(yīng)、MDA 促氧化和L-Lys 抑菌作用等因素共同作用的結(jié)果。

圖1 L-Lys 對(duì)MDA 誘導(dǎo)氧化下牦牛肉pH 的影響Fig.1 Effect of L-Lys on the pH value of yak meat under MDA induced oxidation

2.1.2 L-Lys 對(duì)MDA 誘導(dǎo)氧化下牦牛肉肉色穩(wěn)定性的影響

2.1.2.1 L-Lys 對(duì)MDA 誘導(dǎo)氧化下牦牛肉肉色的影響 肉色影響消費(fèi)者購(gòu)買欲的重要因素之一。由表1 可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各組L*值和a*值逐漸減小，b*值逐漸增大。與KB 組相比，L0 組L*值降低，a*值顯著降低（P＜0.05），b*值顯著增大（P＜0.05），Mahmudul 等[23]的研究結(jié)果也顯示MDA 值越大，顏色退化越嚴(yán)重。MDA 誘導(dǎo)蛋白氧化發(fā)生交聯(lián)聚合[10]，水分大量滲出，L*值降低；同時(shí)，MDA 抑制紅褐色的MMb 被還原成亮紅色的OMb，肌肉出現(xiàn)不被接受的褐色（a*值降低，b*值升高），其具體機(jī)制將在下一部分具體討論。另外，注射液MDA 本身為黃色液體，可能也影響了b*值。從L5和L10 組來(lái)看，添加L-Lys 對(duì)于MDA 氧化脅迫造成的顏色劣變具有一定改善作用，其改善程度與濃度成正比，但效果有限，無(wú)法完全抵消MDA 的作用。

表1 L-Lys 對(duì)MDA 誘導(dǎo)氧化下牦牛肉肉色的影響Table 1 Effect of L-Lys on yak meat color under MDA induced oxidation

2.1.2.2 L-Lys 對(duì)MDA 誘導(dǎo)氧化下牦牛肉肌紅蛋白氧化狀態(tài)影響 Mb 氧化狀態(tài)及含量改變是導(dǎo)致肉色變化的直接原因。由圖2 可知，L5、L10 組OMb含量明顯高于L0 組，但隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，各組OMb 含量均顯著減少（P＜0.05），7 d 時(shí)L0 組OMb含量最低，僅余14.44%，說(shuō)明除貯藏時(shí)間外，MDA也嚴(yán)重影響了Mb 的狀態(tài)和含量。一方面，MDA 引發(fā)脂質(zhì)氧化產(chǎn)生大量自由基，OMb 受到攻擊被氧化為MMb；另一方面，MDA 破壞線粒體正常結(jié)構(gòu)同時(shí)抑制還原酶活力，阻礙MMb 被還原[24-25]。因此，7 d 時(shí)L0 組OMb 含量降至最低，而MMb 含量隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)顯著增加（P＜0.05），7 d 時(shí)L0 組MMb含量高達(dá)56.37%。當(dāng)L-Lys 與MDA 復(fù)配后，首先L-Lys 可清除自由基并與OMb 卟啉環(huán)中Fe2+發(fā)生配位反應(yīng)[26]，保護(hù)OMb 免受氧化，其次L-Lys 能夠還原MMb 成[27]，所以與L0 組相比，L5、L10 組OMb含量顯著升高（P＜0.05），MMb 含量則顯著下降（P＜0.05）。Mb 化學(xué)狀態(tài)以及含量的變化趨勢(shì)與a*值、b*值變化情況相符。貯藏后期，雖然氧化程度不斷加重，但L-Lys 延緩氧化的效果仍然存在，且其效果與濃度呈正比。

圖2 L-Lys 對(duì)MDA 誘導(dǎo)氧化下牦牛肉Mb 氧化狀態(tài)影響Fig.2 Effect of L-Lys on myoglobin oxidation state of yak meat under MDA induced oxidation

2.1.3 L-Lys 對(duì)MDA 誘導(dǎo)氧化下牦牛肉蒸煮損失的影響 蒸煮損失率與肉制品出品率有關(guān)，間接反映了肉及肉制品的持水力。如圖3 所示，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，體系內(nèi)氧化程度不斷加重，各組蒸煮損失率逐漸增加，7 d 時(shí)達(dá)到最大值。從組間來(lái)看，1 d 時(shí)，L0 組蒸煮損失率最小，且均大于KB 組，但并無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。蔣祎人等[28]認(rèn)為輕度氧化將誘導(dǎo)部分蛋白結(jié)構(gòu)展開(kāi)，這可能有助于形成均勻致密的蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)，使更多水分被束縛并截留在凝膠網(wǎng)絡(luò)中，從而降低蒸煮損失率。在本試驗(yàn)條件下L-Lys對(duì)于蒸煮損失并沒(méi)有起到明顯改善作用，這與Zhou等[6]的研究結(jié)果不同，其原因可能是本試驗(yàn)是在氧化條件下進(jìn)行的。L-Lys 也可以促進(jìn)蛋白結(jié)構(gòu)伸展[29]，展開(kāi)后暴露出大量活性位點(diǎn)，受到更多氧化攻擊，凝膠結(jié)構(gòu)坍塌，不利于保持水分，但與KB 組相比并無(wú)顯著差異。

圖3 L-Lys 對(duì)MDA 誘導(dǎo)氧化下牦牛肉蒸煮損失的影響Fig.3 Effect of L-Lys on cooking loss of yak meat under MDA induced oxidation

2.1.4 L-Lys 對(duì)MDA 誘導(dǎo)氧化下牦牛肉MFI 值的影響 在宰后成熟過(guò)程中，由于內(nèi)源酶等其他因素，肌原纖維蛋白不斷斷裂成肌纖維片段，表現(xiàn)為MFI值的升高。由圖4 可知，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，各組的MFI 值均顯著升高（P＜0.05）。整個(gè)貯藏過(guò)程內(nèi)，各組MFI 值均高于KB 組，其原因可能是MDA 激活蛋白水解酶（Caspases）級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而加快了肌纖維小片化速率[30]。3 d 時(shí)，L10 組MFI 值顯著低于L5 組（P＜0.05），7 d 時(shí)，L5 和L10 組顯著低于L0 組（P＜0.05）。據(jù)報(bào)道肉品嫩化關(guān)鍵酶calpain-1 和calpain-2 的活性與pH 有關(guān)[31]，而根據(jù)前文，MDA和L-Lys 改變了體系pH，這可能對(duì)酶活有所影響。此外，有研究證明L-Lys 阻礙了肌鈣蛋白-T 等蛋白降解，并且LLys 處理過(guò)的樣品Z-盤破壞程度更小[32]，肌節(jié)結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，這是7 d 時(shí)L5 和L10 組MFI 值較低的另一原因，MFI 值較低可能有利于保持肌肉良好口感，避免其過(guò)于軟爛。

圖4 L-Lys 對(duì)MDA 誘導(dǎo)氧化下牦牛肉MFI 值的影響Fig.4 Effect of L-Lys on MFI value of yak meat under MDA induced oxidation

2.1.5 L-Lys 對(duì)MDA 誘導(dǎo)氧化下牦牛肉質(zhì)構(gòu)的影響 肌肉的質(zhì)構(gòu)直接影響產(chǎn)品的口感及品質(zhì)。由表2可知，在貯藏過(guò)程中KB 組和L5 組硬度均呈上升變化，L0 組和L10 組在5 d 達(dá)到最大值后又有所下降，但均大于KB 組，這與崔文斌等[33]的研究結(jié)果基本一致，原因可能是因?yàn)榍捌诘鞍捉Y(jié)構(gòu)展開(kāi)，受到氧化，彼此交聯(lián)，形成復(fù)合聚集體，導(dǎo)致硬度增大[34]，后期隨著肌纖維碎片不斷積累，硬度又開(kāi)始下降，而低濃度L-Lys 促進(jìn)了肌原纖維蛋白等鹽溶蛋白溶解，使其形成均勻致密的凝膠結(jié)構(gòu)，從而提高了肉樣硬度[35]，當(dāng)L-Lys 大量添加后，不利于凝膠結(jié)構(gòu)的保持，硬度反而降低。黏性方面，除L5 組在3 d 時(shí)顯著升高外（P＜0.05），其余各處理組在貯藏過(guò)程中變化并不顯著。彈性方面，整體來(lái)看，彈性隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減小，但各組之間并無(wú)顯著差異，說(shuō)明本試驗(yàn)條件下MDA 和L-Lys 均對(duì)貯藏過(guò)程中肌肉的彈性沒(méi)有顯著影響。各組咀嚼性變化趨勢(shì)與硬度相同，這表明添加低濃度的L-Lys 可以協(xié)同MDA 增強(qiáng)硬度和咀嚼性，高濃度的L-Lys 可在一定程度上起到抑制作用。

表2 L-Lys 對(duì)MDA 誘導(dǎo)氧化下牦牛肉質(zhì)構(gòu)的影響Table 2 Effect of L-Lys on the texture of yak meat under MDA induced oxidation

2.2 L-Lys 對(duì)MDA 誘導(dǎo)氧化下牦牛肉脂質(zhì)氧化程度的影響

2.2.1 L-Lys 對(duì)MDA 誘導(dǎo)氧化下牦牛肉POV 的影響 POV 代表氫過(guò)氧化物含量，可反映脂質(zhì)初級(jí)氧化程度。由圖5a 可知，在前5 d 內(nèi)，隨著時(shí)間推移，脂質(zhì)氧化程度不斷加重，氫過(guò)氧化物逐漸積累，各組POV 持續(xù)增大，5 d 后，KB 組和L0 組繼續(xù)增大并達(dá)到最大值（0.78、0.83 mmol/kg），而L5、L10 組POV在7 d 時(shí)明顯下降并顯著低于KB 組和L0 組（P＜0.05），許鵬[36]在其研究中得到了類似結(jié)果，并認(rèn)為脂質(zhì)過(guò)氧化物不穩(wěn)定，可轉(zhuǎn)化成醛、酮、羧酸等次級(jí)氧化產(chǎn)物，導(dǎo)致POV 下降。L5 組POV 在貯藏過(guò)程中均低于L0 組，并從3 d 開(kāi)始低于KB 組，說(shuō)明5 mmol/L L-Lys 在前5 d 能夠有效抑制脂質(zhì)氧化?，F(xiàn)有研究表明，自由基、氧化產(chǎn)物等物質(zhì)均可引發(fā)脂質(zhì)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[37]，而L-Lys 具有較強(qiáng)的羥自由基（·OH）清除能力[36]，這可能是L5 組POV 處在較低水平的原因。另外，Mb 氧化也是脂質(zhì)氧化的誘導(dǎo)因素之一[37]，而L-Lys 對(duì)Mb 具有保護(hù)作用，這為L(zhǎng)-Lys 抑制脂質(zhì)氧化提供了另一合理解釋。

2.2.2 L-Lys 對(duì)MDA 誘導(dǎo)氧化下牦牛肉TBARS 值的影響 TBARS 值可反映油脂次級(jí)氧化產(chǎn)物中醛酮類物質(zhì)的含量，是另一表征脂質(zhì)氧化的重要指標(biāo)。由圖5b 可知，貯藏過(guò)程中，各組TBARS 值整體呈先上升后下降變化，3 d 時(shí)有最大值，L0 組達(dá)到1.10 mg/100 g。前3 d 內(nèi)，由于脂質(zhì)初級(jí)過(guò)氧化物逐漸分解轉(zhuǎn)化，MDA 大量積累，3 d 后MDA 與氨基反應(yīng)生成1-氨基-3-氨基丙烯導(dǎo)致TBARS 值減小[38]。L0 組、L5 組、L10 組TBARS 值在貯藏過(guò)程中均顯著高于KB 組（P＜0.05），這一方面是由于本試驗(yàn)直接注射了大量MDA，另一方面是因?yàn)镸DA 注射后加劇了體系內(nèi)脂質(zhì)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致氧化產(chǎn)物大幅增加。3 d 后L5 組和L10 組TBARS 值顯著低于L0 組（P＜0.05），這表明L-Lys 可在一定程度上抑制脂質(zhì)氧化，這可歸因于L-Lys 清除自由基、螯合金屬離子的作用。

2.3 L-Lys 對(duì)MDA 誘導(dǎo)氧化下牦牛肉蛋白氧化程度的影響

2.3.1 L-Lys 對(duì)MDA 誘導(dǎo)氧化下牦牛肉羰基含量的影響 羰基化是肌肉蛋白質(zhì)氧化的表現(xiàn)之一。如圖6 所示，各組羰基含量隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)均顯著增大（P＜0.05）。L10 組羰基含量在1 和3 d 時(shí)明顯低于KB 組，除此之外，各組在整個(gè)貯藏過(guò)程中均高于同期KB 組，表明MDA 氧化脅迫加速了蛋白羰基化。研究表明TBARS 值與羰基值呈極顯著相關(guān)（P＜0.01）[36]，而根據(jù)前文，L-Lys 能夠顯著降低TBARS 值（P＜0.05），這可能間接抑制了蛋白羰基化，另外，L-Lys 清除自由基的功能可能也直接做出了一定貢獻(xiàn)。雖然L-Lys 可抑制蛋白氧化，但7 d 時(shí)L5 組和L10 組羰基含量顯著高于其他組（P＜0.05），L10 組甚至高達(dá)158.51 nmol/mg。這是由外源添加物L(fēng)-Lys 和MDA 直接反應(yīng)生成羰基化合物導(dǎo)致的[2]，因此L5 和L10 組的羰基值并不能完全反映肌肉本身氧化程度，反而L-Lys 消耗了MDA，可能避免了蛋白氧化。

圖6 L-Lys 對(duì)MDA 誘導(dǎo)氧化下牦牛肉羰基含量的影響Fig.6 Effect of L-Lys on carbonyl content of yak meat under MDA induced oxidation

2.3.2 L-Lys 對(duì)MDA 誘導(dǎo)氧化下牦牛肉巰基含量的影響 巰基含量是表征蛋白氧化程度的另一重要指標(biāo)，活性巰基是指存在于蛋白表面的巰基。由圖7 可知，總巰基和活性巰基含量均隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈顯著下降趨勢(shì)（P＜0.05），7 d 時(shí)L0 組顯著低于其他組（P＜0.05），這表明MDA 加快了蛋白氧化速率，此結(jié)果與Lü等[39]的研究結(jié)果一致。另外，在整個(gè)貯藏過(guò)程內(nèi)，總巰基和活性巰基含量均與L-Lys 濃度成正比，表明L-Lys 對(duì)巰基損失有明顯的抑制作用，且添加量越大，效果越強(qiáng)，呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴效應(yīng)。呂遠(yuǎn)奇[40]研究發(fā)現(xiàn)MDA 可與蛋白胺基發(fā)生共價(jià)交聯(lián)，形成大量聚集體，表現(xiàn)為溶解度下降，蛋白聚集后又會(huì)促進(jìn)巰基相互作用形成二硫鍵，而Li 等[29]認(rèn)為L(zhǎng)-Lys 通過(guò)使肌原纖維腫脹，肌球蛋白細(xì)絲解離，二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)展開(kāi)等機(jī)制提高了肌原纖維蛋白的溶解度。這可能對(duì)MDA 氧化應(yīng)激造成的巰基損失起到了修復(fù)作用。

圖7 L-Lys 對(duì)MDA 誘導(dǎo)氧化下牦牛肉巰基含量的影響Fig.7 Effect of L-Lys on sulfhydryl content of yak meat under MDA induced oxidation

2.4 L-Lys 對(duì)MDA 誘導(dǎo)氧化下牦牛肉肌肉組織學(xué)特性的影響

由圖8 可知，牦牛肉肌纖維在貯藏過(guò)程中排列逐漸變得松散，組織內(nèi)白色間隙逐漸增多增大，細(xì)胞輪廓不再清晰。3 d 時(shí)，L0 組已經(jīng)開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞組織破裂現(xiàn)象，胞內(nèi)物質(zhì)外流，輪廓難以辨認(rèn)，肌纖維大量溶解，肌束間空隙過(guò)大，與之相比，L5 組和L10 組細(xì)胞形狀明顯更加規(guī)則，形態(tài)完整飽滿，細(xì)胞排列較為緊密，輪廓清晰可見(jiàn)，且斷裂組織較少，組織內(nèi)裂紋更小。7 d 時(shí)，L0 組肌肉致密結(jié)構(gòu)已遭到嚴(yán)重破壞，肌纖維大量斷裂降解，KB 組肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性也開(kāi)始逐漸喪失，且二者細(xì)胞大小和胞間距離不再均勻，而L5 組和L10 組與3 d 相比，雖然肌束內(nèi)裂紋增多增大，但其完整度仍明顯高于KB 組和L0 組，沒(méi)有出現(xiàn)組織破裂，胞外空間大小均勻，尤其是L10 組。以上結(jié)果說(shuō)明，MDA 嚴(yán)重破壞了肌纖維顯微結(jié)構(gòu)，而L-Lys 在整個(gè)貯藏過(guò)程中對(duì)肌肉組織有明顯保護(hù)作用，并具有濃度依賴性。

圖8 L-Lys 對(duì)MDA 誘導(dǎo)氧化下牦牛肉肌肉組織學(xué)特性的影響（400×）Fig.8 Effect of L-Lys on histological characteristics of yak meat under MDA induced oxidation (400×)

3 結(jié)論

與KB 相比，MDA 作為脂質(zhì)氧化產(chǎn)物可誘導(dǎo)并促進(jìn)脂質(zhì)和蛋白發(fā)生氧化，并導(dǎo)致牦牛肉蒸煮損失率提高、顏色劣變、硬度和咀嚼性增大。而L-Lys 能夠明顯抑制MDA 促氧化作用，減輕脂質(zhì)氧化程度，降低POV 以及TBARS 值，并濃度依賴性地抑制OMb轉(zhuǎn)化成MMb 而延緩肉色惡化（提高L*值、a*值），對(duì)巰基、活性巰基以及肌纖維組織結(jié)構(gòu)完整性的保護(hù)作用也呈明顯濃度依賴效應(yīng)；此外，10 mmol/L LLys 可在貯藏前期抑制蛋白羰基化。以上結(jié)果說(shuō)明，L-Lys 可在一定程度上減輕MDA 誘導(dǎo)的脂質(zhì)和蛋白氧化應(yīng)激，修復(fù)MDA 造成的氧化損傷，提高肌肉氧化穩(wěn)定性，改善肉品品質(zhì)，且L-Lys 濃度為10 mmol/L 時(shí)效果較好。此研究結(jié)果可為L(zhǎng)-Lys 在肉及肉制品加工中的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持和理論參考。