祖玥,梁研,孫若嵐,趙凡,卞勇,唐德才,尹剛

(南京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院·中西醫(yī)結合學院,江蘇 南京 210023)

卵巢癌(Ovarian cancer,OC)是婦科常見的惡性腫瘤之一,死亡率高居婦科惡性腫瘤首位[1]。OC發(fā)病具有隱匿性和進展迅速性特點,大多數患者確診時已是晚期,嚴重影響臨床治療效果,對婦女生命健康造成極大危害。中醫(yī)藥在卵巢癌防治方面優(yōu)勢明顯[2-3],卵巢癌在中醫(yī)屬“癥瘕”“積聚”“腸蕈”等范疇,多為陰陽失調,臟腑虛弱,外邪入侵人體搏結氣血,氣血瘀滯,久成積聚而發(fā)病,治療以補氣活血為主[4-5]。黃芪、莪術配伍在臨床上治療消化道腫瘤效果良好[6],且課題組前期研究證實黃芪、莪術配伍能夠有效抑制卵巢癌的生長,與調控腫瘤血管生成、腫瘤細胞凋亡相關基因的表達密切相關[7-8],但作用機制尚未明確。本文擬基于網絡藥理學、LC-MS及分子對接技術,構建“成分-靶點”、靶點互作(PPI)、靶點功能通路等多層次生物信息網絡,分析黃芪-莪術藥對治療卵巢癌的有效成分和作用機制,為臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 LC-MS技術定量分析黃芪-莪術藥對代表性成分

1.1.1 材料 黃芪為蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根,莪術為溫郁金CurcumawenyujinY.H.Chen et C.Ling的干燥根莖,均購自江蘇省中醫(yī)院中藥房,并由南京中醫(yī)藥大學藥學院吳啟南教授鑒定。

芒柄花素(Formononetin,F27J7S18516)、毛蕊異黃酮(Calycosin,Y24N9Y75652)、黃芪皂苷Ⅱ(Astragaloside Ⅱ,YM0306HD14)、黃芪甲苷(Astragaloside Ⅳ,J04M8T30363)、芒柄花苷(Ononin,R28O8F46957)及毛蕊異黃酮葡萄糖苷(Calycosin-7-glucoside,Y27F9H54731)購自上海源葉生物科技有限公司;大豆皂苷Bb(Soyasaponin Ⅰ,LW18020501)及姜黃素(Curcumin,LW17091410)購自南京良緯生物科技有限公司;吉馬酮(Germacron,PS010352);去甲氧基姜黃素(Demethoxycurcumin,PS000767);雙去甲氧基姜黃素(Bisdemethoxycurcumin,PS010211)購自成都普思生物科技有限公司。所有標準品純度均≥98%。

1.1.2 儀器 Vanquish UHPLC超高效液相色譜系統(tǒng)(Thermo,USA);TSQ Quantis三重四極桿液質聯用儀,配有HESI、APCI離子源(Thermo ScientificTMTSQ QuantisTM,USA);Milli-Q Gradient A10超純水器(Millipore,USA); Labconco CentriVap冷凍離心濃縮儀(Labconco,USA);Centrifuge 5804R大型高速冷凍離心機(Eppendorf,Germany)。

1.1.3 樣本制備 黃芪-莪術水煎液的制備:稱取黃芪10 g和莪術5 g,加10倍量純水回流提取2次,每次1 h,裝載揮發(fā)油測定器收集揮發(fā)油,合并2次上清液,旋蒸濃縮后加入揮發(fā)油定容至15 mL,過0.22 μm微孔濾膜并稀釋成50 mg·mL-1的供試品溶液。

對照標準品溶液的配制:分別取上述標準品配制1.0 mg·mL-1的單個標準品母液(單標),稀釋成500 ng·mL-1,進樣確定方法學;后單標配成混合標準品溶液(混標),并梯度稀釋:1、5、10、25、50、100、250、500、1000 ng·mL-1。

1.1.4 檢測條件 色譜條件:色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm,江蘇漢邦),以0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)為流動相,流速為0.25 mL·min-1,柱溫40 ℃,梯度洗脫(0～0.5 min,10% B;0.5～3 min,10%～25% B;3～9 min,25%～75% B;9～10 min,75%～100% B;10～12 min,100% B;12～12.1 min,100%～10% B;12.1～15 min,10%B)。

質譜條件:電噴霧電離源(H-ESI),正離子模式(ESI+)和負離子模式(ESI-)掃描,電壓均為3 kV,離子傳輸管溫度325 ℃,氣化溫度350 ℃,鞘氣壓50 arb,輔助氣壓10 arb。

1.1.5 數據分析 供試品及標準品溶液進樣測定,通過一級質譜圖確定相對分子質量、各化學成分的保留時間等相關質譜信息,結合提取離子流圖,獲得裂解的二級質譜信息,與標準品、文獻數據比對進行半定性與定量分析黃芪-莪術藥對中的代表性成分。

1.2 網絡藥理學分析黃芪-莪術藥對抗OC有效成分及作用機制

1.2.1 黃芪-莪術藥對成分靶點收集 在上述LC-MS定量分析結果的基礎上,應用TCMSP數據庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)并結合文獻報道,收集篩選黃芪-莪術藥對活性成分及作用靶點,在PubChem數據庫中(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取藥對活性成分PubChem CID編號及分子SDF結構式,將其導入Swiss Target Prediction數據庫(http://www.swiss target prediction.ch)進行靶點預測,以此作為TCMSP數據庫靶點信息的補充,最后利用Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org)進行靶點名稱標準化。

1.2.2 黃芪-莪術藥對抗OC的作用靶點獲取 以“Ovarian cancer”和“Ovarian carcinoma”為關鍵詞,通過Drugbank數據庫(https://www.drugbank.ca/)、DisGeNET數據庫(https://www.disgenet.org/)、GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)檢索、收集、合并OC的疾病靶點并標準化,將其與“1.2.1”中黃芪-莪術藥對成分靶點取交集,交集靶點即為黃芪-莪術藥對抗OC的潛在作用靶點。

1.2.3 黃芪-莪術藥對抗OC關鍵靶點及生物信息學分析 將“1.2.2”中黃芪-莪術藥對抗OC潛在作用靶點導入STRING數據庫(https://www.string-db.org/)獲得蛋白互作關系(protein-protein interaction,PPI),并在CytoScape中構建PPI網絡,分析獲得相互作用網絡的潛在關鍵靶點。并通過Metascape數據庫(http://metascape.org/gp/index.htmL)對黃芪-莪術藥對抗OC潛在作用靶點進行基因功能注釋(GO)和京都基因組百科全書(KEGG)通路富集分析。

1.2.4 黃芪-莪術藥對核心活性成分與關鍵靶點的確定 將黃芪-莪術藥對的所有活性成分、抗OC潛在的關鍵靶點及富集的前10條信號通路導入CytoScape構建“藥材-成分-靶點-通路-疾病”網絡,并根據網絡拓撲學參數確定黃芪-莪術藥對發(fā)揮抗OC的核心成分、關鍵靶點及主要通路。

1.3 黃芪-莪術藥對抗OC關鍵靶點分子對接驗證

通過RSCB PDB數據庫(http://www.rcsb.org)獲取關鍵靶點蛋白3D結構,用PyMOL軟件(www.pymol.org)對蛋白質進行去水,利用AutoDockTools 1.5.6軟件對靶點蛋白受體和配體小分子進行加氫等常規(guī)處理,以原配體為中心設置Grid Box,應用AutoDock Vina進行分子對接驗證,以結合自由能的高低作為與化合物結合程度的評價標準。

2 結果

2.1 LC-MS技術分析黃芪-莪術藥對代表性成分

比較相同色譜、質譜條件下黃芪-莪術混合標準品及水煎液圖譜,根據質譜所提供的保留時間、精確相對分子質量及二級質譜裂解碎片來定量分析其所含成分?？傠x子流圖見圖1,在正、負離子同時掃描的模式下從黃芪-莪術水煎液中共定量出11種成分,見表1。其中芒柄花素(Formononetin)、毛蕊異黃酮(Calycosin)、黃芪皂苷Ⅱ(Astragaloside Ⅱ)、黃芪甲苷(Astragaloside Ⅳ)、芒柄花苷(Ononin)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷(Calycosin-7-glucoside)、大豆皂苷Bb(Soyasaponin Ⅰ)來源于黃芪;吉馬酮(Germacron)、姜黃素(Curcumin)、去甲氧基姜黃素(Demethoxycurcumin)及雙去甲氧基姜黃素(Bisdemethoxycurcumin)來源于莪術。

表1 正負離子模式下,黃芪-莪術水煎液中成分特征信息及含量

注:A.混合標準品;B.黃芪-莪術水煎液;C.定量的11種成分

2.2 黃芪-莪術藥對抗OC成分及作用機制

2.2.1 活性成分篩選及其靶點預測 在前期研究[9]及上述LC-MS定量分析結果的基礎上,以ADME屬性值“口服利用度(Oral bioavailability, OB)≥30%”“藥物相似性(Drug likeness, DL)≥0.18”在TCMSP數據庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)篩選黃芪-莪術藥對活性成分,未出現在該數據庫或不滿足上述參數設定條件但通過查閱文獻(https://www.cnki.net)報道有明確抗腫瘤活性的化學成分也納入研究[10-17]。共確定67個化合物為黃芪-莪術藥對潛在活性成分,見表2。TCMSP數據庫獲取藥對成分靶點682個,SWISS數據庫補充成分靶點2 673個,經Uniprot數據庫標準化及合并、去重后共獲得黃芪-莪術藥對潛在成分靶點684個,為后續(xù)相關通路的預測及核心成分的確定做準備。

表2 黃芪-莪術藥對活性成分信息

2.2.2 黃芪-莪術藥對抗OC的作用靶點獲取 Drugbank、DisGeNET、GeneCards數據庫檢索、收集、合并OC的疾病靶點并標準化后獲得OC疾病靶點1 518個。將其與“2.2.1”中684個黃芪-莪術藥對成分靶點在Venny 2.1.0中取交集繪制韋恩圖,252個交集靶點即為黃芪-莪術藥對抗OC的潛在作用靶點,將“2.2.1”中67個黃芪-莪術藥對潛在活性成分與252個潛在作用靶點進行網絡分析,結果見圖2。黃芪-莪術藥對抗OC的潛在核心成分可能為黃芪中黃酮類化合物及莪術中姜黃素類化合物。

注:A.交集靶點韋恩圖;B.黃芪-莪術藥對“藥材-成分-靶點”網絡圖;黃色菱形為藥物成分;紅色圓形為蛋白靶點;節(jié)點大小與Degree值成正比

2.2.3 黃芪-莪術藥對抗OC潛在關鍵靶點分析 將“2.2.2”中黃芪-莪術藥對抗OC的潛在作用靶點導入STRING數據庫獲得蛋白互作關系(Protein-protein interaction,PPI),并導入CytoScape構建PPI網絡進行拓撲分析,經“度中心性”(Degree),“中介中心性”(Betweenness),“接近中心性”(Closeness)3個參數均比中位數大為依據篩選得到前21個靶點作為黃芪-莪術藥對抗OC的潛在關鍵靶點,并通過degree值排序,使用CytoScape構建PPI網絡,如圖3所示,圖中節(jié)點大小與degree值成正比關系。其中度值最高的TP53(Tumor suppressor p53)可與182個蛋白靶點進行互作。

圖3 黃芪-莪術藥對抗OC相關靶點的PPI網絡

2.2.4 生物信息學分析 基于Metascape數據庫結合R軟件對252個黃芪-莪術藥對抗OC潛在作用靶點進行GO和KEGG富集分析。GO分析得到的生物過程(Biological process,BP)、分子功能(Molecular function,MF)、細胞組分(Cellular component,CC)富集結果如圖4A～C所示,主要涉及細胞運動、遷移、化學應激調控等生物過程,其影響的分子功能主要為蛋白激酶活性及其結合等方面。KEGG分析共得到40條與腫瘤進展相關的信號通路,前10條與黃芪-莪術藥對抗OC相關度最高,如圖4D所示,主要包括MAPK、HIF-1信號通路等,推測黃芪-莪術藥對可能是通過關鍵靶點作用于這些信號通路從而發(fā)揮抗OC作用,接下來將進行關鍵靶點-主要通路的網絡分析進一步驗證。

注:A～C.GO富集結果;D～E.KEGG富集結果

2.2.5 黃芪-莪術藥對核心成分、關鍵靶點、主要通路的確定 將篩選到的黃芪-莪術藥對前10個潛在核心成分、21個潛在關鍵靶點、10條信號通路運用Cytoscape構建“藥材-成分-靶點-通路-疾病”網絡。如圖5所示,黃芪中的黃酮類化合物槲皮素(AR2,Quercetin)、山柰酚(AR15,Kaempferol)、異鼠李素(AR6, Isorhamnetin)等和莪術中姜黃素類化合物去甲氧基姜黃素(CR8,Demethoxycurcumin)、雙去氧基姜黃素(CR23,Bisdemethoxycurcumin)連接度相對較高(前10,Degree>60),推測其可能為黃芪-莪術藥對發(fā)揮抗OC作用的核心活性成分。結合“2.2.3”中PPI網絡分析結果,HSP90AA1、EGFR、ESR1、AKT1、SRC、VEGFA等靶點連接度較高(PPI前21,Degree>110),可能為黃芪-莪術藥對發(fā)揮抗OC的關鍵作用靶點。如圖所示,21個關鍵靶點無孤立靶點,均能與主要通路產生連接,進一步說明黃芪-莪術藥對可能是通過關鍵靶點作用于這些通路發(fā)揮抗OC作用,但相互作用網絡復雜,多個潛在靶點與多種化合物相互作用、與多條信號通路產生聯系,提示黃芪-莪術藥對是通過多成分、多靶點、多通路調節(jié)方式發(fā)揮抗OC作用。

注:黃色菱形為藥物成分;紅色圓形為蛋白靶點;綠色菱形為信號通路;節(jié)點大小與Degree值成正比

2.3 分子對接技術驗證黃芪-莪術藥對潛在核心成分與靶點結合能

據網絡藥理學分析結果,利用AutoDock Vina[18]對“2.2.5”結果中的21個潛在關鍵靶點(PPI前21,Degree值>110)與“2.2.2”結果黃芪、莪術中10個核心活性成分(成分-靶點網絡前10,degree值>60)進行分子對接以驗證分析黃芪-莪術藥對能否通過上述潛在關鍵靶點發(fā)揮抗OC的作用。如果活性成分能夠與靶點蛋白發(fā)生相互作用,這必然在蛋白靶點的活性位點附近發(fā)生,如此能夠引起蛋白結構功能的改變,進而影響相關信號通路發(fā)生變化。以大分子原配體位置為活性口袋,即Grid Box模塊以原配體位置為中心(原配體見表3);其他參數設置“x: 40, y: 40, z: 40”“Spacing: 0.375”進行分子對接,通常配體與受體結合能越低,結合的構象越穩(wěn)定。結合能小于-4.25 kcal·mol-1(1 kcal≈4.185 85 kJ)提示配體與受體有一定的結合活性,小于-5.0 kcal·mol-1有較好的結合活性,小于-7.0 kcal·mol-1有強烈的結合活性[19]。結果發(fā)現,10種活性成分與21個蛋白靶點均有較強烈的結合能力,見表3。用PyMOL軟件對黃芪、莪術單個藥味中結合能最強的成分與靶點對接結果進行可視化(Quercetin-ERBB2、Demethoxycurcumin-MAPK3),可見分子對接預測槲皮素會通過MET-125以及LYS-71在ERBB2的活性口袋與兩個氫鍵結合。去甲氧基姜黃素被預測通過氫鍵連接LYS-753結合至MAPK3的活性口袋,見圖6。

表3 黃芪-莪術藥對核心活性成分與關鍵靶點分子對接結果(kcal·mol-1)

圖6 黃芪-莪術藥對抗OC的活性成分與關鍵靶點分子對接模式圖

3 討論

卵巢癌作為死亡率較高的婦科腫瘤疾病,其病理機制復雜,涉及多種信號轉導通路。研究表明,中藥可通過多靶點、多環(huán)節(jié)發(fā)揮抗腫瘤作用,且毒副作用低、不易產生耐藥性,是近年來研究的熱點[3]。針對氣虛血瘀的腫瘤基本病機,在臨床上運用補氣活血化瘀法截斷腫瘤發(fā)展之勢是當代臨床抗腫瘤治法中核心法則之一,張錫純在《醫(yī)學衷中參西錄》中以黃芪配伍莪術為主藥治療“一切臟腑癥瘕、積聚”。黃芪、莪術相使為用,黃芪味甘性溫,有溫中益氣、補陽利水之功,是補氣要藥;莪術辛散苦泄,溫通行滯,既能破血行氣,又能消積止痛。黃芪得莪術流通之性,補氣而不壅中,攻破并不傷正,補而不滯,增強扶正之效,脾氣旺盛則血循通暢,繼而激發(fā)莪術破血消癥,抑瘤削結。兩藥相伍,養(yǎng)祛并存,散中寓收,共奏扶正祛邪,修榮新脈之功,達遏制腫瘤生長及轉移的目的。

本研究通過液質聯用技術定量分析了黃芪-莪術藥對中代表性成分,如藥典中規(guī)定的黃芪質量控制指標黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷,及其他經過前期研究發(fā)現含量較高、活性較好的成分,如芒柄花素、毛蕊異黃酮、芒柄花苷等;莪術主要含揮發(fā)油和姜黃素類成分,前期我們對莪術中揮發(fā)油成分Curcumenol、Curdione、Isocurcumenol、Furanodienone、Curcumol和Germacrone進行了定量分析[9],本實驗補充分析了姜黃素類成分中的姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素和揮發(fā)油中的吉馬酮。網絡藥理學研究基于LC-MS分析結果,分析得到黃芪-莪術藥對抗OC的核心成分(有效成分),包括黃芪中的黃酮類成分槲皮素、山柰酚、異鼠李素等及莪術中的姜黃素類化合物去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素。本研究的數據收集不僅結合數據庫平臺,同時根據文獻報道補充了化學成分,可以較全面地將黃芪-莪術藥對抗OC活性成分考察在內。

現代研究表明,黃芪、莪術具有明顯的抗腫瘤效應,槲皮素可通過多種機制對多種腫瘤發(fā)揮作用,在防癌抗癌方面抑制多種酶參與的細胞增殖、信號傳導途徑[20-21];山柰酚可顯著抑制小鼠腫瘤模型中的腫瘤生長與肺轉移[22];異鼠李素可通過抑制缺氧環(huán)境中PI3K介導的適應性自噬促進MKN-45胃癌細胞的凋亡[23];姜黃素及其衍生物能夠通過阻滯細胞周期和誘導細胞凋亡來誘導人多形性膠質母細胞瘤GBM 8401細胞凋亡[24],還能顯著抑制膀胱癌細胞增殖和誘導凋亡[25],雖然去甲氧基姜黃素相對上述成分生物利用度較低,但研究表明,與姜黃素相比,其缺少與苯環(huán)直接相連的甲氧基,這種細微的差異導致去甲氧基姜黃素的化學結構更加穩(wěn)定,并具有顯著的抗癌活性[26],后續(xù)可通過開發(fā)脂質分散體、納米顆粒系統(tǒng)等來提高其生物利用度。在配伍抗腫瘤方面,黃芪甲苷與姜黃素聯用可降低肝癌細胞微血管計數以及血管生成相關因子的表達,促進血管正?；痆27]。黃芪與莪術配伍的水煎劑抗腫瘤作用亦顯著[28-31],且兩者配伍抑制腫瘤生長、轉移的效果優(yōu)于單用黃芪、莪術[32]。由此可見,以黃酮類、姜黃素類為代表的活性成分可能為黃芪-莪術藥對抗OC的物質基礎。但網絡藥理學亦存在局限性,如對活性成分的研究未把“量效”等關系考慮在內,從藥物作用特點來看,有些藥物的作用在宏量級,有些藥物的作用在微量級,需后續(xù)運用現代儀器結合化學分析、組學分析手段加以優(yōu)化。

GO和KEGG富集分析結果顯示,大量癌癥相關功能和信號通路出現顯著富集,如MAPK、HIF-1信號通路等,反映了OC發(fā)生發(fā)展過程中分子功能、生物過程和信號通路的紊亂。通過“成分-靶點-通路”網絡的構建,得到黃芪-莪術藥對抗OC的關鍵靶蛋白HSP90AA1、EGFR、ESR1、AKT1、SRC、VEGFA等,其同一活性成分對應多種靶點與多條疾病途徑或信號通路,同一靶點對應多種活性成分與多條疾病途徑或信號通路,顯示出成分、靶點與信號通路間的多協同作用。為了驗證黃芪-莪術藥對中的核心活性成分與關鍵靶點的結合能力,利用AutoDock Vina工具[33-34]驗證黃芪-莪術藥對中的10種潛在核心成分與相關度較高的21個潛在關鍵靶蛋白的結合能力,結果顯示10種核心活性成分與靶蛋白均具有強烈的結合活性。氫鍵的能量貢獻是由受體和供體之間的夾角和氫鍵的長度決定的,氫鍵長度不大于3.5 ?,結構穩(wěn)定[35]。本次分子對接結果中,黃芪中的槲皮素與ERBB2的結合活性最強(-9.4 kcal·mol-1),其與MET-125以及LYS-71在ERBB2的活性口袋以兩個氫鍵相連。氫鍵距離分別為3.0 ?、3.2 ?。莪術中的去甲氧基姜黃素與MAPK3的結合活性最強(-10.0 kcal·mol-1),其與LYS-753結合通過氫鍵連接,氫鍵距離分別為3.0 ?。提示黃芪、莪術中活性成分能夠與潛在核心靶點存在穩(wěn)定的氫鍵相互作用,黃芪-莪術藥對能夠通過作用于相應靶蛋白發(fā)揮抗OC作用。

綜上所述,盡管中醫(yī)藥在防癌抗癌方面療效確切,但中藥成分復雜,明確其有效成分及作用機制是目前亟待解決的問題。本研究通過網絡藥理學結合液質聯用、分子對接技術對黃芪、莪術抗OC的有效成分及作用機制進行探究,以驗證臨床運用黃芪、莪術組方治療OC的合理性,為其后續(xù)療效評價指標的篩選及深入機制研究提供思路和理論依據。