董蕾,黃利華,江津津,鄭玉璽
(廣州城市職業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與美食養(yǎng)生學(xué)院,廣東 廣州 510650)
食源性致病菌是導(dǎo)致食品安全事件頻發(fā)的主要原因之一。在世界范圍內(nèi),每年感染沙門(mén)氏菌(Salmonella spp.)導(dǎo)致死亡或患病而造成的直接經(jīng)濟(jì)損失超30 億美元[1-2]。沙門(mén)氏菌常見(jiàn)的主要有鼠傷寒沙門(mén)氏菌、腸炎沙門(mén)氏菌和豬霍亂沙門(mén)氏菌等,是引起全球細(xì)菌性食物中毒的主要食源性致病菌之一,其中腸炎沙門(mén)氏菌(Salmonella enteritidis)由于不分解蛋白質(zhì),食品基本不會(huì)發(fā)生感官變化,十分容易被忽略[3]。
傳統(tǒng)食源性致病菌檢測(cè)方法包括平板分離法[4]、分子生物學(xué)方法[5-7]、免疫學(xué)方法[8]等。平板分離法作為食品安全檢驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn),需要依靠增菌培養(yǎng)、生化鑒定、血清分型等,其檢測(cè)周期長(zhǎng)、靈敏度不高;同時(shí)檢測(cè)過(guò)程中可能出現(xiàn)非目標(biāo)菌干擾、污染、質(zhì)粒轉(zhuǎn)移等問(wèn)題,影響檢測(cè)結(jié)果,出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性的問(wèn)題[9];分子生物學(xué)方法要求技術(shù)條件高、檢測(cè)過(guò)程中一旦出現(xiàn)環(huán)境污染,則極易出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象,影響檢測(cè)結(jié)果;免疫學(xué)方法前期抗體制備周期長(zhǎng)、研發(fā)成本高、抗體穩(wěn)定性較差,且易受檢測(cè)環(huán)境影響,很難滿足食品安全快速檢測(cè)中對(duì)食源性致病菌快速、靈敏、特異的檢測(cè)需求[10]。
適配體是一類能夠與蛋白結(jié)合、產(chǎn)生高特異性和親和度的單鏈核酸序列[11],其通常僅含有15~40 個(gè)堿基,分子量為5~25 kDa。其片段短、性質(zhì)穩(wěn)定,因此環(huán)境適應(yīng)性好、易保存、不易降解;同時(shí)由于適配體為單鏈寡核苷酸DNA 或RNA,可形成各種所需的空間構(gòu)象(如發(fā)卡結(jié)構(gòu)、G-四聚體等),與食源性致病菌的標(biāo)志性蛋白或致病毒素的特異性結(jié)構(gòu)高特異性結(jié)合,而不與其他類似結(jié)構(gòu)物產(chǎn)生交叉反應(yīng)[12-13],從而實(shí)現(xiàn)高特異性識(shí)別和高親和性結(jié)合靶物質(zhì)。且靶物質(zhì)可為生物分子、化學(xué)分子及細(xì)胞等多種物質(zhì),探針也具有分子量小、無(wú)免疫原性、修飾簡(jiǎn)單等特點(diǎn)[14-16],因此被廣泛應(yīng)用于藥物生產(chǎn)、醫(yī)學(xué)檢測(cè)等領(lǐng)域[17]。近年來(lái),研究者利用核酸適配體進(jìn)行沙門(mén)氏菌檢驗(yàn),如Duan 等[18]篩選鼠傷寒沙門(mén)氏菌核酸適配體,將其結(jié)合熒光技術(shù)檢測(cè)鼠傷寒沙門(mén)氏菌,其檢出限可達(dá)25 CFU/mL;Xu等[19]結(jié)合金納米顆粒變色效應(yīng)檢測(cè)沙門(mén)氏菌和大腸桿菌O157:H7,當(dāng)有靶標(biāo)出現(xiàn)時(shí),金納米顆粒由紅色變?yōu)樗{(lán)或紫色,其檢出限為105CFU/mL;Yuan 等[20]利用納米金適配體進(jìn)行鼠傷寒沙門(mén)氏菌檢測(cè)時(shí),檢出限可達(dá)7 CFU/mL,實(shí)現(xiàn)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的可視化檢測(cè),且檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)方法一致。
納米金(nano-gold,AuNPs)是金的微小顆粒,其具有優(yōu)異的催化活性和獨(dú)特的光學(xué)特性,能與多種生物大分子結(jié)合,且不影響其生物活性。中等粒徑(10~20 nm)大小的納米金在分散態(tài)下呈紅色,高鹽情況下凝聚成藍(lán)色,而在含有單鏈DNA(ssDNA)條件下,ssDNA 的正電荷堿基自由狀態(tài)暴露,通過(guò)靜電吸附在納米金上,使納米金在高鹽溶液中仍保持穩(wěn)定性,納米金溶液仍為紅色[21-22]。通過(guò)納米金進(jìn)行檢驗(yàn),產(chǎn)生的變色比色反應(yīng),其靈敏度可達(dá)熒光檢測(cè)法的靈敏程度[23-24]。納米金在存在特異性靶標(biāo)的情況下,適配體形成特定三維結(jié)構(gòu),與靶標(biāo)特異性結(jié)合;而未吸附適配體的納米金則在高鹽溶液中發(fā)生聚集,最終使溶液呈深藍(lán)色。
本文通過(guò)配制納米金溶液,結(jié)合已開(kāi)發(fā)的腸炎沙門(mén)氏菌核酸適配體,通過(guò)優(yōu)化腸炎沙門(mén)氏菌適配體濃度,研究納米金-適配體體系的腸炎沙門(mén)氏菌檢測(cè)限、特異性及適用溫度;同時(shí)以人工污染樣品為例,評(píng)價(jià)納米金-適配體的加標(biāo)回收率,從而構(gòu)建一種操作成本低、特異性強(qiáng)的腸炎沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法。同時(shí),通過(guò)更換其他致病菌特異性的適配體,又可進(jìn)行其他致病菌的快捷檢測(cè),具有良好推廣效果。
標(biāo)準(zhǔn)菌株:大腸埃希氏菌(Escherichia coli)標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC6538、腸炎沙門(mén)氏菌(Salmonella Enteritidis)標(biāo)準(zhǔn)菌株CMCC(B)50335,購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌菌種保藏管理中心。
冷鮮雞肉:市售,散裝稱重,于4 ℃保存。
木糖-賴氨酸-硫酸四癸鈉瓊脂(xylose-lysinesodium tetrahydrosulfate agar,XLT4)、腦心浸液肉湯(brain heart infusion broth,BHI)、緩沖蛋白胨水(buffered peptone water,BPW)、M9 基礎(chǔ)培養(yǎng)基(M9 minimal medium)、LB 培養(yǎng)基(Luria-Bertani):廣東環(huán)凱生物科技有限公司;聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone,PVP)(分析純):賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;聚乙二醇20000(polyethylene glycol,PEG)、三羥甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane,Tris]、NaCl、KH2PO4、KCl、MgCl2、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、氯金酸(HAuCl4·4H2O)、檸檬酸三鈉(均為分析純):上海阿拉丁生化股份有限公司;腸炎沙門(mén)氏菌核酸適配體序列參考Joshi 等[25],序列:5'-TAT GGC GGC GTC ACC CGA CGG GGA CTT GAC ATT ATG ACA G-3';引物1和引物2 分別為5'-GGT GAC GCC ATA-3'和5'-CTG TCA TAA TGT C-3'由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
85-2ws 加熱型磁力攪拌器:上海滬析實(shí)業(yè)有限公司;UV1810S 型紫外分光光度計(jì):青島聚創(chuàng)環(huán)保有限公司;LDZX-40AI 立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器:上海申安醫(yī)療器械廠;DH5000AB 型電熱恒溫培養(yǎng)箱:天津泰斯特儀器有限公司;SW-CJ-1F 超凈工作臺(tái):蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。
1.3.1 納米金溶液制備
錐形瓶中加入95.8 mL 超純水和4.2 mL 氯金酸溶液,磁力加熱攪拌器混勻后,加入10 mL 檸檬酸三鈉溶液和5 mL PVP,持續(xù)攪拌加熱至溶液變紅,靜置冷卻至室溫。
1.3.2 檢測(cè)條件優(yōu)化
1.3.2.1 菌種活化及菌懸液制備
3 種試驗(yàn)菌株接種于腦心浸液肉湯并涂布LB 平板劃線,挑取單菌落于10 mL 營(yíng)養(yǎng)肉湯中,37 ℃振蕩培養(yǎng)(150 r/min)至達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。4 ℃、2 850 r/min離心20 min,利用預(yù)冷的PBS 緩沖液(pH7.5)清洗2次,無(wú)菌水重懸,調(diào)整菌液濃度為1×109CFU/mL,此時(shí)OD550nm為6.30。
1.3.2.2 適配體濃度篩選
在96 孔板中加入1×109CFU/mL 的菌液50 μL,再分別加入等體積濃度為0、10、20、50、100、150、200、400、600、800、1 000 nmol/L 的適配體,混勻孵育5 min。加入納米金溶液50 μL,平衡5 min,加入10 μL 5 mol/L NaCl 溶液,平衡5 min 后比色拍照,篩選最佳適配體濃度。
1.3.2.3 適配體-納米金溶液腸炎沙門(mén)氏菌檢測(cè)限測(cè)試
梯度稀釋菌懸液,使菌懸液濃度分別為101~109CFU/mL。96 孔板中分別加入1.3.2.2 中篩選出的最佳適配體濃度的適配體50 μL,再依次加入101~109CFU/mL 菌懸液50 μL,混勻孵育5 min,加入50 μL納米金溶液,平衡5 min,加入10 μL 5 mol/L NaCl 溶液,平衡5 min 后比色拍照,確定腸炎沙門(mén)氏菌的檢測(cè)限。
1.3.2.4 適配體-納米金溶液特異性檢測(cè)
分別加入3 種試驗(yàn)菌株1×109CFU/mL 菌懸液50 μL,加入最佳適配體濃度適配體50 μL,混勻孵育5 min,加入納米金溶液50 μL,平衡5 min,加入10 μL 5 mol/L NaCl 溶液,平衡5 min 后比色拍照,檢測(cè)腸炎沙門(mén)氏菌適配體-納米金溶液的特異性。
1.3.2.5 適配體-納米金溶液的適用溫度測(cè)定
96 孔板中加入50 μL 1×109CFU/mL 的菌液、最佳適配體濃度適配體50 μL,混勻孵育5 min 后,加入納米金溶液50 μL,平衡5 min。加入10 μL 5 mol/L NaCl溶液后,置于15、25、35 ℃的水浴中,測(cè)定該體系的適用溫度。
1.3.3 人工污染樣品檢測(cè)
冷鮮雞肉切塊,生理鹽水沖洗,超凈臺(tái)紫外照射30 min,經(jīng)GB 4789.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)》[26]方法檢測(cè),無(wú)腸炎沙門(mén)氏菌檢出。稱取50 g 雞肉塊為1 份,分別浸入102~109CFU/mL 的菌液中,放置1 h。取出后,利用生理鹽水充分浸泡振蕩30 min。沖洗溶液取50 μL 進(jìn)行平板計(jì)數(shù),另取50 μL 進(jìn)行納米金-適配體檢驗(yàn),以開(kāi)始出現(xiàn)顏色變化所對(duì)應(yīng)的平板計(jì)數(shù)濃度為納米金-適配體的加標(biāo)回收率。
數(shù)據(jù)處理采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行分析,顯著性分析為ANOVA(One-way analysis of variance,the Duncan test),多重比較采用LSD 檢驗(yàn)。
基于納米金溶液在高鹽環(huán)境下所產(chǎn)生的凝聚顏色變化原理[21,27-28],適配體-納米金法檢測(cè)腸炎沙門(mén)氏菌的顏色變化如圖1 所示。若溶液中僅存在納米金,則在高鹽溶液環(huán)境下,會(huì)發(fā)生凝聚現(xiàn)象,使溶液變?yōu)樗{(lán)色;而當(dāng)溶液中存在納米金和適配體時(shí),由于納米金表面吸附了適配體,不會(huì)在高鹽環(huán)境中發(fā)生凝聚,因此溶液仍為紅色;當(dāng)溶液中存在靶標(biāo)菌(腸炎沙門(mén)氏菌)時(shí),適配體與靶標(biāo)細(xì)菌特異性結(jié)合,而未結(jié)合適配體的納米金即在高鹽環(huán)境下發(fā)生聚集,使溶液呈現(xiàn)深藍(lán)色。
圖1 適配體-納米金腸炎沙門(mén)氏菌檢測(cè)體系Fig.1 Aptamer nano gold detection system for Salmonella enteritidis
由圖1 及納米金溶液在高鹽環(huán)境下的凝聚顏色變化原理可知,管1 中包含靶標(biāo)細(xì)菌(腸炎沙門(mén)氏菌)、適配體和納米金,靶標(biāo)菌與適配體結(jié)合呈現(xiàn)的藍(lán)色與未結(jié)合適配體的納米金在高鹽環(huán)境下發(fā)生凝集,使藍(lán)色加深,呈現(xiàn)深藍(lán)色;管2 中只有靶標(biāo)菌及適配體,兩者結(jié)合呈現(xiàn)藍(lán)色;管3 中僅有適配體和納米金,納米金在高鹽環(huán)境下呈現(xiàn)紅色。結(jié)果表明,當(dāng)測(cè)試溶液中包含靶標(biāo)菌時(shí),該體系應(yīng)呈現(xiàn)深藍(lán)色。
最佳適配體濃度篩選結(jié)果如圖2 所示。
圖2 最佳適配體濃度篩選Fig.2 Optimal aptamer concentration screening
由圖2 可知,當(dāng)腸炎沙門(mén)氏菌濃度為109CFU/mL時(shí),分別測(cè)試添加0、10、20、50、100、150、200、400、600、800、1 000 nmol/L 的適配體50 μL,隨著適配體濃度不斷升高,混合溶液的顏色逐漸加深,在200 nmol/L 時(shí)顏色最深(管7),其后增加適配體濃度,適配體數(shù)量多于菌數(shù),多余的適配體與納米金結(jié)合,在高鹽溶液下呈紅色,至1 000 nmol/L 時(shí)適配體數(shù)量遠(yuǎn)多于菌數(shù),溶液呈現(xiàn)紅色。因此選擇適配體200 nmol/L 為最佳適配體添加濃度。
通過(guò)在523 nm 處吸光度與腸炎沙門(mén)氏菌濃度的線性分析結(jié)果見(jiàn)圖3。
圖3 腸炎沙門(mén)氏菌濃度與吸光度的線性關(guān)系Fig.3 Linear relationship between Salmonella enteritidis concentration and absorbance value
由圖3 可知,在103~107CFU/mL 菌液濃度下,兩者有較好的線性關(guān)系,線性方程:y=0.187 8x-0.146(R2=0.991 3),檢測(cè)限為9.3×101CFU/mL。
3f 1H NMR(CDCl3) δ:7.91-7.79(m,2 H),7.77-7.75(m,1 H),7.56-7.53(m,1 H),7.37-7.33(m,2 H),7.27-7.16(m,1 H),2.43(s,6 H).
在體系中分別添加101~109CFU/mL 的腸炎沙門(mén)氏菌,其顏色變化在圖4 中顯示。
圖4 適配體-納米金溶液在腸炎沙門(mén)氏菌濃度不同時(shí)的顏色變化Fig.4 Color changes of aptamer nano gold solution at different concentrations of Salmonella enteritidis
由圖4 可知,當(dāng)沒(méi)有腸炎沙門(mén)氏菌存在時(shí),混合溶液為紅色;當(dāng)溶液中有靶標(biāo)菌存在時(shí),適配體與靶標(biāo)菌結(jié)合,部分納米金被未與靶標(biāo)菌結(jié)合的適配體保護(hù),保持紅色,而未與適配體結(jié)合的納米金顆粒在鹽溶液環(huán)境下呈現(xiàn)藍(lán)色,最終使溶液呈現(xiàn)紫紅色;隨著靶標(biāo)菌數(shù)不斷增加,適配體完全與靶標(biāo)菌結(jié)合,納米金顆粒暴露在鹽溶液環(huán)境下凝集,最終使混合溶液呈現(xiàn)藍(lán)色。
利用適配體-納米金溶液檢測(cè)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌及腸炎沙門(mén)氏菌,檢測(cè)反應(yīng)體系的特異性,試驗(yàn)結(jié)果如圖5 所示。
圖5 適配體-納米金溶液腸炎沙門(mén)氏菌的特異性Fig.5 Specificity of aptamer nano gold solution for Salmonella enteritidis
由圖5 可知,腸炎沙門(mén)氏菌混合溶液出現(xiàn)顏色變化,其他兩種菌的混合溶液則依然為紅色。當(dāng)反應(yīng)體系中存在靶標(biāo)菌時(shí),由于適配體與靶標(biāo)菌結(jié)合呈現(xiàn)藍(lán)色,納米金溶液在高鹽環(huán)境下呈現(xiàn)紅色,最終呈現(xiàn)出深藍(lán)色(管3);而其他細(xì)菌與適配體無(wú)法特異性結(jié)合,納米金與適配體結(jié)合,從而在高鹽溶液下保護(hù)納米金顆粒,使混合溶液依舊為紅色(管1、管2)。
適配體-納米金溶液腸炎沙門(mén)氏菌體系在不同溫度下的反應(yīng)見(jiàn)圖6。
圖6 適配體-納米金溶液腸炎沙門(mén)氏菌體系在不同溫度下的反應(yīng)Fig.6 Reaction of aptamer nano gold solution Salmonlla enteritidis system at different temperatures
如圖6 所示,在相同的添加量下,改變反應(yīng)體系的環(huán)境溫度,結(jié)果無(wú)明顯差異。表明該反應(yīng)體系在日常室溫條件下(15~35 ℃)可以使用,環(huán)境溫度變化對(duì)該反應(yīng)體系的檢測(cè)效果無(wú)明顯影響。
表1 適配體-納米金溶液檢測(cè)腸炎沙門(mén)氏菌與平板計(jì)數(shù)法的對(duì)比Table 1 Comparison of Salmonella enteritis detection with plate counting method
由表1 可知,基于核酸適配體的納米金比色法檢測(cè)腸炎沙門(mén)氏菌的方法加標(biāo)回收率為93.68%~117.89%。與平板計(jì)數(shù)方法檢測(cè)腸炎沙門(mén)氏菌的結(jié)果沒(méi)有明顯差異,表明適配體-納米金溶液可以靈敏地檢測(cè)出食品中的腸炎沙門(mén)氏菌污染。
本研究建立了一種基于核酸適配體的納米金比色法檢測(cè)腸炎沙門(mén)氏菌,本方法可以特異性檢測(cè)腸炎沙門(mén)氏菌,對(duì)其他食源性致病菌無(wú)特異反應(yīng)。通過(guò)條件優(yōu)化,在適配體濃度200 nmol/L 下,腸炎沙門(mén)氏菌的最低檢測(cè)限為9.3×101CFU/mL,其線性范圍為103~107CFU/mL,線性方程為y=0.187 8x-0.146(R2=0.991 3)。檢測(cè)人工污染樣品的加標(biāo)回收率為93.68%~117.89%。
本研究建立的快捷、可視的進(jìn)行腸炎沙門(mén)氏菌檢測(cè)的方法,利用納米金為顯色信號(hào),無(wú)需連接信號(hào)轉(zhuǎn)換器,操作簡(jiǎn)便,可應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)分析檢測(cè);對(duì)比平板計(jì)數(shù)方法,其結(jié)果無(wú)明顯差異,該方法可以特異、準(zhǔn)確地檢測(cè)食品中腸炎沙門(mén)氏菌污染情況,且無(wú)需進(jìn)行樣品采集、處理、培養(yǎng)等過(guò)程,操作時(shí)間大大縮短,技術(shù)要求降低,提升檢測(cè)效率;同時(shí)該方法通過(guò)選擇特異性識(shí)別菌種的核酸適配體,配合納米金在高鹽環(huán)境下的顏色變化,實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)。此外,篩選識(shí)別不同食源性致病菌的適配體時(shí),僅需調(diào)整改變檢測(cè)體系內(nèi)適配體,其他成分無(wú)需改變(成分濃度根據(jù)檢測(cè)靶標(biāo)菌特性調(diào)整),即可實(shí)現(xiàn)不同致病微生物的檢測(cè),具有良好的通用性。