宋晶晶，姜蕾，侯吉超，吳斌，呂澤，張劍林，夏娜*

（1.喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，新疆 喀什 844006；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；3.新疆理工學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，新疆 阿克蘇 843000）

管花肉蓯蓉為列當(dāng)科管花肉蓯蓉[Cistanche tubulosa（Schenk）Wight]的干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖，現(xiàn)代研究表明，人工管花肉蓯蓉含有苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜苷類、木脂素類、多糖類、生物堿類等多種生物活性物質(zhì)，具有增強(qiáng)免疫力、抗疲勞、抗衰老、通便、保肝、壯陽及益智等功效[1-4]，可用于臨床治療腎陽不足、精血虧虛、陽痿不孕、腰膝酸軟、筋骨無力、腸燥便秘等癥[5]。管花肉蓯蓉天然生長于半荒漠和荒漠地區(qū)，具有極強(qiáng)的抗旱、抗寒、耐鹽堿特性，主要分布在新疆、甘肅、內(nèi)蒙古等地，因其功效顯著、長于沙漠被美譽(yù)為“沙漠人參”[6-8]。近年肉蓯蓉成為治理荒漠的伴生產(chǎn)物，對肉蓯蓉產(chǎn)業(yè)化起到極大的促進(jìn)作用。紅柳和梭梭樹，作為肉蓯蓉寄主植物，促進(jìn)了肉蓯蓉的人工種植產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，同時，延長了產(chǎn)業(yè)加工鏈、拓寬了經(jīng)濟(jì)附帶產(chǎn)業(yè)，經(jīng)濟(jì)價值顯著提高。

我國作為世界上葡萄種植及葡萄酒生產(chǎn)大國，整體產(chǎn)業(yè)呈現(xiàn)穩(wěn)步上升的趨勢[9]。目前，我國葡萄種植面積為1 275 萬hm2，占全球總面積的11.16%[10-11]。新疆具有悠久的葡萄栽培歷史和得天獨(dú)厚的氣候條件，2019 年，葡萄栽培面積逐漸擴(kuò)大到14.33 萬hm2，產(chǎn)量270 萬t；葡萄干產(chǎn)量25.2 t，占我國產(chǎn)量95%以上[12-13]。新疆的葡萄市場處于供過于求的狀態(tài)，鮮食葡萄沒有穩(wěn)定的銷售渠道，致使葡萄大量堆積，造成極大浪費(fèi)的同時導(dǎo)致了直接的經(jīng)濟(jì)損失。

隨著我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展，人們的健康保健意識也逐漸增強(qiáng)，開始對養(yǎng)生較為關(guān)注，同時，飲食方式也發(fā)生了巨大改變，一些功能性食品興起，功能性酒也應(yīng)運(yùn)而生，并占據(jù)了一定的市場[14-15]。本研究旨在將新疆特色植物肉蓯蓉與鮮食葡萄木納格兩種植物原料中加入專一酵母菌株，經(jīng)過特定的微生物代謝途徑能使原料中的營養(yǎng)物質(zhì)更好地保存，并能提高浸提液中的可溶性固形物的提取率，從而提高產(chǎn)品中有效功能性成分的含量，同時轉(zhuǎn)化為更易被人體吸收、利用的產(chǎn)物[16-18]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

管花肉蓯蓉、木納格葡萄：市售；酵母菌：喀什大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 儀器與設(shè)備

LE2002E/02 電子天平：梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；MJX-160-Z 霉菌培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LDZX-50KB 型立式蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械有限公司；SXKW 數(shù)顯控溫電熱套：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；LB32T LB-90T 手持糖度儀：邁德施（上海）分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程：

1.3.2 肉蓯蓉水提物的制備

參考葛繼紅等[19]的提取方法稍作改動，選取品質(zhì)緊致、色澤淡黃、無變質(zhì)的干肉蓯蓉。將干肉蓯蓉粉碎過20 目篩網(wǎng)，將肉蓯蓉顆粒與蒸餾水按1∶10（g/mL）的比例提取5 h，在沸水浴條件下回流提取2 次，過100 目濾網(wǎng)，抽濾，濃縮備用。

1.3.3 葡萄汁的制備

去除霉?fàn)€及成熟度不一致的葡萄鮮果，分選后，除梗、破碎，經(jīng)壓榨取汁，低溫（4 ℃）貯藏，備用。

1.3.4 肉蓯蓉葡萄酒的發(fā)酵工藝

按一定比例接入酵母菌進(jìn)行發(fā)酵，置于恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵，待發(fā)酵液的殘?zhí)橇拷抵? g/L 時，發(fā)酵結(jié)束[20]；取上清液，4 000 r/min 條件下離心10 min 后，85 ℃殺菌30 min，得到肉蓯蓉葡萄酒。

1.3.5 肉蓯蓉葡萄酒單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

量取200 mL 原料（肉蓯蓉∶葡萄汁）質(zhì)量比為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6 的肉蓯蓉葡萄發(fā)酵原液于潔凈的錐形瓶中，考察酵母菌接種量（0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%）、發(fā)酵溫度（18、20、22、24、26 ℃）、發(fā)酵時間（4、5、6、7、8 d）對發(fā)酵結(jié)束后測定酒精度及感官評分的影響，重復(fù)3 次平行試驗(yàn)。

1.3.6 肉蓯蓉葡萄發(fā)酵液響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

以肉蓯蓉葡萄酒的酒精度（Y1）及感官評分（Y2）為響應(yīng)值，選取對肉蓯蓉葡萄酒影響較大的3 個因素，酵母接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）、原料質(zhì)量比（C）為考察因素，利用響應(yīng)面軟件Design-Expert.V8.0.6 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)。響應(yīng)面的試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.7 基本指標(biāo)的測定

1.3.7.1 理化指標(biāo)

酒精度、干浸出物、總酸、揮發(fā)酸、二氧化硫采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的方法檢測[21]，可溶性固形物采用手持糖度儀測定，pH值采用酸度計(jì)測定。

1.3.7.2 微生物指標(biāo)

菌落總數(shù)按照GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》規(guī)定方法進(jìn)行測定；大腸菌群按照GB 4789.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》規(guī)定方法進(jìn)行測定。

1.3.8 肉蓯蓉葡萄酒的感官評定

由15 名完成《葡萄酒品嘗學(xué)》課程的食品專業(yè)人員經(jīng)培訓(xùn)組成感官評定小組，分別對肉蓯蓉葡萄酒的外觀、色澤、香氣、滋味4 個指標(biāo)進(jìn)行感官評價，所有指標(biāo)分為優(yōu)、良、中、差4 個等級。要求身體健康且對酒精無過敏性癥狀人員作為感官評定組成員，樣品評鑒完成后用清水漱口，3 min 后評鑒下一個樣品[22]，具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 肉蓯蓉葡萄酒感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation cniteria of Cistanche deserticola wine

1.3.9 體外抗氧化活性測定

1.3.9.1 DPPH 自由基清除能力的測定

DPPH 自由基清除能力的測定參照楊冰鑫等[23]的方法，略作改動。DPPH 自由基清除率計(jì)算公式如下。

X=（A0-Ai+Aj）/A0×100

式中：X 為DPPH 自由基清除率，%；A0為空白組的吸光度；Ai為樣品溶液的吸光度；Aj為無水乙醇代替DPPH 溶液時測得對應(yīng)濃度的吸光度。

1.3.9.2 ABTS+自由基清除能力的測定

ABTS+自由基清除能力的測定參考秦晉穎等[24]的方法，略作改動。ABTS+自由基清除率計(jì)算公式如下。

Y=（A0-Ai）/A0×100

式中：Y 為ABTS+自由基清除率，%；A0為ABTS 溶液與樣品溶劑溶液混合液的吸光度；Ai為待測溶液與ABTS 溶液混合液的吸光度。

1.3.9.3 ·OH 清除能力的測定

·OH 清除能力的測定參照Luo 等[25]的方法，略作改動?！H 清除率計(jì)算公式如下。

Z=（A0-A1+A2）/A0×100

式中：Z 為·OH 清除率，%；A1為37 ℃下反應(yīng)30 min 后在波長510 nm 處的吸光度；A0為蒸餾水替代樣品為空白對照在510 nm 處的吸光度；A2為蒸餾水替代水楊酸在510 nm 處的吸光度。

1.3.9.4 鐵離子還原能力的測定

參照Kilani 等[26]的測定方法，略作改動，制備鐵離子還原能力（ferric reducing ability of plasma，F(xiàn)RAP）工作液，于37 ℃恒溫水浴鍋中貯藏備用。分別取0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08 mL 肉蓯蓉葡萄酒于試管中，用純水補(bǔ)充至2 mL，取稀釋好的肉蓯蓉葡萄酒6 μL，加入預(yù)熱至37 ℃的FRAP 工作液180 μL、超純水18 μL，避光精確反應(yīng)5 min，酶標(biāo)儀測定593 nm 處的吸光度，以雙蒸水為空白對照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過Origin 85 以及Design-Expert.V8.0.6軟件進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 酵母菌接種量對肉蓯蓉葡萄酒酒精度及感官評分的影響

酵母菌接種量對肉蓯蓉葡萄酒酒精度及感官評分的影響如圖1 所示。

圖1 酵母菌接種量對肉蓯蓉葡萄酒酒精度及感官評分的影響Fig.1 Effect of yeast inoculum on the alcohol content and sensory score of Cistanche deserticola wine

由圖1 可知，當(dāng)酵母菌接種量較少時，肉蓯蓉葡萄酒中的糖不能完全被酵母菌利用轉(zhuǎn)化，故酒精度較低；當(dāng)酵母菌接種量較大時，酵母菌會大量生長繁殖消耗發(fā)酵液中的糖，用于生成酒精的底物量減少[27]。因此，酵母菌接種量為0.08%時較為合適。

2.1.2 發(fā)酵溫度對肉蓯蓉葡萄酒酒精度及感官評分的影響

發(fā)酵溫度對肉蓯蓉葡萄酒酒精度及感官評分的影響如圖2 所示。

圖2 發(fā)酵溫度對肉蓯蓉葡萄酒酒精度及感官評分的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on the alcohol content and sensory score of Cistanche deserticola wine

由圖2 可知，隨發(fā)酵溫度升高，微生物新陳代謝越來越旺盛，會較早出現(xiàn)疲勞現(xiàn)象而停止發(fā)酵，此后，微生物代謝降低，酒精度隨著發(fā)酵溫度的不斷升高呈先上升后下降趨勢，而較低的溫度會使發(fā)酵速度減緩，使得發(fā)酵時間變長，發(fā)酵較為徹底[28]。當(dāng)溫度達(dá)到24 ℃時，酒精度最高，但沒有達(dá)到最佳口感。因此，選擇發(fā)酵溫度為22 ℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.3 原料質(zhì)量比肉蓯蓉葡萄酒對酒精度及感官評分的影響

原料質(zhì)量比對肉蓯蓉葡萄酒酒精度及感官評分的影響如圖3 所示。

圖3 原料質(zhì)量比對肉蓯蓉葡萄酒酒精度及感官評分的影響Fig.3 Effect of raw-material ratio on the alcohol content and sensory score of Cistanche deserticola wine

由圖3 可知，肉蓯蓉葡萄酒的原料質(zhì)量比為1∶5時，酵母自身代謝最快，使得發(fā)酵液中糖轉(zhuǎn)化為酒精的速度最快，酒精度最高，隨著肉蓯蓉比例的增加，發(fā)酵液中糖含量升高，可能對發(fā)酵過程產(chǎn)生消極的影響愈明顯。當(dāng)原料質(zhì)量比為1∶4 時，感官評分達(dá)到最大值，因此，選擇原料質(zhì)量比1∶4 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.4 發(fā)酵時間對肉蓯蓉葡萄酒酒精度及感官評分的影響

發(fā)酵時間對肉蓯蓉葡萄酒酒精度及感官評分的影響如圖4 所示。

圖4 發(fā)酵時間對肉蓯蓉葡萄酒酒精度及感官評分的影響Fig.4 Effect of fermentation time on the alcohol content and sensory score of Cistanche deserticola wine

由圖4 可知，當(dāng)發(fā)酵時間較短時，導(dǎo)致發(fā)酵不徹底，糖沒有被酵母充分利用，導(dǎo)致酒體寡淡；當(dāng)發(fā)酵時間過長時，雖發(fā)酵徹底，酒精度較高，但口感偏酸，并伴有苦味，還因進(jìn)入酵母衰亡期使其自溶，致肉蓯蓉葡萄酒口感偏差。因此，發(fā)酵時間為7 d 時最合適。

2.2 肉蓯蓉葡萄酒發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，綜合考慮選取以酵母菌接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）、原料質(zhì)量比（C）為自變量，以肉蓯蓉葡萄酒的酒精度（Y1）和感官評分（Y2）為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)，結(jié)果如表3～表5 所示。

表3 肉蓯蓉葡萄酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Experimental design and analysis of response surface in fermentation conditions of Cistanche deserticola wine

根據(jù)肉蓯蓉葡萄酒響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行多元回歸方程擬合，建立以肉蓯蓉葡萄酒酒精度和感官評分為評價指標(biāo)的擬合方程：酒精度Y1= 5.64+0.13A+0.18B+0.22C+0.050AB+0.043AC-0.033BC-0.039A2-0.074B2-0.13C2；感官評分Y2=92.20+1.13A+2.13B+4.25C+1.50AB+0.25AC-0.25BC-4.10A2-2.10B2-4.35C2。

由表4、表5 可知，肉蓯蓉葡萄酒酒精度與感官評分模型回歸方程的相關(guān)系數(shù)分別為R2=0.991 8、R2=0.984 6，調(diào)整復(fù)相關(guān)系數(shù)分別為R2Adj=0.981 3、R2Adj=0.964 8。2 個多元回歸模型P 值＜0.01，說明模型極顯著；多元回歸模型的失擬項(xiàng)P 值＞0.05，說明無失擬因素存在，對模型是有利的。以酒精度為響應(yīng)值時，模型中A、B、C、B2、C2影響極顯著（P＜0.01），A2和交互項(xiàng)AB、AC 影響顯著（P＜0.05），由F 檢驗(yàn)可以得到因子貢獻(xiàn)率為C＞B＞A，即3 個因素對肉蓯蓉葡萄酒酒精度的影響主次順序?yàn)镃（原料質(zhì)量比）＞B（發(fā)酵溫度）＞A（接種量）。以感官評分為響應(yīng)值時，模型中B、C、A2、B2、C2影響極顯著（P＜0.01），A 和交互項(xiàng)AB 影響顯著（P＜0.05），由F 檢驗(yàn)可以得到因子貢獻(xiàn)率為C＞B＞A，即3 個因素對肉蓯蓉葡萄酒感官評分的影響主次順序?yàn)镃（原料質(zhì)量比）＞B（發(fā)酵溫度）＞A（接種量）。

表4 以肉蓯蓉葡萄酒酒精度為評價指標(biāo)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 4 Analysis of variance of response surface test based on the alcohol content of Cistanche deserticola wine as an evaluation index

表5 以肉蓯蓉葡萄酒感官評分為評價指標(biāo)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 5 Analysis of variance of response surface test based on the sensory score of Cistanche deserticola wine as an evaluation index

根據(jù)肉蓯蓉葡萄酒感官評分回歸方程得出不同因子的響應(yīng)面分析圖，結(jié)果見圖5。

圖5 各因素交互作用響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface of factor interaction

由圖5 可知，在Y1模型中因素A 與因素B 之間所形成的響應(yīng)面曲面坡度在兩因素交互作用響應(yīng)面圖中最為陡峭，即因素A 與因素B 之間的交互作用對肉蓯蓉葡萄酒酒精度的影響最大。在Y2模型中因素A與B 之間所形成的響應(yīng)面曲面坡度在兩因素交互作用響應(yīng)面圖中最為陡峭，即因素A 與B 之間其交互作用對肉蓯蓉葡萄酒酒精度的影響最大。

應(yīng)用響應(yīng)面尋優(yōu)分析方法對回歸模型進(jìn)行分析，尋找最優(yōu)響應(yīng)結(jié)果為酵母接種量0.06%、發(fā)酵溫度25.96 ℃、原料質(zhì)量比1∶4.12。此優(yōu)化條件下發(fā)酵后的肉蓯蓉葡萄酒酒精度預(yù)測值為5.603%vol，感官評分預(yù)測值為93.24。為驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性，考慮實(shí)際的操作情況，將發(fā)酵工藝參數(shù)調(diào)整為酵母添加量0.06%、發(fā)酵溫度26 ℃、原料質(zhì)量比1∶4，在此發(fā)酵工藝條件下，進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，肉蓯蓉葡萄酒的酒精度實(shí)際值為5.60%vol，感官評分實(shí)際值為93，結(jié)果與預(yù)測值相差甚微，證明該回歸模型可靠。

2.2.2 基本指標(biāo)的測定

在最優(yōu)發(fā)酵工藝條件下制備的肉蓯蓉葡萄酒的酒精度為5.60% vol，干浸出物29.64 g/L，總酸6.82 g/L（以酒石酸計(jì)），總糖35.72 g/L（以葡萄糖計(jì)），大腸菌群≤3 MPN/100 mL，菌落總數(shù)≤50 cfu/mL，均符合國家標(biāo)準(zhǔn)的要求。

2.2.3 肉蓯蓉葡萄酒的抗氧化活性

肉蓯蓉葡萄酒的抗氧化活性檢測結(jié)果見表6。

表6 肉蓯蓉葡萄酒的抗氧化活性Table 6 Antioxidant activity of Cistanche deserticola wine

由表6 可知，肉蓯蓉葡萄酒對DPPH·、ABTS+·、·OH的清除率及還原能力分別為96.53%、95.64%、96.86%及97.39，有較好的自由基清除能力且有一定的還原能力。許多果實(shí)中因含有多酚類物質(zhì)而表現(xiàn)出抗氧化活性[29]，肉蓯蓉中含有苯乙醇苷類或環(huán)烯醚萜苷類、木質(zhì)素類和多糖類物質(zhì)，此類物質(zhì)成分具有一定的抗氧化活性[30]。何夢夢等[31]的研究表明，肉蓯蓉水提物中含有較高濃度的多酚類物質(zhì)，故其具有很好的抗氧化活性，能有效清除自由基。綜上，肉蓯蓉葡萄酒具有一定的抗氧化活性。

3 結(jié)論

采用單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面設(shè)計(jì)分析得出肉蓯蓉葡萄酒發(fā)酵的最優(yōu)工藝為酵母菌接種量0.06%、發(fā)酵溫度26 ℃、原料質(zhì)量比1∶4，此條件下得到的酒味清香、肉蓯蓉與葡萄酒氣味均衡，口感純正、酒香愉悅，酒精度5.60%vol，感官評分93。抗氧化活性分析結(jié)果表明，其還原能力發(fā)酵前后有一定的變化，發(fā)酵后的肉蓯蓉葡萄酒DPPH·、ABTS+·、·OH 的清除率優(yōu)于發(fā)酵前的肉蓯蓉與葡萄汁混合物，肉蓯蓉葡萄酒具有一定的抗氧化作用。肉蓯蓉葡萄酒的研制豐富了新疆葡萄酒品類，為新疆特色植物肉蓯蓉復(fù)合酒的產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。