馬旭華，李亞蕾，羅瑞明，張杏亞

（寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

動(dòng)物宰后缺氧缺血狀態(tài)激活了細(xì)胞凋亡酶，在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的同時(shí)，還誘導(dǎo)了熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）的合成，HSPs主要功能是作為分子伴侶與抗凋亡因子，通過(guò)阻止宰后肌肉成熟過(guò)程中的細(xì)胞凋亡、蛋白降解等對(duì)肌肉結(jié)構(gòu)發(fā)揮防護(hù)作用[1]。諸多研究表明，HSPs作為生物標(biāo)記物在預(yù)測(cè)嫩度、肉色、保水性方面具有一定潛力[1-2]。丁振江[3]研究發(fā)現(xiàn)HSP27可能通過(guò)抑制內(nèi)源酶活性從而延緩宰后牛肉成熟。Bernard等[4]研究夏洛萊牛胸部肌肉時(shí)發(fā)現(xiàn)，HSP27表達(dá)下調(diào)能夠改善肉嫩度、多汁性和風(fēng)味。HSP70家族是HSPs最重要的亞族之一，HSPA6是其家族成員之一，在活體細(xì)胞中的各個(gè)部分組成性地表達(dá)[5]，其功能發(fā)揮對(duì)與ATP結(jié)合、ATP-ADP轉(zhuǎn)化或HSPA6磷酸化誘發(fā)構(gòu)象變化具有依賴性[6]。動(dòng)物宰后缺氧缺血信號(hào)會(huì)調(diào)節(jié)組織能量水平變化，鮮肉貯藏期間線粒體結(jié)構(gòu)受損、功能失調(diào)、呼吸功能中斷等引起氧化還原狀態(tài)紊亂，使能量物質(zhì)發(fā)生不同程度的降解。羅輝等[7]研究發(fā)現(xiàn)宰后牛肉中能量基本物質(zhì)水平持續(xù)下降。Kopuzlu等[8]研究表明肉牛宰后初期肌肉內(nèi)葡萄糖及糖原有氧分解迅速轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)氧酵解，產(chǎn)生乳酸，pH值持續(xù)下降，體內(nèi)ATP酶催化ATP水解。能量代謝在宰后肌肉向肉品轉(zhuǎn)化過(guò)程中與酸度、肉色、嫩度、保水性及風(fēng)味等緊密相關(guān)。

蛋白質(zhì)組學(xué)是研究特定狀態(tài)或時(shí)期下組織或細(xì)胞全部蛋白質(zhì)水平變化。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)方法在肉品質(zhì)變化機(jī)制研究方面已有較為廣泛的應(yīng)用[9-10]。在3D分離基礎(chǔ)上，4D-非標(biāo)記定量（4D-label free quantification，4D-LFQ）蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)增加了離子淌度參數(shù)，主要根據(jù)離子截面及形狀進(jìn)行分離，為測(cè)定秦川牛肉組織這種復(fù)雜體系樣本提供更多的可能。Jia等[11]采用Label-free蛋白質(zhì)組學(xué)研究牛胸最長(zhǎng)肌肌漿蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)檢測(cè)活體組織或宰后牛胸最長(zhǎng)肌中Peroxiredoxin-6含量可預(yù)測(cè)嫩度變化。Boudon等[12]采用Label-free蛋白質(zhì)組學(xué)研究夏洛萊×奧布拉克牛肉嫩度生物標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)HSP90AA1可用于肉嫩度預(yù)測(cè)推定候選蛋白質(zhì)。魏燕超[13]采用穩(wěn)定同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)（isobaric tag for relative and absolute quantitation，iTRAQ）結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技術(shù)研究HSPs表達(dá)水平與羊肉嫩度之間關(guān)系，發(fā)現(xiàn)HSPs表達(dá)水平?jīng)Q定了不同品質(zhì)羊肉嫩度。綜上，蛋白質(zhì)組學(xué)可應(yīng)用于研究與肉品質(zhì)相關(guān)的蛋白質(zhì)，包括HSPs。HSP70是HSPs家族中最重要亞族之一，目前鮮有研究闡釋宰后成熟期間肉中HSP70家族成員與能量水平關(guān)系，因此，本研究以宰后4 ℃條件下秦川牛背最長(zhǎng)肌為研究對(duì)象，測(cè)定其能量水平變化和肉品質(zhì)變化，采用4D-LFQ技術(shù)分析不同貯藏期牛肉蛋白質(zhì)水平變化，結(jié)合基因本體注釋（gene ontology，GO）、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析，從分子層面明確HSPA6參與調(diào)控的通路，研究HSPA6影響能量代謝的途徑，為后續(xù)從HSPA6變化角度闡明宰后肌肉組織能量代謝和品質(zhì)變化機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

體質(zhì)量相近的25 月齡秦川公牛由寧夏尚農(nóng)生物科技產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司提供。

三氟乙酸、碘代乙酰胺、二硫蘇糖醇、尿素、三乙基碳酸氫銨 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；胰酶美國(guó)Promega公司；蛋白質(zhì)酶抑制劑 上海Calbiochem公司；乙腈 美國(guó)Fisher Chemical公司；甲酸 瑞士Fluka公司；BCA試劑盒 江蘇碧云天公司；考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清白蛋白 上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

NAI-CS150超聲波細(xì)胞破碎機(jī) 上海那艾精密儀器有限公司；MiniVac Alpha冷凍離心機(jī) 美國(guó)Scan Speed公司；timsTOF Pro質(zhì)譜儀、NanoElute超高效液相色譜儀德國(guó)Bruker公司；Forma 994－80 ℃超低溫冰箱美國(guó)Thermo公司；TA-XT plus質(zhì)構(gòu)儀 英國(guó)Stable Micro Systems公司；UV-1200紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

采樣對(duì)象選用屠宰后的左胴體背最長(zhǎng)肌，背最長(zhǎng)肌樣品平均分割成3 份，共計(jì)15 個(gè)樣品（每個(gè)樣品約150 g）。樣品分割成塊編號(hào)后用聚乙烯薄膜包裹，貯存于4 ℃的冰箱中。采集貯存0、2、4、6、8 d的樣品用于測(cè)定秦川牛肉品質(zhì)指標(biāo)；對(duì)于不便立即測(cè)定指標(biāo)的樣本，將手術(shù)刀及鑷子進(jìn)行滅菌處理后，分別采集不同成熟期樣本10 g置于液氮中，速凍2 h后轉(zhuǎn)移至－80 ℃冰箱保存，待檢測(cè)分析使用。

1.3.2 能量基本物質(zhì)含量的測(cè)定

精確稱50 mg樣品置于離心管中，加入4 ℃預(yù)冷0.6 mol/L高氯酸和1 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）混合液1 mL，勻漿2 min后離心，4 ℃、10 000×g條件下10 min，取700 μL上清液加0.2 mL 1 mol/L的NaOH溶液。搖勻反應(yīng)5 min，取0.5 mmol/L上清液過(guò)膜后－80 ℃冰箱保存。高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法檢測(cè)三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、單磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide，NADH）含量[14]。HPLC條件：流動(dòng)相：220 mmol/L硫酸鉀（溶劑為體積分?jǐn)?shù)10%甲醇溶液，四丁基氫氧化銨調(diào)pH值至6.5），等比洗脫，流速設(shè)置為0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為254 nm。

1.3.3 剪切力測(cè)定

參考李桂霞等[15]方法稍作修改。取肉塊約3 cm×6 cm×6 cm，除去表面脂肪和筋膜，置于蒸煮袋內(nèi)，抽去袋內(nèi)空氣，使肉塊表面緊貼蒸煮袋，密封袋口，置于80 ℃水浴鍋加熱至中心溫度70 ℃后立即取出，冷卻至室溫，將肉樣沿肌纖維方向用直徑1.27 cm采樣器平行取4 個(gè)肉柱，然后用TA-XT plus質(zhì)構(gòu)儀V型活動(dòng)剪切刀架垂直于肌纖維方向測(cè)定其剪切力，剪切速率與剪切距離分別為1.5 mm/s、40 mm，4 次測(cè)定取其平均值。

1.3.4 肌原纖維小片化指數(shù)的測(cè)定

參考Culler等[16]方法稍作調(diào)整。稱取經(jīng)過(guò)修整的1 g肉樣于冷凍研磨儀攪碎，放入離心管加入經(jīng)過(guò)預(yù)冷（4 ℃）的10 mL緩沖液（含KCl 100 mmol/L、K2HPO411.2 mmol/L、KH2PO48.8 mmol/L、EGTA 1 mmol/L、MgCl21 mmol/L、NaN31 mmol/L），1 200 r/min勻漿2～3 次（每次1 min，兩次間隔1 min），放入離心管4 ℃、1 000×g離心15 min收集上清液，加入10 mL緩沖液再次勻漿后離心，去上清液，再加入5 mL預(yù)冷緩沖液使沉淀充分懸浮后用200 目篩過(guò)濾沉淀，再用5 mL緩沖液清洗離心管后過(guò)200 目篩，收集緩沖液，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白質(zhì)量濃度。用緩沖液將蛋白質(zhì)量濃度稀釋至0.5 mg/mL，在595 nm波長(zhǎng)處重復(fù)測(cè)定3 次吸光度，取平均值帶入式（1）計(jì)算肌纖維小片化指數(shù)（myofibril fragmentation index，MFI）。

1.3.5 離心損失率的測(cè)定

參考Zhang等[17]方法并稍作調(diào)整。將不同貯藏時(shí)間的牛肉樣品分別切成4.0 cm×0.5 cm×0.5 cm，于10 mL離心管中稱質(zhì)量，40 000×g、4 ℃離心15 min，吸干肉樣表面水分，稱其質(zhì)量。按式（2）計(jì)算離心損失率。

式中：m1為離心前樣品質(zhì)量/g；m2為離心后樣品質(zhì)量/g。

1.3.6 4D-LFQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測(cè)蛋白質(zhì)含量

參照張杏亞等[18]的方法提取蛋白質(zhì)并測(cè)定蛋白質(zhì)含量，參照羅輝等[19]的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索、生物信息學(xué)分析，篩選差異蛋白質(zhì)利用DAVID 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）作GO、KEGG通路分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，運(yùn)用SPSS 24軟件單因素方差分析和Duncan法進(jìn)行比較，確定數(shù)據(jù)間是否具有顯著性差異，P＜0.01為差異極顯著，P＜0.05為差異顯著，利用Origin 8.0軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 宰后牛肉貯藏過(guò)程中品質(zhì)的變化

2.1.1 HSP70家族成員篩選及其表達(dá)量變化

采用4D-LFQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究秦川牛宰后蛋白質(zhì)組的豐富度變化，利用Maxquant（v1.6.6.0）軟件對(duì)所得的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行質(zhì)譜檢索，共鑒定出1 149 個(gè)蛋白質(zhì)，通過(guò)逐一搜索，僅篩選出HSP70家族成員HSPA6，其表達(dá)量變化情況如表1所示。HSPA6表達(dá)量在宰后0 d最大（1.51），隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)呈顯著下降趨勢(shì)（P＜0.05）。宰后初期由于動(dòng)物缺血缺氧引起應(yīng)激反應(yīng)，HSPA6作為應(yīng)激分子迅速被合成，因此0 d時(shí)其表達(dá)量較高，隨成熟時(shí)間延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)降解程度加劇，使其表達(dá)量顯著降低。0～4 d其表達(dá)量降幅較低，表明少量HSPA6發(fā)生降解；4～8 d降幅較大，表明HSPA6降解主要發(fā)生在成熟后期。因此，牛肉宰后的成熟初期HSPA6能夠較好地執(zhí)行其功能。

表1 宰后貯藏過(guò)程中秦川牛背最長(zhǎng)肌HSPA6表達(dá)量的變化Table 1 Changes in HSPA6 expression in beef Longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle during storage

2.1.2 能量代謝基本物質(zhì)ATP、ADP、AMP、NADH含量的變化

采用HPLC法檢測(cè)宰后秦川牛背最長(zhǎng)肌能量代謝基本物質(zhì)含量，結(jié)果如表2所示。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，ATP含量呈顯著下降趨勢(shì)（P＜0.05），由0 d時(shí)的9.63 μmol/g下降至8 d時(shí)0.50 μmol/g，0～2 d期間下降速率較快，2～8 d降幅較緩，8 d時(shí)基本檢測(cè)不出ATP。ADP、AMP的含量在整個(gè)成熟期（0～8 d）均呈顯著下降趨勢(shì)。結(jié)果表明，宰后由于有氧代謝逐漸減弱，組織中ATP迅速發(fā)生降解，促使糖酵解被激活，同時(shí)引起AMP、ADP含量下降。貯藏過(guò)程中NADH含量變化可反映組織細(xì)胞中氧化還原和能量變化狀態(tài)。0～8 d期間NADH含量逐漸降低，引起該現(xiàn)象的原因可能是宰后肌肉組織細(xì)胞中線粒體受損，呼吸功能失調(diào)[18]。

表2 秦川牛背最長(zhǎng)肌在貯藏時(shí)間過(guò)程中ATP、ADP、AMP、NADH含量的變化Table 2 Changes in ATP,ADP,AMP and NADH contents in beef Longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle during storage

2.1.3 剪切力的變化

肉的嫩度直接影響其食用時(shí)的口感，故嫩度是牛肉的重要品質(zhì)指標(biāo)之一[20]。而剪切力是評(píng)價(jià)肉品宰后成熟過(guò)程中嫩度的重要指標(biāo)，其代表肌肉纖維對(duì)抗剪切的作用力。宰后成熟期間秦川牛背最長(zhǎng)肌剪切力變化趨勢(shì)如表3所示。牛肉貯藏0 d時(shí)剪切力為121.67 N，0～4 d期間顯著上升，4 d達(dá)到其最大值（155.03 N），4～8 d呈顯著下降趨勢(shì)，8 d時(shí)剪切力為94.3 N。剪切力變化趨勢(shì)表明，宰后初期秦川牛肉嫩度較差，這可能是因?yàn)樵缀蟪跗诩∧鞍啄?、肌纖維硬化，肌肉發(fā)生僵直，貯藏至8 d時(shí)嫩度較好，本研究結(jié)果與Rhee等[21]對(duì)韓國(guó)本土牛肉的研究結(jié)果一致，秦川牛肉剪切力變化分析結(jié)果表明宰后成熟有助于改善肉品嫩度，適度條件的成熟有助于改善肉品嫩度是因?yàn)樵缀髢?nèi)源酶被激活，有效加速細(xì)胞骨架蛋白的降解。

表3 秦川牛背最長(zhǎng)肌在貯藏過(guò)程中剪切力、MFI和離心損失率的變化Table 3 Changes in shear force,MFI and centrifugal loss of beef Longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle during storage

2.1.4 MFI的變化

MFI代表肌原纖維蛋白被降解及肌原纖維結(jié)構(gòu)破壞的程度，能反映細(xì)胞骨架蛋白碎裂程度，常被用于間接表征肉品的嫩度[22]。如表3所示，MFI隨成熟時(shí)間延長(zhǎng)呈顯著上升趨勢(shì)（P＜0.05），貯藏0 d時(shí)MFI為30.30，8 d時(shí)達(dá)到整個(gè)貯藏過(guò)程的最高值（99.00），與0 d時(shí)相比增長(zhǎng)了226.73%。MFI變化趨勢(shì)表明，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，秦川牛肌肉結(jié)構(gòu)蛋白的水解程度加劇，肌肉結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)在內(nèi)源酶的作用下被降解為片段。李升升[23]在牦牛平滑肌嫩度形成機(jī)理的研究中發(fā)現(xiàn)，牦牛平滑肌的MFI隨冷藏時(shí)間延長(zhǎng)而顯著上升（P＜0.05），本研究結(jié)果與其一致。

2.1.5 離心損失率的變化

離心損失率常被用于表征肉的保水性，能夠反映在施加離心力時(shí)牛肉保持其自身水分及吸收水分的能力[24]。如表3所示，宰后0～4 d時(shí)牛肉的離心損失率顯著升高，4 d時(shí)達(dá)到最大值，4～8 d顯著降低。表明4 d時(shí)牛肉中肌漿蛋白凝結(jié)到肌原纖維上，蛋白質(zhì)溶解度下降，造成了水分的流失，離心損失率達(dá)到最大，保水性最差。

2.1.6 HSPA6表達(dá)量與能量物質(zhì)及品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)分析

為探究宰后成熟期間秦川牛背最長(zhǎng)肌中HSPA6與能量物質(zhì)及肉品質(zhì)的關(guān)系，對(duì)HSPA6表達(dá)量與能量基本物質(zhì)及品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。由表4可知，宰后成熟期間秦川牛背最長(zhǎng)肌中HSPA6表達(dá)量與ATP含量、ADP含量、AMP含量、NADH含量、剪切力呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)r分別為0.529、0.542、0.578、0.737、0.550；與MFI、離心損失率呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)r分別為－0.771、－0.153；與ADP、AMP含量無(wú)顯著相關(guān)性。HSPA6具有分子伴侶、免疫調(diào)節(jié)、抗癌細(xì)胞增殖、抗細(xì)胞凋亡等功能，可保護(hù)組織免受氧化應(yīng)激，保護(hù)重要蛋白質(zhì)不發(fā)生不可逆變性[25]。動(dòng)物宰后機(jī)體由于缺血、缺氧會(huì)刺激HSPA6表達(dá)，HSPA6的表達(dá)量與細(xì)胞損傷程度成反比[26]，這說(shuō)明HSPA6對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用。本研究中宰后成熟初期HSPA6僅發(fā)生少量降解，能夠較好地執(zhí)行其生理功能，抑制蛋白降解和細(xì)胞凋亡。隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，尤其是在貯藏后期，由于細(xì)胞凋亡酶發(fā)生作用，HSPA6對(duì)抗凋亡作用的能力降低，導(dǎo)致肌肉結(jié)構(gòu)降解程度加劇，因而剪切力降低，嫩度增加。Zhang Muhan等[27]研究發(fā)現(xiàn)雞胸肉中HSP70表達(dá)量與滴水損失率呈正相關(guān)，與本研究結(jié)果不一致，可能是實(shí)驗(yàn)材料存在差異或樣品處理方式不同所導(dǎo)致。D’Alessandro等[28]通過(guò)牛肉的嫩度指標(biāo)及其與蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)分析結(jié)果的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)牛肉中HSP70表達(dá)量與嫩度呈正相關(guān)，與MFI呈負(fù)相關(guān)，本研究結(jié)果與其一致。di Luca等[29]采用蛋白質(zhì)組學(xué)研究豬肉在成熟過(guò)程中保水性，發(fā)現(xiàn)HSPs表達(dá)量與滴水損失率呈負(fù)相關(guān)，滴水損失率大則系水率低；本研究中HSPA6表達(dá)量與離心損失率也呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），二者結(jié)果一致。

表4 HSPA6表達(dá)量與品質(zhì)各指標(biāo)之間的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis between the expression of HSPA6 and various quality indicators

HSPA6作為HSP70蛋白家族成員之一，具有其家族特有的兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域：N端高度保守ATPase功能域和C端底物結(jié)合功能域，ATPase功能域具有水解ATP的活性，可以處于與ATP、ADP結(jié)合狀態(tài)或者無(wú)核苷酸結(jié)合狀態(tài)，C端底物結(jié)合功能域可以與未折疊多肽底物暴露在外的疏水區(qū)域結(jié)合。HSP70 ATPase功能域的結(jié)合（與ATP結(jié)合）或水解狀態(tài)（ATP→ATP，變成與ADP結(jié)合狀態(tài)）會(huì)引起底物結(jié)合功能域與多肽的結(jié)合狀態(tài)和結(jié)構(gòu)的改變，因此HSP70通過(guò)C端底物結(jié)合、釋放并伴隨N端ATP-ADP轉(zhuǎn)換來(lái)發(fā)揮功能，可以保護(hù)蛋白質(zhì)免受壓力、折疊的影響，促進(jìn)錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的分解、形成蛋白質(zhì)復(fù)合物和促進(jìn)蛋白質(zhì)復(fù)合物解離等。本研究中，宰后成熟期間秦川牛背最長(zhǎng)肌中HSPA6表達(dá)量呈顯著下降趨勢(shì)，并與ATP、NADH含量呈顯著正相關(guān)，結(jié)果表明HSPA6可能通過(guò)利用結(jié)構(gòu)域具有ATP-ADP轉(zhuǎn)換活性執(zhí)行宰后成熟期間秦川牛肉中的蛋白翻譯后修飾。Leu等[30]通過(guò)抑制應(yīng)激誘導(dǎo)的HSP70表達(dá)，發(fā)現(xiàn)抑制HSP70表達(dá)會(huì)導(dǎo)致線粒體蛋白發(fā)生顯著變化、線粒體膜電位降低、耗氧率降低、ATP損耗等，與本研究結(jié)果一致。

2.2 蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析

設(shè)置1.3 倍為標(biāo)準(zhǔn)差異倍數(shù)，4 d與0 d、8 d與0 d、8 d與4 d相比分別鑒定出30、61、31 個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，并對(duì)3 個(gè)貯藏時(shí)間段樣品的蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果進(jìn)行蛋白質(zhì)組間相關(guān)性分析，如圖1所示。結(jié)果表明，貯藏時(shí)間可將樣本很好地區(qū)分開，同一貯藏時(shí)間樣本之間區(qū)分不明顯，不同貯藏時(shí)間樣本之間區(qū)分明顯，表明本實(shí)驗(yàn)樣本采集合理，蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)可靠，滿足后續(xù)分析要求。

圖1 貯藏0、4、8 d背最長(zhǎng)肌樣品差異蛋白組間相關(guān)性分析Fig.1 Correlation analysis of differential proteins between Longissimus dorsi muscle stored for 0,4 and 8 days

2.2.1 差異蛋白質(zhì)篩選

通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)鑒定出的差異蛋白進(jìn)行逐一搜索，通過(guò)功能特性篩選出24 種與HSPA6表達(dá)相關(guān)的差異蛋白質(zhì)，并將其表達(dá)豐度與HSPA6表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表5所示。

表5 秦川牛背最長(zhǎng)肌貯藏0、4、8 d與HSPA6相關(guān)的差異蛋白對(duì)比Table 5 Comparison of HSPA6-related differential proteins between Longissimus dorsi muscle stored for 0,4 and 8 days

2.2.2 GO分析

對(duì)差異蛋白質(zhì)及HSPA6通過(guò)GO富集分析，通過(guò)生物過(guò)程、分子功能、細(xì)胞組分解析其功能，顯著富集到9 個(gè)生物過(guò)程、8 個(gè)分子功能、8 個(gè)細(xì)胞組分，如表6所示。此類差異蛋白質(zhì)能夠催化復(fù)合體、蛋白質(zhì)復(fù)合體、細(xì)胞骨架部分等位置發(fā)生變化，同時(shí)在細(xì)胞內(nèi)具有催化、水解酶等活性，并通過(guò)與碳水化合物衍生物、嘌呤核苷三磷酸結(jié)合等分子功能，引起蛋白酶體介導(dǎo)的泛素依賴性蛋白質(zhì)分解代謝、蛋白分解參與細(xì)胞蛋白分解等生物過(guò)程，進(jìn)而使宰后秦川牛肌肉結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，影響肌肉蛋白質(zhì)水解，引起肉的能量水平及相關(guān)品質(zhì)發(fā)生變化[31]。

表6 與HSPA6表達(dá)量相關(guān)差異蛋白的GO富集分析Table 6 Gene ontology (GO) enrichment analysis of differential proteins associated with HSPA6 expression

2.2.3 KEGG通路分析

對(duì)差異蛋白質(zhì)及HSPA6進(jìn)行KEGG通路富集分析，其顯著注釋于剪接體（bta03040）與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工（bta04141），如表7所示。HNRNPK為異質(zhì)性核蛋白K，是RNA結(jié)合蛋白，可能影響不均一核RNA的加工以及mRNA代謝和運(yùn)輸，在不均一核RNA剪接過(guò)程中介導(dǎo)ATP水解。DNAJA2為細(xì)胞周期進(jìn)程恢復(fù)基因2，該蛋白屬于進(jìn)化保守DNAJ/HSP40蛋白家族，通過(guò)刺激ATP酶活性來(lái)調(diào)節(jié)分子伴侶活性，DNAJ蛋白在體外蛋白質(zhì)折疊導(dǎo)入中作為HSP70的輔助伴侶。P4HB為蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶，來(lái)源于硫氧還原蛋白超家族的二硫醇-二硫化物氧化還原酶分子伴侶，具有氧化還原酶、異構(gòu)酶和分子伴侶作用[32]。剪接體是由核小RNA和蛋白質(zhì)因子動(dòng)態(tài)組成，可識(shí)別RNA前體并催化核糖核蛋白復(fù)合體的剪接反應(yīng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工過(guò)程包括蛋白質(zhì)的糖基化、?；?、羥基化等。以上結(jié)果表明，HSPA6參與了宰后成熟期間秦川牛肉中蛋白質(zhì)翻譯后修飾。

表7 8 d對(duì)比0 d組差異蛋白KEGG通路富集Table 7 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analysis of differential proteins in Longissimus dorsi muscle stored for 8 vs 0 days

2.2.4 基于蛋白質(zhì)組學(xué)研究秦川牛宰后貯藏期間HSPA6及相關(guān)差異蛋白變化

已知HSP70 N端ATPase功能域具有微弱的ATP水解活性和ATP合成活性，即ATP-ADP轉(zhuǎn)換活性[6]，可能會(huì)通過(guò)影響ATP合酶參與ATP合成與消耗從而影響機(jī)體細(xì)胞供能和耗能。HSPA6作為HSP70家族一員，缺血缺氧激活了細(xì)胞凋亡酶，同時(shí)應(yīng)激誘導(dǎo)了HSPA6的合成，阻止宰后肌肉成熟過(guò)程中細(xì)胞凋亡，并保持或降低HSPA6對(duì)肌肉細(xì)胞蛋白質(zhì)的影響[33]，然而其調(diào)控能量代謝變化及肉品質(zhì)變化的機(jī)制尚不明確。

HSPA6及相關(guān)差異蛋白質(zhì)主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮生物作用，并且HSPA6所含HSP70家族特有的EEVD基序可以與具有四肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域的伴侶蛋白結(jié)合，如E3泛素連接酶，同時(shí)伴侶蛋白之間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，DNAJB4限制了HSP70與E3泛素連接酶復(fù)合物的泛素化活性，而E3泛素連接酶抑制了HSP70-DNAJB4復(fù)合物重折疊活性[34]。因此，HSPA6在細(xì)胞質(zhì)中可與DNAJB4、E3泛素連接酶等伴侶蛋白共同作用，同時(shí)作為維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定的重要參與者，在蛋白質(zhì)折疊和降解中發(fā)揮作用，控制應(yīng)激狀態(tài)下的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)[35]。HNRNPK是與mRNA結(jié)合的主要蛋白質(zhì)，可能在RNA轉(zhuǎn)錄激活和抑制過(guò)程中發(fā)揮作用[36]，促進(jìn)細(xì)胞糖基化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。DDX39B是參與剪接和未剪接mRNA核輸出的主要蛋白，亦是組裝TREX復(fù)合物的組分，在TREX組裝過(guò)程中可能會(huì)經(jīng)歷幾輪ATP水解，以驅(qū)動(dòng)隨后的成分加載到mRNA上，ATPase活性被RNA和TREX的復(fù)合體共同刺激，ATP水解觸發(fā)了RNA的解離，參與轉(zhuǎn)錄延伸和基因組穩(wěn)定。DDX3作為RNA解旋酶，其C端優(yōu)先與未甲基化的HNRNPK結(jié)合[37]。已有研究發(fā)現(xiàn)，HNRNPK的精氨酸甲基化通過(guò)干擾DDX3-HNRNPK相互作用來(lái)抑制U2OS細(xì)胞的凋亡；另一方面，DDX3-HNRNPK具有促凋亡作用，DDX3-HNRNPK水平可以作為反映骨肉瘤細(xì)胞凋亡的程度[38]，與本研究結(jié)果一致。HSPA6可能通過(guò)ATP-ADP轉(zhuǎn)換活性的功能降低組織能量水平，并通過(guò)抗細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白降解最終影響秦川牛肉的肉色、嫩度及保水性。

3 結(jié)論

宰后0～8 d內(nèi)，隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，秦川牛肉中HSPA6表達(dá)量持續(xù)下降，ATP、ADP、AMP、NADH含量持續(xù)下降，剪切力與離心損率失先升高后降低。利用4D-LFQ蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，貯藏0～8 d秦川牛背最長(zhǎng)肌所含HSPA6及相關(guān)差異蛋白質(zhì)表達(dá)量發(fā)生變化，這些蛋白質(zhì)位于催化復(fù)合體、蛋白質(zhì)復(fù)合體、細(xì)胞骨架，通過(guò)與碳水化合物衍生物、蛋白質(zhì)或嘌呤核苷三磷酸結(jié)合，參與蛋白質(zhì)分解代謝，引起蛋白質(zhì)降解、細(xì)胞凋亡和蛋白水解等變化，進(jìn)而影響肌肉結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致組織能量水平降低，最終影響秦川牛肉的嫩度、MFI及保水性。