云周苗，黃業(yè)傳，彭春雷，趙 靜，張克媛

（1.荊楚理工學(xué)院生物工程學(xué)院，湖北 荊門 448000；2.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽 621010）

高壓處理作為一種冷殺菌技術(shù)，可以有效將食品中有害微生物數(shù)量或有害酶活性降低至安全水平，且與傳統(tǒng)熱殺菌相比，對食品品質(zhì)（如營養(yǎng)、色澤、質(zhì)地和風(fēng)味）的破壞更少。近20 年來，高壓處理在食品工業(yè)中發(fā)揮著越來越重要的作用[1-3]。然而，高壓處理可能會導(dǎo)致肉產(chǎn)品中肌內(nèi)脂質(zhì)氧化增強，而脂質(zhì)氧化是食物非微生物變質(zhì)的主要原因，這使該技術(shù)在動物產(chǎn)品中的實際應(yīng)用遠小于在植物產(chǎn)品中[4-8]。高壓誘導(dǎo)肉類脂質(zhì)氧化機理的相關(guān)研究國內(nèi)鮮見報道。關(guān)于高壓下肉類中脂質(zhì)氧化的原因，研究人員得到的結(jié)論各不相同，Tanaka[9]、Beltran[10]、Huang Yechuan[11]和Orlien[12]等的研究表明高壓下肉類脂質(zhì)氧化可能分別與變性蛋白質(zhì)的協(xié)同作用、金屬離子的釋放、酶活性的變化或高壓條件下細胞膜的損傷有關(guān)。馬漢軍等[13]的研究也證實了金屬離子的釋放在脂質(zhì)氧化中的重要作用，但鮮有研究完全揭示脂質(zhì)氧化的機制。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，高壓處理下豬肉中的肌內(nèi)磷脂不均勻地水解為游離脂肪酸，然后游離脂肪酸中的多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）被氧化[14]。因此，磷脂的脂解是高壓誘導(dǎo)的脂質(zhì)氧化中一個非常重要的步驟，其脂解演變過程值得進一步研究，以進一步解析高壓下脂肪氧化的詳細規(guī)律。盡管課題組前期討論了高壓下豬肉中脂質(zhì)氧化的動力學(xué)規(guī)律[15]，但據(jù)現(xiàn)有資料，針對高壓下豬肉中磷脂脂解動力學(xué)的研究基本處于空白狀態(tài)。

目前在肉制品加工中應(yīng)用高壓時通常結(jié)合一定的熱處理，這對耐壓微生物具有良好的滅活效果[16]。高壓結(jié)合熱處理對肉類的品質(zhì)特性也有一定影響，Zybert等[17]認(rèn)為在33～80 ℃條件下加壓對豬肉的嫩度影響最大，肉的亮度增加。一些研究人員討論了高壓結(jié)合熱處理過程中牛肉、豬肉和魚類肌肉內(nèi)總脂肪酸組成的變化[18-20]。馬漢軍等[21]認(rèn)為壓力和熱處理加速脂肪氧化是因為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞和變性導(dǎo)致鐵離子的釋放。然而，就肌內(nèi)磷脂而言，高壓結(jié)合熱處理對肉中磷脂含量和脂肪酸組成的影響等鮮有研究。超過300 MPa的壓力會加快脂肪氧化進程[5,22]，且大部分超高壓設(shè)備的最大操作壓力為600～800 MPa，為實驗條件的選擇提供了基礎(chǔ)。

為探索高壓誘導(dǎo)磷脂脂解的演變過程，提高高壓處理肉類產(chǎn)品的品質(zhì)，本研究在壓力范圍為300～700 MPa、溫度范圍為20～60 ℃條件下探索豬肉中磷脂脂解的動力學(xué)變化規(guī)律，包括其中飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）、單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acids，MUFA）和PUFA脂解的動力學(xué)變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6 月齡白玉黑土黑豬背最長肌 綿陽天農(nóng)生態(tài)食品開發(fā)有限公司；三氟化硼-甲醇、十七烷酸甲酯 美國Sigma-Aldrich公司；三氯甲烷、甲醇 成都科龍化工試劑廠；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；所用水為蒸餾水；所用溶液均自行配制。

1.2 儀器與設(shè)備

QP-2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司；HPP.L2-800/1超高壓設(shè)備 天津華泰森淼生物工程技術(shù)股份有限公司；SHZ-D（III）循環(huán)水式多用真空泵上海央申科技儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠；Sep -Pak固相萃取柱美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 豬肉樣品制備

取同一批飼養(yǎng)的3 頭白玉黑土黑豬背最長肌，取樣后立即在冷藏條件下運回實驗室，去除可見脂肪和結(jié)締組織，真空包裝后在－20 ℃下冷凍備用。

1.3.2 高壓結(jié)合熱處理

將樣品在4 ℃下解凍24 h后用孔板直徑為3 mm的絞肉機絞碎，然后將樣品隨機裝入聚乙烯袋中，每袋20 g，并真空包裝。使用癸二酸二異辛酯作為傳壓介質(zhì)，在超高壓設(shè)備中進行處理。將不同處理壓力（300、400、500、600、700 MPa）分別與不同處理溫度（20、30、40、50、60 ℃）進行組合。將樣品放置在壓力容器中，由于壓縮熱導(dǎo)致壓力介質(zhì)的溫度線性升高，其在700 MPa時約為14.5 ℃，因此需將壓力容器分別平衡至低于300、400、500、600、700 MPa下樣品預(yù)設(shè)溫度4、6、8、10、12 ℃的特定溫度。以10 MPa/s的速率增壓，在達到預(yù)設(shè)壓力后平衡3 min確保等壓等溫條件。平衡后，介質(zhì)的溫度比預(yù)設(shè)溫度高1.5～2.5 ℃，然后記錄處理時間（0～40 min）。壓力處理后，介質(zhì)溫度比預(yù)設(shè)溫度低1～2 ℃，表明高壓處理期間樣品溫度基本恒定。壓力容器容量為1 L，最大工作壓力和溫度分別為800 MPa和60 ℃。處理后將壓力以100 MPa/s的速率迅速釋放至大氣壓，然后立即在冰浴中冷卻樣品，并在4 ℃下保存，在24 h內(nèi)測定每個樣品中肌內(nèi)磷脂的含量和組成。每個壓力-溫度組合處理3 袋樣品，3 袋樣品分別取自不同的豬。

1.3.3 磷脂含量和脂肪酸譜測定

參照He Zhifei等[23]的方法測定磷脂含量和組成。從樣品中提取肌內(nèi)脂肪后用硅膠柱從中分離肌內(nèi)磷脂，計算總磷脂（total phospholipids，PL）含量。磷脂用三氟化硼-甲醇進行甲基化，使用氣相色譜儀分析脂肪酸甲酯。通過將保留時間與標(biāo)準(zhǔn)品進行比較對脂肪酸進行定性。采用面積歸一化法對脂肪酸進行定量，計算SFA、MUFA和PUFA相對含量。在此基礎(chǔ)上，通過PL含量計算每個處理樣品中SFA、MUFA和PUFA的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

根據(jù)預(yù)實驗，在高壓熱處理過程中豬肉PL（或PL中SFA、MUFA、PUFA）的脂解可以用一階模型方程（式（1））描述。

式中：t為高壓處理時間/m i n；A和A0分別表示t時和0時的PL（或PL中SFA、MUFA、PUFA）含量/（g/100 g）；k為脂解速率常數(shù)/min－1。

使用SPSS 13.0軟件的線性回歸程序?qū)n（A/A0）和t的函數(shù)進行線性擬合，根據(jù)方程斜率計算可得出磷脂中PL或PL中SFA、MUFA、PUFA的脂解速率常數(shù)。

Eyring（式（2））和Arrhenius（式（3））方程通常分別用于評估壓力和溫度對反應(yīng)速率常數(shù)的影響。本研究中，脂解速率常數(shù)的壓力和溫度依賴性分別用活化體積（Va/（cm3/mol））和活化能（Ea/（kJ/mol））表示。

式中：krefT和krefP分別表示參考溫度和壓力下的脂解速率常數(shù)/min－1；R是氣體常數(shù)（8.314 J/（mol·K））；T為溫度/K；Tref為參考溫度（本研究中為313.15 K）；P為壓力/MPa；Pref為參考壓力（本研究中為500 MPa）。

使用SPSS 13.0軟件的線性回歸程序繪制lnk與P的回歸曲線，根據(jù)回歸曲線的斜率和截距確定不同溫度下的Va和krefP。類似地，通過繪制lnk與1/T的回歸曲線，可以計算不同壓力下的Ea和krefT。

使用MATLAB R2016a軟件繪制溫度-壓力等值線。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同壓力-溫度組合下豬肉中磷脂的脂解速率常數(shù)

根據(jù)一階模型方程（式（1）），在特定壓力-溫度組合下測定不同處理時間樣品中的PL含量后，進行l(wèi)n（A/A0）與時間t的線性回歸分析（400 MPa-20 ℃、500 MPa-40 ℃和600 MPa-60 ℃對磷脂脂解的影響如圖1所示），然后計算PL的脂解速率常數(shù)（k）；同樣計算SFA、MUFA和PUFA的脂解速率常數(shù)。如表1所示，在固定溫度下，PL、SFA、MUFA、PUFA的k值均隨壓力增加而增加，表明磷脂的脂肪分解隨著壓力的增加而加快。這一結(jié)果與Martínez-Monteagudo等[24]研究的結(jié)果不一致，其研究發(fā)現(xiàn)高達600 MPa的壓力處理延遲了牛奶中不飽和脂肪酸的均質(zhì)分解，說明壓力具有保護作用。在恒定壓力下，溫度的升高可以促進PL和PUFA的脂解。在300 MPa和400 MPa壓力下，SFA的k值隨著溫度的升高先降低，至40 ℃然后逐漸增加；當(dāng)處理壓力高于400 MPa時，SFA的k值隨溫度升高而升高。除在300 MPa-40 ℃和400 MPa-40 ℃條件下，在一定壓力下MUFA的k值隨溫度的升高而增加。此外，所有條件下，PUFA的k值（1.65×10－3～6.98×10－3min－1）遠高于SFA（0.35×10－3～1.51×10－3min－1）和MUFA（0.31×10－3～1.71×10－3min－1），所有PL的k值介于二者之間，為0.93×10－3～3.56×10－3min－1。因此，在肌內(nèi)磷脂中，與SFA和MUFA相比，PUFA的水解速率更快，這可能歸因于在高壓條件下磷脂酶對PUFA的優(yōu)先水解[23]。

表1 不同壓力和溫度下豬肉的磷脂脂解速率常數(shù)（k）Table 1 Lipolysis rate constants (k) of PL in pork at different pressure and temperatures

圖1 400 MPa-20℃、500 MPa-40℃和600 MPa-60℃條件下豬肉PL脂解的一階模型回歸曲線Fig.1 Linear regression curves of PL lipolysis in pork at different pressure and temperatures

2.2 溫度對高壓結(jié)合熱處理條件下豬肉中脂解速率常數(shù)的影響

高壓結(jié)合熱處理過程磷脂脂解速率常數(shù)的溫度敏感性可通過Arrhenius方程（式（3））進行評估，表2所示為不同壓力下PL、SFA、MUFA和PUFA在參考溫度（40 ℃，即313 K）下的Ea和lnkrefT。由于在300 MPa和400 MPa下SFA和MUFA的k值并不總是隨著溫度的升高而增加（表1），可知Arrhenius方程在該條件下不適用于整個溫度范圍，因此在40～60 ℃溫度范圍內(nèi)計算300 MPa和400 MPa下SFA和MUFA的Ea和krefT。PL、SFA、MUFA、PUFA的Ea隨著壓力的增加而減小，至500 MPa保持相對穩(wěn)定，表明在300～500 MPa范圍內(nèi)，處理壓力越高，磷脂脂解要克服的能量障礙越低，脂解越容易。且在此壓力范圍內(nèi)，隨壓力增加，溫度對k值的影響不斷減小，k值先增加然后保持穩(wěn)定。Martínez等[24]在高壓滅菌過程中模擬共軛亞油酸在牛乳中的保留動力學(xué)發(fā)現(xiàn)，Ea隨著壓力的增加而增加，這與本研究中獲得的結(jié)果不一致。本研究中Ea遠低于一些報道中酶失活Ea，例如，處理壓力為100～800 MPa時純化后橙果膠甲基酯酶Ea為40～160 kJ/mol[25]，在處理壓力300～600 MPa的情況下黑虎蝦中多酚氧化酶的Ea為39.38～50.27 kJ/mol[26]。這種差異可能是因為使酶失活需要足夠的能量改變其構(gòu)象，而高壓處理時肉中肌內(nèi)磷脂會發(fā)生一定程度水解，因而不需要克服太多的能量障礙。

表2 不同壓力時豬肉中磷脂脂解在參考溫度（40℃）下的Ea和ln krefTTable 2 Ea and ln krefT of PL lipolysis in pork at reference temperature(40℃) under different pressures

通過比較可以看出，S FA 和M U FA 的Ea遠高于PUFA，表明在高壓結(jié)合熱處理下，PUFA的脂解更容易，因為其脂解需克服的能量障礙要低得多。SFA和MUFA具有更高的溫度敏感性。除300 MPa處理外，PL的Ea非常接近但略高于PUFA的Ea，這表明肌內(nèi)磷脂的脂解主要由其中PUFA引起。這可能是因為在高壓條件下，磷脂中PUFA被磷脂酶優(yōu)先水解，導(dǎo)致磷脂的分子結(jié)構(gòu)受損，然后磷脂中的SFA和MUFA被動水解。

2.3 壓力對高壓結(jié)合熱處理條件下豬肉中脂解速率常數(shù)的影響

在固定溫度下，PL、SFA、MUFA和PUFA的k值隨著壓力的增加而增加（表1），因此Eyring方程適用于整個壓力范圍，可用于不同溫度下豬肉中磷脂脂解在參考壓力（500 MPa）下的Va和lnkrefP。如表3所示，所有Va均為負(fù)值，表明壓力對磷脂脂解有加速作用。PL、SFA和PUFA的Va絕對值隨溫度升高先增加，PL和SFA的Va絕對值在40 ℃時達到峰值，PUFA的Va絕對值在30 ℃時達到峰值，然后開始下降。MUFA的Va呈不規(guī)律變化，其絕對值在40 ℃時達到最大值。因此，PUFA的脂解速率常數(shù)在30 ℃時受壓力的影響最大，而PL、SFA和MUFA在40 ℃時受壓力影響最大。此外，SFA的平均Va絕對值最高，然后依次為MUFA、PL和PUFA，表明SFA的脂解速率常數(shù)具有最高的壓力敏感性，其次是MUFA，PL和PUFA的脂解速率常數(shù)的壓力敏感性相對較低。產(chǎn)生這一結(jié)果的原因有待進一步研究。大多數(shù)研究中Va與本研究相當(dāng)或略高。例如，高壓滅菌過程中模擬共軛亞油酸在牛奶中的保留動力學(xué)獲得的Va絕對值為9.34～16.42 cm3/mol[24]；在高溫高壓處理條件下樹莓中花青素降解的Va絕對值為5.33～7.96 cm3/mol[27]；以及高壓結(jié)合熱處理時菠蘿泥中多酚氧化酶的Va絕對值為9.8～11.3 cm3/mol[28]；綠豆和番茄脂肪氧化酶的Va絕對值均超過40 cm3/mol[29-30]，遠高于本研究的Va。

表3 不同溫度下豬肉中磷脂脂解在參考壓力（500 MPa）下的Va和ln krefPTable 3 Va and ln krefP of PL lipolysis in pork at reference pressure(500 MPa) under different temperatures

2.4 基于Arrhenius方程的磷脂脂解動力學(xué)模型

由上述分析可知，Arrhenius方程適用于整個研究溫度范圍。將式（3）中的Ea和lnkrefT表示為壓力（P－Pref）的函數(shù)。根據(jù)表2的數(shù)據(jù)，處理壓力對Ea的影響如圖2所示；通過SPSS軟件曲線回歸程序用二次模型（式（4））描述；類似地，lnkrefT與壓力的關(guān)系也可通過式（5）很好地擬合。

圖2 壓力對豬肉磷脂脂解Ea的影響Fig.2 Effect of pressure on the Ea of PL lipolysis in pork

式中：a、b、c、d、e均為估計模型參數(shù)；a＝－6.208 min－1；b＝0.002 MPa/min；c＝8.760 kJ/mol；d＝－0.0 1 0（k J·M P a）/m o l；e＝5.1×10－5（kJ·MPa2）/mol。

將式（4）、（5）合并到式（3）中得到式（6），即為基于Arrhenius方程的磷脂脂解動力學(xué)模型。然后使用從式（4）、（5）獲得的參數(shù)作為初始輸入值，根據(jù)表1中的數(shù)據(jù)通過SPSS軟件非線性回歸模型，重新計算式（6）中的參數(shù)（表4），可見式（6）中的估計模型參數(shù)非常接近通過式（4）、（5）中獲得的參數(shù)，表明建立的模型具有良好的擬合度。

表4 基于Eyring或Arrhenius方程在不同壓力和溫度下豬肉磷脂脂解動力學(xué)的估計模型參數(shù)Table 4 Estimated parameters of Eyring and Arrhenius models for PL lipolysis kinetics in pork at different pressures and temperatures

式中：a、b、c、d、e均為估計模型參數(shù)；k為脂解速率常數(shù)/min－1；P為壓力/MPa；T為溫度/℃；Pref為參考壓力（500 MPa）；Tref為參考溫度（40 ℃）；8.314×10－3為通用氣體常數(shù)/（kJ/（mol·K））；273.15為溫度轉(zhuǎn)換系數(shù)/K。

2.5 基于Eyring方程的磷脂脂解動力學(xué)模型

如表1所示，Eyring方程適用于整個壓力范圍。將式（2）中的Va和lnkrefP表示為溫度（T－Tref）的函數(shù)。通過SPSS軟件曲線回歸程序，使用表3中的數(shù)據(jù)，將lnkrefP與溫度的關(guān)系通過線性模型（式（7））描述，同理Va與溫度的關(guān)系可以通過二次模型（式（8））很好地擬合。

式中：估計模型參數(shù)a＝－6.214 min－1；b＝0.012 ℃/min；c＝－7.020 mol/cm3；d＝0.017（mol·℃）/cm3；e＝0.005（mol·℃2）/cm3。

將式（7）、（8）合并到式（2）中得到式（9），即為基于Eyring方程的磷脂脂解動力學(xué)模型。然后根據(jù)表1中的數(shù)據(jù)，將從式（7）、（8）獲得的值作為初始輸入值，通過非線性回歸模型重新計算式（9）中的參數(shù)（表4）。同樣，式（9）中估計參數(shù)與從式（7）、（8）獲得的參數(shù)之間具有良好的相似性，表明建立的模型擬合良好。

式中：a、b、c、d和e為模型參數(shù)；k為脂解速率常數(shù)/min－1；P為壓力/MPa；T為溫度/℃；Pref為參考壓力（500 MPa）；Tref為參考溫度（40 ℃）；8.314為通用氣體常數(shù)/（J/（mol·K））；273.15為溫度轉(zhuǎn)換系數(shù)/K。

Ludikhuyze[31]和Indrawati[32]等在研究大豆和青豆的高壓處理時均基于Eyring方程模擬脂肪氧合酶的失活動力學(xué)，而Weemaes等[33]在研究鱷梨多酚氧化酶失活模型時選擇Arrhenius方程作為基礎(chǔ)，因為Arrhenius和Eyring方程在上述研究中不同時適用于整個研究溫度或壓力范圍。在本研究中，由于Arrhenius和Eyring方程均適用于整個研究的溫度和壓力域，因此成功地同時建立了這兩個模型。此外，一些研究人員分別采用Weibull模型、三維動力學(xué)模型很好地描述了椰子水多酚氧化酶和過氧化物酶的壓力輔助熱滅活動力學(xué)和高壓中溫下胡蘿卜汁中嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢的協(xié)同殺菌動力學(xué)[34-35]。

2.6 磷脂脂解預(yù)測

如圖3 所示，實驗確定的k值與式（6）（或式（9））預(yù)測的k值之間有良好的一致性，表明建立的模型能夠準(zhǔn)確預(yù)測高壓結(jié)合熱處理區(qū)間豬肉中的磷脂脂解。為指導(dǎo)高壓技術(shù)在肉制品中的應(yīng)用，根據(jù)式（6）和式（9）分別計算在30 min處理時間下引起6%、7%和8%磷脂水解的溫度-壓力組合，相應(yīng)的溫度-壓力等值線如圖4所示。

圖3 實驗中確定k值與預(yù)測的高壓熱處理豬肉磷脂脂解k值的比較Fig.3 Comparison between experimental and predicted k values for PL lipolysis in pork under high pressure-heat treatment

圖4 基于Arrhenius方程的模型（A）和基于Eying方程的模型（B）的豬肉磷脂脂解溫度-壓力等值線圖Fig.4 Temperature-pressure curves for PL lipolysis in pork fitted to Arrhenius equation (A) and Eying equation (B)

如圖4所示，兩個溫度-壓力等值線圖非常相似，因此基于Arrhenius和Eyring方程建立的兩個回歸模型可以很好地匹配。根據(jù)等值線圖可以獲得導(dǎo)致任一特定百分比磷脂水解的壓力-溫度組合。由于肌內(nèi)磷脂對肉制品品質(zhì)非常重要，并且磷脂的脂解是高壓結(jié)合熱處理導(dǎo)致脂質(zhì)氧化的重要原因[14]，根據(jù)本研究建立的模型和溫度-壓力等值線圖，通過選擇合適的處理溫度、壓力和時間，可以有目的地控制高壓處理過程中磷脂的脂解。

3 結(jié)論

高壓結(jié)合熱加工對豬肉進行處理時肌內(nèi)磷脂中PUFA的脂解速率常數(shù)遠高于SFA和MUFA，同時PUFA在所有壓力下的脂解Ea均非常接近于PL，因此磷脂的水解主要是其中PUFA的優(yōu)先和主動水解。在固定溫度下，磷脂的脂肪分解隨著壓力的增大而加快。在恒定壓力下，溫度的升高可以提高磷脂中PL和PUFA的脂解?；贏rrhenius方程和Eyring方程建立的磷脂脂解動力學(xué)模型均具有良好的擬合度和預(yù)測效果，此外，兩個模型具有相似的溫度-壓力等值線圖?？紤]到磷脂脂解是高壓處理引起的脂質(zhì)氧化的重要原因之一，在肉類工業(yè)實際應(yīng)用過程中，可以根據(jù)本研究建立的模型和溫度-壓力等值線圖選擇最佳處理溫度和壓力，調(diào)節(jié)脂質(zhì)氧化，有目的地控制磷脂脂解，從而設(shè)計或優(yōu)化豬肉高壓處理的加工工藝參數(shù)、提高肉制品品質(zhì)。