卡地爾亞·庫爾班，阿吉然姆·阿布拉，陳卓爾，米合熱尼沙·阿木熱江，海力茜·陶爾大洪,*，楊 飛,2,*

（1.新疆醫(yī)科大學藥學院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆維吾爾自治區(qū)分析測試研究院，新疆 烏魯木齊 830011）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是一種由COVID-19[1]、膿毒血癥[2]、PM2.5[3]、輸血[4]、肺癌放化療[5]等多種因素導致的高發(fā)病率、高病死率危重病[6]。其特征為炎癥介質的大量釋放導致中性粒細胞聚集并過度激活機體免疫系統(tǒng)，形成“細胞因子風暴”，最終導致肺組織嚴重損傷甚至引發(fā)多個器官的損傷及衰竭[7]。

近年來，核轉錄因子-κB/NOD樣受體3（nuclear factor kappa B/NOD-like receptor 3，NF-κB/NLRP3）信號通路在炎癥相關疾病中的作用機制成為研究熱點，此通路的激活或抑制可調控肺損傷的發(fā)生過程[8]。NLRP3炎性小體的啟動過程由模式識別受體信號通路觸發(fā)，例如Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）或腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路激活，隨后通過NF-κB依賴通路介導NLRP3、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-18的轉錄激活，促進炎癥和損傷的發(fā)生[9]。

蕪菁（Brassica rapaL.）為新疆、西藏等高海拔地區(qū)普遍種植的一種藥食同源植物[10]。蕪菁為十字花科蕓薹屬草本植物[11]，肉質塊根為其主要食用與藥用部位[12-13]?！侗静菥V目》記載“蕪菁，味辛、苦、平，無毒。塞北、河西種者。能下能利小便，明目解毒，其效甚偉”[14]。蕪菁含有多糖[15]、蛋白質[16]、多酚[17]、揮發(fā)油[18]等多種活性成分。研究發(fā)現(xiàn)蕪菁多糖具有免疫調節(jié)[19]、抗衰老[20]、抗氧化[21]等多種生理活性，但缺乏其干預呼吸系統(tǒng)疾病、炎癥性疾病相關報道。本研究旨在探討蕪菁酸性多糖（Brassica rapaL.acidic polysaccharide-1，BRAP-1）的理化性質、結構和組成，及其對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的急性肺損傷的保護作用和相關機制，以期為蕪菁多糖藥理活性研究及作為肺損傷保健食品、治療藥物提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

健康SPF級BALB/c小鼠，雄性，4～6 周齡（體質量（20±2）g），購自新疆醫(yī)科大學動物實驗中心，使用許可證號：SYXK（新）2018-0003；飼養(yǎng)環(huán)境：溫度為20～25 ℃，相對濕度為40%～60%，12 h光照12 h黑暗，墊料、飲用水經(jīng)高壓滅菌處理，自由進食、定時更換墊料。

蕪菁采收于新疆柯坪縣，經(jīng)北京大學藥學院張英濤副教授鑒定為十字花科蕓薹屬植物蕪菁的干燥塊莖。

LPS 美國Sigma公司；小鼠TNF-α、IL-6、IL-10、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒 上海江萊生物科技有限公司；Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser逆轉錄試劑盒、TB Green Premix ExTaqII擴增試劑盒 日本TAKARA公司；BCA蛋白質量濃度測定試劑盒 美國Thermo Fisher公司。

1.2 儀器與設備

5424R離心機 德國Eppendorf公司；F50型酶標儀瑞士Tecan公司；Eclipse E100顯微鏡 日本Nikon公司；7500實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative realtime polymerase chain reaction，qPCR）儀 美國Applied Biosystems公司；傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）儀 美國熱電公司；1200高效凝膠滲透色譜系統(tǒng)、氣相色譜-質譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 BRAP-1制備

根據(jù)課題組前期研究方法，通過水提醇沉法獲得蕪菁總多糖，再經(jīng)DEAE-650M陰離子交換柱、Sepharose 6B瓊脂糖凝膠柱、Sephacryl S-300葡聚糖凝膠色譜柱分離純化后得到分子質量均一、高純度蕪菁酸性均一多糖BRAP-1[22]。

1.3.2 BRAP-1化學組成分析

采用苯酚硫酸法測定總糖質量分數(shù)，標準曲線方程為y＝0.000 8x+0.005 0（R2＝0.999 3）；采用間羥基聯(lián)苯法測定樣品糖醛酸質量分數(shù)，標準曲線方程為y＝0.000 8x+0.023 0（R2＝0.999 5）；考馬斯亮藍蛋白分析法測定蛋白質量分數(shù)，標準曲線方程為y＝0.001 0x+0.169 3（R2＝0.998 6）[22]。

1.3.3 BRAP-1表觀分子質量測定

配制不同分子質量（1、5、1 2、5 0、8 0、150、270、410、670、2 000 kDa）的Dextran T標準品溶液及BRAP-1多糖溶液，進行高效凝膠滲透色譜分析。檢測參數(shù)：進樣量10 μL，PL aquagel-OH MIXED-H色譜柱（7.5 mm×300 mm，8 μm），示差折光檢測器，流動相為0.1 mol/L硝酸鈉溶液，柱溫35 ℃，流速0.6 mL/min。以標準品保留時間為橫坐標，分子質量的對數(shù)為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程y＝－0.652x+13.330（R2＝0.998 2），將BRAP-1保留時間代入方程計算表觀分子質量。

1.3.4 BRAP-1的FT-IR分析

溴化鉀粉末與冷凍干燥的BRAP-1粉末以質量比1∶100混合，研磨后壓片，進行FT-IR分析。掃描范圍4 000～400 cm－1。

1.3.5 BRAP-1單糖組成分析

以肌醇為溶劑配制7 種單糖混合標準溶液（0.1 μg/μL）和BRAP-1多糖溶液（0.2 μg/μL）。三氟乙酸水解2 h，N2吹干溶劑，甲醇洗滌3 次后利用醋酸酐和1-甲基咪唑進行乙酰化處理，收集備用。GC-MS檢測條件：HP-5MS色譜柱（30.0 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣He，柱升溫條件：160 ℃保持1 min，2 ℃/min升溫至190 ℃，再以0.4 ℃/min升溫至280 ℃，保持5 min，檢測器溫度280 ℃。根據(jù)標準品保留時間確定樣品單糖組成，通過樣品單糖峰的峰面積之比計算單糖物質的量比。

1.3.6 動物分組及給藥

將40 只BALB/c小鼠隨機分成5 組，每組8 只，分別為正常組，模型組，BRAP-1低、中、高劑量組。各組給藥劑量根據(jù)小鼠體質量計算。實驗連續(xù)給藥10 d，期間正常組、模型組灌胃0.5 mL/d生理鹽水。BRAP-1低、中、高劑量組分別灌胃50、100、200 mg/（kgmb·d）的BRAP-1。末次給藥2 h后用質量分數(shù)4%水合氯醛麻醉小鼠，正常組氣管滴注無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），模型組及BRAP-1給藥組氣管滴注LPS（5 mg/kgmb）。模型建立24 h后，小鼠眼眶采集血液，立即收集臟器，稱質量后于－80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.7 肺濕質量/干質量比值測定

1.3.8 肺泡灌洗液總細胞數(shù)、蛋白質量濃度測定

取完整的肺組織，手術線結扎左肺，將留置針置入氣管中用棉線結扎固定，進行肺泡灌洗。取0.5 mL冰上預冷無菌PBS沿總支氣管流入肺，此操作過程中可觀察到小鼠右肺部變大，輕輕按揉5 次并抽回，重復3 次。3 000×g離心15 min后收集上清液，采用BCA法檢測小鼠肺泡灌洗液中總蛋白質量濃度，操作嚴格按試劑盒說明書進行，沉淀用PBS重懸后用顯微鏡進行總細胞計數(shù)。

1.3.9 肺組織病理學觀察

利用質量分數(shù)10%甲醛固定液固定肺組織，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋后切片，厚度約5 μm，再經(jīng)烤片、脫蠟、透明、脫水，進行蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色，中性樹膠封片，晾干，光學顯微鏡下觀察肺組織病理學變化。

1.3.10 血清細胞因子水平測定

采集的血液樣品置于4 ℃保存2 h，1 000×g離心20 min后取上清液，分裝，放置于－80 ℃冰箱，防止重復凍融。按照試劑盒說明書測定血清TNF-α、IL-6、IL-10、IFN-γ質量濃度。

1.3.11 NF-κB/NLRP3通路關鍵基因表達水平測定

所謂的解釋，就是說明某種現(xiàn)象何以如此。語用學的研究目的之一就是解釋語言形式何以如此。在Givón(1979:3-4)認為語言學的解釋需要涉及下面一個或多個“自然解釋性參數(shù)”：命題內容、話語語用學、語言處理器、認知結構、世界觀語用學、個體發(fā)生學的發(fā)展、歷時演變和種系發(fā)生學的進化。這些參數(shù)就是我們稱之為外部解釋的參數(shù)。語體與命題內容、話語語用學、認知結構等參數(shù)密切相關，那么語體研究能為語言學提供什么樣的解釋？這是本文試圖回答的問題。

取肺組織適量，放入裝有TRIzol的預冷研磨管進行組織研磨，提取總RNA后測定濃度和純度。按照試劑盒說明書進行逆轉錄。按表1設計PCR引物。實時熒光定量PCR程序為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s；60 ℃退火/延伸34 s，40 個循環(huán)。以GAPDH為內參基因，用2－ΔΔCt法計算腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）、TLR4、p65、NLRP3、IL-1β相對表達量。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for PCR

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 26軟件進行分析，結果用平均值±標準差表示。組間差異采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 BRAP-1理化性質、結構和組成分析

2.1.1 BRAP-1化學組成和表觀分子質量

根據(jù)總糖、糖醛酸、蛋白標準曲線方程計算得到BRAP-1總糖質量分數(shù)為56.7%，糖醛酸質量分數(shù)為13.1%，蛋白質量分數(shù)為8.9%。

如圖1所示，BRAP-1高效凝膠滲透色譜圖呈對稱單峰，說明其分子質量均一，將BRAP-1保留時間（14.64 min）代入標準曲線方程得到分子質量為6 080 Da。

圖1 BRAP-1高效凝膠滲透色譜圖Fig.1 High performance gel permeation chromatogram of BRAP-1

2.1.2 BRAP-1的FT-IR分析結果

BRAP-1樣品在3 376 cm－1處的較寬吸收峰是糖殘基—OH的伸縮振動峰，2 930 cm－1處為C—H伸縮振動峰（圖2），是多糖的特征吸收峰[23]。1 628 cm－1處為糖醛酸羧基伸縮振動峰，證明BRAP-1是含有糖醛酸結構的酸性多糖[24]。位于1 403 cm－1的吸收峰為多糖分子中多個C—H彎曲振動吸收峰[25]。1 031 cm－1處的吸收峰為吡喃環(huán)C—O伸縮振動峰[26]，結合900～800 cm－1處吸收峰可知樣品含β-吡喃糖[27]。綜上所述，BRAP-1具有多糖結構特征，并含有β-吡喃糖、糖醛酸結構，為典型的酸性多糖。

圖2 BRAP-1 FT-IR譜圖Fig.2 FT-IR spectrum of BRAP-1

2.1.3 BRAP-1單糖組成

經(jīng)酸水解和乙酰化后BRAP-1單糖組成的GC-MS圖如圖3所示。根據(jù)對照品峰及樣品峰保留時間可知，BRAP-1主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖組成，根據(jù)3 種單糖峰面積得到BRAP-1單糖物質的量比為n（葡萄糖）∶n（半乳糖）∶n（阿拉伯糖）＝4.53∶2.20∶2.07。

圖3 BRAP-1單糖組成GC-MS譜圖Fig.3 GC-MS chromatograms showing the monosaccharide composition of BRAP-1

2.2 BRAP-1對LPS誘導ALI小鼠肺濕質量/干質量比值的影響

如圖4所示，與正常組相比，模型組小鼠肺濕質量/干質量比值高度顯著升高（P＜0.001），表明LPS氣管滴注后誘導了小鼠肺組織損傷，引起組織水腫。與模型組相比，BRAP-1低、中、高劑量組小鼠肺濕質量/干質量比值呈劑量依賴性降低（P＜0.001），說明BRAP-1可緩解小鼠肺組織水腫癥狀。

圖4 BRAP-1對LPS誘導ALI小鼠肺濕質量/干質量比值的影響Fig.4 Effect of BRAP-1 on the wet/dry mass ratio of lung in LPSinduced ALI mice

2.3 BRAP-1對LPS誘導ALI小鼠肺泡灌洗液蛋白質量濃度、總細胞數(shù)的影響

如圖5 所示，與正常組相比，模型組小鼠肺泡灌洗液中蛋白質量濃度、總細胞數(shù)高度顯著升高（P＜0.001），提示LPS誘導使小鼠肺組織細胞膜通透性改變、組織蛋白滲漏、大量炎性細胞滲出并彌散于損傷的肺組織間隙。與模型組相比，BRAP-1低、中、高劑量組肺泡灌洗液蛋白質量濃度呈劑量依賴性降低（P＜0.001）。雖然BRAP-1組肺泡灌洗液總細胞數(shù)也呈劑量依賴性減少，但與模型組相比，僅中、高劑量組有顯著性差異（P＜0.01、P＜0.001），綜上，BRAP-1對LPS誘導ALI小鼠肺組織蛋白滲漏、通透性改變、炎性滲出程度有一定的緩解作用。

圖5 BRAP-1對LPS誘導ALI小鼠肺泡灌洗液蛋白質量濃度（A）、總細胞數(shù)（B）的影響Fig.5 Effect of BRAP-1 on the protein concentration (A) and total cell count (B) of alveolar lavage fluid in LPS-induced ALI mice

2.4 BRAP-1對LPS誘導ALI小鼠肺組織損傷病理變化的影響

如圖6所示，正常組小鼠肺組織結構正常、形態(tài)規(guī)則、肺泡腔清晰，肺泡及間質無明顯充血、炎癥細胞浸潤；模型組小鼠肺組織出現(xiàn)結構紊亂、形態(tài)不規(guī)則、肺泡間隔增厚，肺泡及間質明顯充血、炎癥細胞浸潤等肺損傷特征，提示肺損傷模型建立成功。與模型組相比，BRAP-1各劑量組小鼠肺組織結構形態(tài)較為規(guī)則，肺泡間隔增厚、肺泡及間質充血等情況減輕，肺泡腔內炎癥細胞浸潤減少，肺損傷明顯改善。

圖6 小鼠肺組織HE染色圖Fig.6 Images of HE stained lung tissue sections from mice

2.5 BRAP-1對LPS誘導ALI小鼠免疫因子水平的影響

如圖7 所示，與正常組相比，模型組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10、IFN-γ質量濃度高度顯著升高（P＜0.001），提示LPS誘導肺損傷可過度激活免疫系統(tǒng)，導致大量細胞因子釋放并聚集于小鼠肺部，進一步加重肺損傷。低、中、高劑量BRAP-1可劑量依賴性降低小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10、IFN-γ的含量，與模型組相比均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05、P＜0.001）。根據(jù)小鼠血清免疫因子水平變化情況可知，BRAP-1對過度激活的免疫系統(tǒng)有明顯的調節(jié)作用，說明其對小鼠肺損傷的保護作用是通過調節(jié)受損肺組織抗炎-促炎免疫調節(jié)失衡來實現(xiàn)。

圖7 BRAP-1對LPS誘導ALI小鼠血清TNF-α（A）、IL-6（B）、IL-10（C）、IFN-γ質量濃度（D）的影響Fig.7 Effect of BRAP-1 on serum TNF-α (A),IL-6 (B),IL-10 (C) and IFN-γ (D) concentrations in LPS-induced ALI mice

2.6 BRAP-1對LPS誘導ALI小鼠NF-κB/NLRP3通路關鍵基因表達的影響

如圖8所示，與正常組相比，模型組小鼠肺組織中TNFR、TLR4、p65、IL-1β、NLRP3mRNA相對表達水平均高度顯著升高（P＜0.001），表明LPS誘導的肺損傷可激活NF-κB/NLRP3通路，導致NLRP3炎性小體的過度表達，并進一步活化機體免疫系統(tǒng)，促進細胞因子的釋放加重肺損傷。與模型組相比，BRAP-1組小鼠肺組織中TNFR、TLR4、p65、IL-1β、NLRP3mRNA相對表達水平不同程度降低，提示BRAP-1可通過下調NF-κB/NLRP3通路關鍵基因轉錄水平調節(jié)炎癥因子的產(chǎn)生與釋放。

圖8 BRAP-1對LPS誘導ALI小鼠肺組織TNFR（A）、TLR4（B）、p65（C）、NLRP3（D）、IL-1β（E）mRNA表達水平的影響Fig.8 Effect of BRAP-1 on the mRNA expression levels of TNFR (A),TLR4 (B),p65 (C),NLRP3 (D) and IL-1β (E) in the lung tissue of LPS-induced ALI mice

3 討論

本實驗對BRAP-1化學組成、分子質量、結構及單糖組成進行分析，發(fā)現(xiàn)其總糖、糖醛酸、蛋白質量分數(shù)分別為56.7%、13.1%、8.9%，表觀分子質量為6 080 Da，并具有β-吡喃糖、糖醛酸結構，主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖組成，單糖物質的量比為4.53∶2.20∶2.07，上述結果可為其肺損傷保護作用研究提供基礎支撐。

LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要生物活性成分[28]，長期以來被廣泛用于肺損傷動物模型的誘導，病理模型癥狀與臨床癥狀吻合度較高。因此，本實驗采用LPS氣管滴注法建立小鼠ALI模型。已有大量研究證實肺濕質量/干質量比值、肺泡灌洗液蛋白質量濃度、總細胞數(shù)及組織切片是肺損傷重要病理指標，其變化可提示肺組織水腫、細胞膜通透性、蛋白滲漏、炎性滲出及組織病變程度。本實驗結果顯示，與肺損傷模型組相比，BRAP-1給藥組小鼠肺濕質量/干質量比值、肺泡灌洗液蛋白質量濃度、總細胞數(shù)均高度顯著降低（P＜0.001），HE染色切片中肺組織形態(tài)均有所改善，肺損傷程度明顯減弱，提示BRAP-1對LPS引起的肺損傷具有保護作用。

研究發(fā)現(xiàn)致病物質（如LPS、COVID-19）感染肺部時導致機體TNF、IL、IFN等細胞因子和趨化因子等炎癥介質大量釋放，且釋放水平與疾病嚴重程度密切相關[29-30]。機體產(chǎn)生的炎癥反應是一種防御性機制，釋放細胞因子以建立正常的免疫反應，然而過多細胞因子釋放導致的“細胞因子風暴”會急劇加重感染癥狀，甚至導致死亡[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，BRAP-1能明顯抑制肺損傷小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10、IFN-γ質量濃度，說明BRAP-1能夠調節(jié)受損肺組織抗炎-促炎免疫平衡、改善免疫因子過度釋放狀態(tài)，對小鼠的炎癥反應有顯著調節(jié)作用。

進一步研究作用機制發(fā)現(xiàn)，BRAP-1對炎癥相關疾病中的關鍵通路NF-κB/NLRP3具有調節(jié)作用。BRAP-1給藥組小鼠肺組織中，與啟動此通路相關的兩種關鍵受體——TLR4和TNFR的mRNA表達量降低。與此同時，NLRP3炎性小體及其上游NF-κB p65和下游關鍵細胞因子IL-1β的基因mRNA表達量均顯著降低。提示BRAP-1可調控NF-κB/NLRP3通路相關因子轉錄水平。

綜上所述，BRAP-1對小鼠肺損傷有保護作用。其機制為，一方面調節(jié)受損肺組織抗炎-促炎免疫調節(jié)平衡，從而減輕肺組織損傷；另一方面，可能通過下調NF-κB/NLRP3通路相關因子轉錄水平抑制炎癥因子的產(chǎn)生與釋放。然而，BRAP-1三維空間結構及其對小鼠肺損傷保護作用的分子結構關聯(lián)還需進一步的研究與探討。