陳 慶,李乙航,趙金燕,吳曉玲,謝秀英

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院,陜西 西安 710004;2.長春生物制品研究所有限責(zé)任公司,吉林 長春 130012)

宮頸癌是一種常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤,也是導(dǎo)致發(fā)展中國家女性腫瘤死亡的首要原因[1]。近年來,宮頸癌的發(fā)病呈現(xiàn)年輕化趨勢,是女性健康的重大威脅。雖然高危HPV感染導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生已經(jīng)被證實[2],然而,宮頸癌發(fā)生的具體機制尚未闡述清楚。微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一類長度約為18～22個核苷酸的非編碼RNA,通過與特定基因的3’-UTR區(qū)結(jié)合,抑制相應(yīng)mRNA的翻譯[3]。據(jù)估計,miRNA控制了大約30%的蛋白質(zhì)編碼基因組[4]。近年來的研究[5]表明,miRNA在許多生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用,例如細胞增殖、分化、發(fā)育、代謝。miRNA的異常表達或改變與許多人類疾病相關(guān),包括心血管疾病、眼部疾病、炎癥和癌癥等[6]。微小核糖核酸34a(miR-34a)是miR-34家族的重要成員,近來發(fā)現(xiàn)其在腫瘤進展中發(fā)揮重要作用,可影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移等[7]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1 (Silent information regulator 1,SIRT1)是一種保守的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的去乙?；?在細胞凋亡、細胞衰老、炎癥和腫瘤發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用[8]。已有研究報道SIRT1可通過促進去乙?；癱atenin的核轉(zhuǎn)位促進宮頸癌發(fā)展[9]。然而,目前SIRT1和miR-34a在宮頸癌進展中的關(guān)系尚未完全闡明。本研究旨在探索miR-34a及SIRT1在宮頸癌中的表達及其相互關(guān)系,以期為宮頸癌的臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取 2016 年 1 月至 2017 年 12 月于本院住院治療的宮頸癌患者 50 例為研究對象,同期因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)的患者30例作為對照組。50例宮頸癌患者年齡28～75歲,病例納入標準:符合宮頸癌診斷標準,且經(jīng)病理檢查確診為宮頸鱗狀細胞癌或腺癌;術(shù)前無放化療治療;無精神異常及交流障礙。排除標準:既往患有其他惡性腫瘤;術(shù)前接受放化療或免疫治療;伴有嚴重心、肝、腎等臟器功能不全;臨床資料不完整?；颊邔Ρ狙芯恐椴⒑炇鹬橥鈺?本研究獲得西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(No.2016077)。

1.2 主要試劑與儀器 SIRT-1兔抗人單克隆抗體(bs-2257R)購自北京博奧森生物技術(shù)公司,免疫組化試劑盒(PV-6001)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司, Trizol(15596-026)購自美國Invitrogen公司;miRNA熒光定量檢測試劑盒購自Applied Biosystems公司;熒光定量PCR儀(美國ABI公司);OLYM-PUS顯微鏡(日本OLYMPUS 公司)。

1.3 RT-qPCR檢測miR34a表達 采用Trizol提取總RNA,隨后將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用 Taq Man miRNA檢測試劑盒檢測 miR-34a表達,以U6作為內(nèi)源性對照,操作步驟嚴格按照說明書進行。反應(yīng)條件為:95 ℃ 預(yù)變性 10 min,95 ℃ 變性15 s,60 ℃退火 30 s,72 ℃ 延 伸 30 s,總共進行40個循環(huán)。采用 2-ΔΔCt法計算 miR-34a 相對表達水平。引物序列如下:miR-34a 上游引物5’-GGCAGTGTCTTAGCTGGTTG-3’,miR-34a下游引物5’-CCCGTTGGCAGTGTCTTAGCT-3’;U6 上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,U6 下游引物5’-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.4 免疫組化檢測SIRT1蛋白表達 福爾馬林固定,石蠟包埋,組織切片(厚度4 μm),二甲苯脫蠟、梯度酒精水化,枸櫞酸鈉緩沖液(pH 6.0)中抗原熱修復(fù)2 min。3%過氧化氫封閉10 min,SIRT1一抗(1∶150), 4 ℃ 過夜,PBS洗滌,加入辣根過氧化物酶標記的二抗,37 ℃孵育30 min,PBS洗滌,DAB 顯色,蘇木素復(fù)染,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片。PBS代替一抗作為陰性對照。陽性結(jié)果判斷:隨機觀察5個視野,將陽性細胞百分率分為5個等級,分別評分為:<5%為0;5%～25%為1;25%～50%為2;50%～75%為3;>75%為4。按染色強度分為4個等級,分別評分為:陰性,背景色相同或不染色為0;弱,染色呈淡黃色為1;中,染色呈黃或棕黃色為2;強,染色呈黃褐色為3。 最終評分按下列公式計算:免疫反應(yīng)評分(IRS) =陽性細胞百分率評分×染色強度評分,評分>3為陽性。

2 結(jié) 果

2.1 miR-34a在宮頸癌組織中的表達 RT-qPCR檢測顯示,與正常宮頸組織(1.00±0.27)相比較,miR-34a在宮頸癌組織(0.52±0.21)中的相對表達水平明顯降低(P<0.01)。根據(jù)miR-34a在宮頸癌組織表達的均值(0.52),分為高miR-34a表達組(40例)和低miR-34a表達組(10例)。對miR-34a表達和宮頸癌患者的臨床病理特征進行相關(guān)分析,見表1。結(jié)果表明,miR-34a的表達與患者年齡、淋巴轉(zhuǎn)移以及病理類型無相關(guān)性(均P>0.05);而與FIGO分期、腫瘤分化程度呈顯著相關(guān)(均P<0.05)。

表1 miR-34a 表達與宮頸癌患者臨床病例特征的關(guān)系[例(%)]

2.2 SIRT1在宮頸癌組織中的表達 免疫組化結(jié)果顯示,SIRT1在宮頸癌組織中的表達明顯高于正常宮頸組織。半定量分析顯示,SIRT1免疫反應(yīng)評分在宮頸癌組織(7.1±2.37)與正常宮頸組織(4.1±1.61)比較中存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。SIRT1在宮頸癌及正常宮頸組織中的陽性率分別為84%和20%,兩者相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

A:正常宮頸組織陰性表達; B:正常宮頸組織陽性表達;C:宮頸癌組織陰性表達;D:宮頸癌組織陽性表達

2.3 SIRT1在宮頸癌組織中的表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 SIRT1蛋白在宮頸癌組織中的表達水平與宮頸癌分化程度顯著相關(guān)(均P<0.05),與患者年齡、宮頸癌FIGO分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及病理類型無相關(guān)性(均P>0.05),見表2。

表2 SIRT1 表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

2.4 宮頸癌組織中miR-34a與SIRT1表達的相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析顯示,宮頸癌組織中miR-34a與SIRT1表達呈顯著負相關(guān)(r=-0.327,P<0.05),見表3。

表3 宮頸癌組織中miR-34a 與SIRT1表達的相關(guān)性[例(%)]

3 討 論

根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù),宮頸癌是女性第四大常見癌癥。2018年在全球范圍內(nèi),大約有57萬例女性被診斷出宮頸癌,其中約有31.1萬例女性死于這種疾病。與發(fā)達國家相比,宮頸癌在發(fā)展中國家更為常見,宮頸癌仍是女性健康的巨大威脅。目前宮頸癌的發(fā)病機制尚未完全闡明,因此,積極探索宮頸癌的病理機制,對于尋找宮頸癌新的臨床治療靶點和改善預(yù)后具有重要意義。

最近的研究表明,miRNA可能是HPV相關(guān)癌癥發(fā)生和發(fā)展的標志物,有研究已證實miRNA和HPV癌蛋白之間的相互作用。此外,基因芯片研究還發(fā)現(xiàn)幾種miRNA在宮頸組織中的表達。有些miRNA是上調(diào)的,如miR-21、miR-24和miR-155,而有些miRNA是下調(diào)的,如miR-100、miR-145等。近年來,有研究[10-11]報道,miR-34在一些不同類型的腫瘤中是下調(diào)或失活的,如乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、宮頸癌及肺癌等。本研究發(fā)現(xiàn)miR-34a在宮頸癌的表達明顯低于對照組,這證實了以前關(guān)于miR-34a在宮頸癌中呈低表達的相關(guān)研究[12]。也提示miR-34a在宮頸癌發(fā)展中可能具有重要作用。

miR-34a 定位于染色體1p36.23,是腫瘤抑制的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[13]。如:Luo等[14]報道m(xù)iR-34a可通過靶向promimin1抑制喉癌細胞的增殖;Jiang 等[15]發(fā)現(xiàn)miR-34a通過下調(diào)CDC25A表達抑制宮頸癌的生長及轉(zhuǎn)移;Xu等[16]發(fā)現(xiàn)miR-34a在黑色素瘤組織是下調(diào)的,并可通過靶向ZEB1抑制黑色素瘤細胞及黑色素移植瘤的生長。miR-34a參與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展,可能是宮頸癌預(yù)后的新型標記物。通過將宮頸癌患者分為miR-34a高表達及低表達兩個亞組發(fā)現(xiàn),miR34a表達與宮頸癌FIGO分期及腫瘤分化程度顯著相關(guān),而與患者年齡、淋巴轉(zhuǎn)移及病理類型無顯著相關(guān),這表明miR-34a表達與腫瘤進展密切相關(guān)。

SIRTl屬于煙酰胺(NAD+)依賴的Ⅲ類組蛋白去乙?；窼irtuins家族,人類SIRTl基因位于10q22.1,長約33 kb,蛋白質(zhì)分子量約為60 kD,具有NAD依賴的脫乙酰基酶活性[17]。大量研究已經(jīng)證實SIRT1在腫瘤形成過程扮演重要角色,SIRTl在許多腫瘤中出現(xiàn)異常表達,例如乳腺癌[18]、宮頸癌[19]、胃癌[20]、肝細胞癌[21]等。SIRT1影響腫瘤細胞的凋亡、增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲等生物學(xué)特性;研究[22]發(fā)現(xiàn),在宮頸癌中SIRT1是高表達的,干擾SIRT1的表達可導(dǎo)致宮頸癌細胞增殖抑制和凋亡增加。本研究還發(fā)現(xiàn),SIRTl在宮頸癌組織中呈高表達,SIRT1在宮頸癌中的陽性率明顯高于正常宮頸組織,這也與以前的研究相一致[23]。并且SIRT1表達與宮頸癌分化程度密切相關(guān),表明SIRT1可能在宮頸癌的發(fā)展中起重要作用。進一步的相關(guān)性分析顯示,SIRT1和miR-34a在宮頸癌組織中的表達呈負相關(guān),這提示在宮頸癌發(fā)展中miR-34a與SIRT1可能相互作用。Mirtarbase預(yù)測顯示SIRT1可能是miR-34a的靶基因,這進一步提示,miR-34a可能通過靶向SIRT1在宮頸癌發(fā)展中發(fā)揮作用[24]。

SIRT1在腫瘤的發(fā)展中起關(guān)鍵作用,Deng 等[25]發(fā)現(xiàn)在胃癌中miRNA-34a通過靶向SIRT1調(diào)控胃癌細胞的增殖和凋亡,在胃癌進展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。另一方面,miR-34a表達與高危型HPV感染有關(guān),有報道表明miR-34a在高危HPV (HR-HPV)感染組織中表達明顯降低[26]。miR-34a是p53的下游靶點,在宮頸癌發(fā)生中,HPV-E6癌蛋白結(jié)合p53后,通過泛素依賴的蛋白酶體系統(tǒng)靶向其降解[27]。p53的失活導(dǎo)致可用來結(jié)合miR-34啟動子區(qū)域的蛋白數(shù)量減少,進而導(dǎo)致miR-34a在大多數(shù)HPV感染組織中的表達下調(diào)。

綜上所述,本研究結(jié)果表明miR-34a在宮頸癌組織中呈低表達,SIRT1在宮頸癌中高表達,兩者表達水平呈負相關(guān)。這為宮頸癌的臨床治療提供了一個潛在的分子靶點。然而,本研究也有一些局限,例如:本研究納入病例較少,需納入多中心研究進一步擴大樣本量。其次,本研究未對miR-34a在宮頸癌中的作用機制進行深入探索。下一步,我們除進一步擴大樣本量外,還打算對miR-34a在宮頸癌中的抑癌機制進行深入研究。