蔡徐依，田亞雄，陳潘毅，葛朋彪，張六六，李娟英，4*

（1.上海海洋大學(xué)海洋生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，上海 201306；2.蘇州鼎興斯沃水產(chǎn)養(yǎng)殖設(shè)備有限公司，江蘇 蘇州 210095；3.江蘇納克生物工程有限公司，江蘇 淮安 211700；4.上海河湖生物鏈構(gòu)建與資源化利用工程技術(shù)研究中心，上海 201702）

近年來，我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，殘留在養(yǎng)殖池塘的富含蛋白質(zhì)的飼料、死亡的養(yǎng)殖生物和浮游動(dòng)植物、養(yǎng)殖生物排泄物等導(dǎo)致養(yǎng)殖水體中氮、磷和耗氧性有機(jī)物等頻頻超標(biāo)，對(duì)池塘水質(zhì)、養(yǎng)殖生物生長以及周圍的生態(tài)系統(tǒng)均產(chǎn)生了潛在的負(fù)面影響[1]。因此，改善現(xiàn)有養(yǎng)殖池塘水體質(zhì)量迫在眉睫。江蘇、浙江、湖南、廣東和海南等地出臺(tái)的《養(yǎng)殖尾水排放標(biāo)準(zhǔn)》中將化學(xué)需氧量（CODMn）、總氮（TN）和總磷（TP）作為控制指標(biāo)。CODMn會(huì)使水體中細(xì)菌及藻類大量繁殖，誘發(fā)養(yǎng)殖生物病變[2]；離子氨（NH+4）和非離子氨（NH3）也是誘發(fā)對(duì)蝦暴發(fā)疾病的關(guān)鍵因素，當(dāng)氨氮長時(shí)間維持在較高水平（>0.5 mg·L-1）時(shí)，凡納濱對(duì)蝦免疫力明顯下降，對(duì)病原菌的易感性提高[3]；TP 雖不會(huì)引起病害的發(fā)生，但過高的TP 會(huì)引起池塘水華[4]，影響?zhàn)B殖水體健康。

目前，養(yǎng)殖水體的處理方法主要有原位和異位處理[5]。異位處理是將受污染的養(yǎng)殖水體排出池塘進(jìn)行凈化處理后再排放，這種方法處理周期長，并且會(huì)產(chǎn)生額外的處理成本以及占用土地資源[6]。而原位處理較異位修復(fù)更直接、快速、經(jīng)濟(jì)，不僅可以有效減少養(yǎng)殖尾水中污染物的排放量，也可以改善養(yǎng)殖用水水質(zhì)，從而提高養(yǎng)殖水產(chǎn)品品質(zhì)[7]。為降低養(yǎng)殖水體中污染物濃度，人們常采用原位加注新水，投加漂白粉或沸石等，對(duì)養(yǎng)殖水體進(jìn)行稀釋、氧化以及離子交換等各種物理和化學(xué)處理方法，但這些方法的局限性非常明顯，如水質(zhì)凈化效果不理想、不穩(wěn)定且可能帶來二次污染[8]。

因此，具有良好的生態(tài)安全性、經(jīng)濟(jì)性的生物處理法，如生物膜法、噴灑游離微生物（生物制劑）等被用于原位處理養(yǎng)殖水體，但這些傳統(tǒng)方法也常伴有成本高、出水水質(zhì)不穩(wěn)定等問題[9]。隨著研究的深入，從傳統(tǒng)生物處理方法中衍化而來的固定化微生物原位修復(fù)技術(shù)得到了越來越多的關(guān)注[10]。固定化微生物處理技術(shù)能高效降解或去除污水中的營養(yǎng)物質(zhì)，如：孟壯等[11]將固定化微生物技術(shù)與納濾組合工藝結(jié)合處理生活污水，污水中的COD 和氨氮的去除率均達(dá)到99%以上；李端林等[12]利用固定化微生物處理印染模擬廢水，COD 的平均去除率可達(dá)90%以上。但是，目前關(guān)于固定化微生物原位投加緩釋微生物凈化養(yǎng)殖水質(zhì)的相關(guān)研究和實(shí)踐應(yīng)用案例相對(duì)較少，仍處于探索階段。因此，本文選擇凹凸棒土作為固定化載體，制備固定化微生物小球，在實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證其顆粒性能及處理效果的基礎(chǔ)上[13]，將其添加到微孔曝氣生物反應(yīng)器中，原位應(yīng)用于養(yǎng)殖池塘的尾水處理，驗(yàn)證其對(duì)養(yǎng)殖池塘水體污染物的原位凈化效果，同時(shí)以底泥和水體中的微生物作為研究對(duì)象，研究固定化菌劑的添加對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)變化的影響，以期為固定化菌劑原位凈化養(yǎng)殖水體提供理論指導(dǎo)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 養(yǎng)殖池塘固定化微生物反應(yīng)器的投放

將約20 kg 固定化微生物顆粒（顆粒負(fù)載微生物量理論值分別為20 億·g-1和50 億·g-1，購自江蘇納克生物工程有限公司）裝入微孔鋼管（直徑約15 cm、長約250 cm）內(nèi)（圖1a），固定在微孔曝氣設(shè)備底部曝氣管上方，并在其上方安裝數(shù)十片表面粗糙多孔的無菌膜掛片，從而可以在開啟增氧機(jī)時(shí)，為水產(chǎn)動(dòng)物與固定化微生物顆粒緩釋微生物提供充足氧氣，促使掛片上的微生物快速掛膜并迅速繁殖。選擇上海市奉賢區(qū)思陽水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)合作社（30°52'20″N，121°23'18″E）內(nèi)大?。總€(gè)塘水面約0.4 hm2）、環(huán)境條件接近并且對(duì)蝦生長階段一致的凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘作為實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組（n=2）與對(duì)照組（n=2）兩個(gè)處理。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中加入3 臺(tái)裝有固定化微生物的微孔曝氣設(shè)備，而對(duì)照組內(nèi)只有增氧設(shè)備，不添加固定化微生物。增氧機(jī)開啟時(shí)長一般為14 h·d-1。

圖1 固定化菌劑的曝氣機(jī)示意圖與池塘現(xiàn)場(chǎng)運(yùn)行圖Figure 1 Schematic diagram of aerator with immobilized bacterial agent and operation diagram in pond

1.2 樣品的采集

整個(gè)實(shí)驗(yàn)覆蓋2021年和2022年兩個(gè)對(duì)蝦養(yǎng)殖周期，凡納濱對(duì)蝦的完整養(yǎng)殖過程均進(jìn)行水樣采集，由于仔蝦階段幾乎不投加餌料，水質(zhì)變化較小，因此水樣采集集中在幼蝦和成蝦階段，直到產(chǎn)品上市。水樣采集的具體時(shí)間如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的水樣采集Table 1 Water sample collection of experimental and control ponds

水樣采集方法：使用5 點(diǎn)采樣法對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組水體用有機(jī)玻璃采水器采集表層水（深度為0.2 m），水樣充分混合后，裝入采樣瓶中低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，保存于4 ℃冰箱，盡快進(jìn)行分析檢測(cè)。

水體微生物群落樣品采集方法：用滅菌后的有機(jī)玻璃采水器將采集的表層水（深度為0.2 m）混勻后，裝入無菌采樣瓶中，置于含冰袋的恒溫箱帶回實(shí)驗(yàn)室，選取無菌的0.22 μm 混合纖維素（MCE）濾膜抽濾，并將濾膜置于無菌離心管中，保存于-80 ℃冰箱內(nèi)，用于提取DNA。

底泥微生物群落樣品采集方法：用抓斗式采泥器采集池塘表層5 cm 沉積物樣品，用無菌取樣器去掉暴露在外空氣部分后混勻，裝入無菌離心管，并使用含冰袋的恒溫箱帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-80 ℃冰箱保存，以備DNA提取。

1.3 微生物群落樣品中總DNA的提取方法

根據(jù)E.Z.N.A.?soil DNA kit（Omega Bio-tek，Nor?cross，GA，英國）對(duì)底泥與水體樣品中的總DNA 進(jìn)行抽提。提取后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 樣品質(zhì)量，并用NanoDrop2000測(cè)定DNA的濃度和純度；同時(shí)對(duì)16S rRNA 基因V3~V4 區(qū)域進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，正向引物采用338F（5' -ACTCCTACGGGAGGCAG?CAG-3'），反 向 引 物 為806R（5' - GGACTACH?VGGGTWTCTAAT-3'）。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)。

使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)混合后的同一樣品PCR 產(chǎn)物，利用AxyPrepDNA Gel ExtractionKit（Ax?ygen Biosciences，Union City，CA，英國）回收產(chǎn)物；使用Tris_HCl 洗脫后，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。根據(jù)電泳初步定量結(jié)果，使用Quantus?Fluorometer（Promega，英國）對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)定量。

1.4 高通量測(cè)序

在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的Illumina Miseq PE300 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序分析。使用Uparse 軟件，以97%的相似度對(duì)非重復(fù)序列進(jìn)行聚類分析，得到一個(gè)OTU（Operational taxonomic units）聚類；使用Qi?ime平臺(tái)對(duì)比silva數(shù)據(jù)庫對(duì)樣品序列進(jìn)行α多樣性分析，設(shè)置置信度閾值為70%；使用Qiime中Bray-Curtis計(jì)算β 多樣性距離矩陣；使用R 語言（version 3.3.1）工具統(tǒng)計(jì)和繪制Veen 圖、群落柱形圖、PCoA 統(tǒng)計(jì)分析等。原始測(cè)序數(shù)據(jù)均已上傳至NCBI 序列讀取檔案（SRA），登記號(hào)為PRJNA914236。

1.5 水質(zhì)分析方法

采用國標(biāo)法測(cè)定水體中的氨氮、CODMn和TP 含量。所有指標(biāo)樣品設(shè)3 個(gè)平行樣，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本文采用Origin 2021 軟件完成數(shù)據(jù)處理及繪制，誤差棒均為標(biāo)準(zhǔn)差。使用軟件SPSS 23.0 獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P<0.05為有顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化菌劑曝氣裝置原位凈化養(yǎng)殖水體的效果

2.1.1 對(duì)CODMn的去除效果

對(duì)蝦養(yǎng)殖過程中，從幼蝦到成蝦期，CODMn呈現(xiàn)總體上升趨勢(shì)（圖2）。將兩年實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組采集的水樣CODMn濃度與養(yǎng)殖尾水排放一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（CODMn≤15 mg·L-1）相比，對(duì)照組水質(zhì)達(dá)標(biāo)率僅為20%，而實(shí)驗(yàn)組達(dá)標(biāo)率為70%，可見固定化菌劑的投加對(duì)池塘水質(zhì)改善作用明顯。2021 年對(duì)蝦養(yǎng)殖季受到“燦都”臺(tái)風(fēng)的影響，CODMn波動(dòng)幅度較大[14]，去除率不穩(wěn)定（3.03%~57.05%），平均去除率為26.14%；2022 年提高了凹凸棒土固定化菌劑的負(fù)載量（從20 億提高到50 億）后，其對(duì)外界環(huán)境變化的適應(yīng)能力增強(qiáng)，對(duì)CODMn的去除率也顯著提升（24.56%~69.42%），平均去除率為52.49%。以往實(shí)驗(yàn)室中凹凸棒土固定化小球降解CODMn的去除率能穩(wěn)定在70%左右，說明現(xiàn)場(chǎng)養(yǎng)殖的復(fù)雜環(huán)境會(huì)對(duì)固定化菌劑降解CODMn造成一定影響。王妹等[15]利用枯草芽孢桿菌調(diào)節(jié)養(yǎng)殖池塘水質(zhì)，其中COD 的去除率僅為22.9%；王雪峰等[16]使用光合細(xì)菌與芽孢桿菌協(xié)同凈化養(yǎng)殖水體，CODMn降解率最高為40.13%。本研究所使用的凹凸棒土固定化菌劑耦合微孔曝氣的原位處理裝置去除養(yǎng)殖水體中CODMn的優(yōu)勢(shì)明顯。以往研究顯示，芽孢桿菌是具有高活性消化酶系的異養(yǎng)細(xì)菌[17]，其能迅速降解養(yǎng)殖水體中的有機(jī)物，包括殘余餌料、排泄物等。因此，本實(shí)驗(yàn)所使用的含6 種復(fù)合芽孢桿菌的固定化菌劑，可能通過優(yōu)化養(yǎng)殖水體中的微生物群落結(jié)構(gòu)，達(dá)到了降低水體CODMn濃度的目的。

圖2 固定化菌劑原位凈化對(duì)養(yǎng)殖水體中CODMn的去除效果Figure 2 In-situ purification of CODMn in aquaculture water by immobilized bacterial agent

2.1.2 對(duì)氨氮的去除效果

養(yǎng)殖水體中的氨氮主要來自于排泄物、殘餌、浮游生物殘骸等，是影響對(duì)蝦生長的敏感水質(zhì)參數(shù)[18]。氨氮濃度過高會(huì)影響凡納濱對(duì)蝦的能量代謝活動(dòng)，損害其鰓、肝、腎、脾和甲狀腺組織，控制氨氮在0.5 mg·L-1以下可以避免其對(duì)蝦的負(fù)面影響[19]。整個(gè)養(yǎng)殖周期中（圖3），隨著凡納濱對(duì)蝦的生長，逐漸增多的排泄物以及飼料殘餌等導(dǎo)致對(duì)照組氨氮明顯升高，養(yǎng)殖后期最高可達(dá)2.22 mg·L-1，顯著高于0.5 mg·L-1。在對(duì)蝦兩年的完整養(yǎng)殖周期內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組氨氮濃度都顯著低于對(duì)照組（P<0.05），且都保持在較低水平（<0.5 mg·L-1）。尤其投料和排泄均增加的成蝦期的對(duì)比更為明顯，2021 年成蝦期的去除率有些許波動(dòng)（31.94%~99.93%），伴隨著2022年固定化顆粒負(fù)載微生物量的提高，水中氨氮濃度低于0.5 mg·L-1且狀態(tài)穩(wěn)定，氨氮的平均去除率也從2021 年的76.21%提升到了90.73%，與實(shí)驗(yàn)室小試結(jié)果接近。據(jù)分析，加入固定化菌劑顆粒提高了水體中的微生物對(duì)CODMn的降解能力，使得水體中的CODMn濃度維持在較低水平，碳源減少導(dǎo)致異氧細(xì)菌增殖速率下降，有助于硝化細(xì)菌的增殖[20]，從而進(jìn)一步促進(jìn)了水中氨氮的轉(zhuǎn)化[21]，表現(xiàn)為氨氮濃度維持在較低且穩(wěn)定的水平。張達(dá)娟等[22]利用游離的硝化細(xì)菌凈化凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘中的氨氮去除率為88.83%，Zhang 等[23]在養(yǎng)殖池塘內(nèi)原位使用生態(tài)基質(zhì)，養(yǎng)殖水體中氨氮的去除率達(dá)到46.36%，兩結(jié)果均低于本研究固定化菌劑原位凈化氨氮的去除率。

圖3 固定化菌劑原位凈化對(duì)養(yǎng)殖水體中氨氮的去除效果Figure 3 In-situ purification of ammonia in aquaculture water by immobilized bacterial agent

2.1.3 對(duì)TP的影響磷對(duì)于維持養(yǎng)殖池塘生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定有重要作用。本實(shí)驗(yàn)中，池塘水體TP 濃度較為穩(wěn)定（圖4），2021年實(shí)驗(yàn)組池塘水體中TP濃度范圍為（0.044±0.006）~（0.088±0.030）mg·L-1，對(duì)照組TP 濃度范圍為（0.012±0.030）~（0.084±0.020）mg·L-1，無明顯差異（P>0.05），且均低于養(yǎng)殖尾水排放一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)即總磷≤0.5 mg·L-1，可直接排放[24]。

圖4 固定化菌劑原位應(yīng)用養(yǎng)殖過程中水體TP濃度Figure 4 TP concentration in water during in-situ application of immobilized bacterial agent

2.2 固定化菌劑曝氣裝置投放對(duì)微生物多樣性的影響

由實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組水質(zhì)處理效果可以看出，固定化菌劑曝氣裝置的投放對(duì)養(yǎng)殖水體中污染物的去除效果顯著，這可能與池塘微生物群落的改變密切相關(guān)。為了解固定化菌劑的添加對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境（包括水體與底泥）中微生物菌群動(dòng)態(tài)變化規(guī)律與水質(zhì)變化的相互關(guān)系，從凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘共獲取水樣和泥樣32 個(gè)，并對(duì)其進(jìn)行16S rRNA 測(cè)序。將所測(cè)的原始序列經(jīng)過去雜、拼接質(zhì)控去除嵌合體后共獲得有效序列26 391 條。微生物群落的多樣性在維持生態(tài)功能方面有重要的作用，多樣性高代表樣品微生物群落功能穩(wěn)定性較好，對(duì)蝦患病風(fēng)險(xiǎn)低[25]。因此本文分析了固定化菌劑投放后池塘環(huán)境中微生物多樣性的變化。

2.2.1 微生物的α多樣性分析

本文選取Shannon指數(shù)和Chao指數(shù)（圖5）表征池塘環(huán)境中微生物的多樣性與豐富度[26]。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組底泥樣本在養(yǎng)殖過程中Shannon 指數(shù)無顯著性差異（P>0.05）。而實(shí)驗(yàn)組的水體中因加入了固定化菌劑顆粒，顆粒微生物良好的“緩釋”性能（1 g可釋放約1.5×108CFU 的微生物）[13]使養(yǎng)殖水體中微生物多樣性Shannon 指數(shù)顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。但因養(yǎng)殖后期對(duì)蝦成熟準(zhǔn)備上市，減少了飼料的投加，水體中微生物所需養(yǎng)分缺乏（CODMn下降，圖2），導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)組水體中微生物多樣性在對(duì)蝦收獲末期偏低。同時(shí)，通過豐富度Chao 指數(shù)可以觀察到，養(yǎng)殖期間總體保持平穩(wěn)，個(gè)別強(qiáng)降雨事件會(huì)導(dǎo)致水體微生物豐富度下降，但加入固定化菌劑后實(shí)驗(yàn)組的底泥與水體中的微生物豐富度均顯著高于對(duì)照組（P<0.05），說明對(duì)蝦養(yǎng)殖過程中固定化菌劑曝氣裝置不斷向水體中緩釋有利于污染物降解的菌株，不僅可以提高水體微生物的多樣性，同時(shí)增加了環(huán)境微生物群落豐富度[27]，使得有利于降解養(yǎng)殖水體污染物的菌群數(shù)量增多，更好地降解養(yǎng)殖水體中的污染物。

圖5 養(yǎng)殖環(huán)境中微生物群落的Shannon指數(shù)和Chao指數(shù)Figure 5 Shannon and Chao index of microbial community in aquaculture environment

2.2.2 微生物的OTU分布及β多樣性分析

微生物樣品測(cè)序結(jié)果構(gòu)建的Venn 圖如6a 所示。底泥樣本中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組獲得的OTU 數(shù)分別為6 906個(gè)和6 552個(gè)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組底泥獨(dú)有的OTU數(shù)分別為1 131 個(gè)（12.88%）和887 個(gè)（10.10%）。同時(shí)，水體樣本中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組獲得的OTU 數(shù)分別為2 554個(gè)和2 221個(gè)，實(shí)驗(yàn)組水體和對(duì)照組水體獨(dú)有的OTU 數(shù)分別為193 個(gè)（2.20%）和138 個(gè)（1.57%）。表明固定化菌劑緩釋不僅增加了實(shí)驗(yàn)組環(huán)境微生物OTU 的數(shù)量，且獨(dú)有的OTU 數(shù)也相應(yīng)增加，養(yǎng)殖環(huán)境微生物豐富度提升，有助于水體污染物降解[28]，由2.1可得實(shí)驗(yàn)組水質(zhì)確實(shí)更優(yōu)。同時(shí)實(shí)驗(yàn)組中底泥與水體共有的OTU數(shù)為112個(gè)，而對(duì)照組中僅共有56個(gè)。

基于Bray-Curtis 距離算法進(jìn)行主坐標(biāo)分析（PCoA）后，對(duì)底泥與水體中群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行聚類的結(jié)果如圖6b 所示。PC1 軸對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)變化的解釋率為53.20%，PC2 軸的解釋率為9.03%。底泥實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組距離接近，紅色與藍(lán)色置信橢圓幾乎重合，說明投加固定化菌劑對(duì)底泥微生物的影響相對(duì)較小，兩者微生物組成結(jié)構(gòu)相似度較高[29]，群落差異較小，與上文底泥多樣性指數(shù)無顯著性差異吻合，這與底泥較為穩(wěn)定、流動(dòng)性較差的性質(zhì)有關(guān)[30]。而水體中微生物組成差異較大，其中實(shí)驗(yàn)組水體初始值與養(yǎng)殖過程其余綠色點(diǎn)位形成綠色置信橢圓的面積大于對(duì)照組的黃色置信橢圓，表明實(shí)驗(yàn)組微生物變化更大。綜合而言，固定化菌劑向養(yǎng)殖環(huán)境內(nèi)緩釋菌群可能增加了水體中某些特定微生物數(shù)量，對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境的微生物群落結(jié)構(gòu)造成影響。

圖6 底泥與水體微生物OTU維恩圖及柱狀統(tǒng)計(jì)圖（a）和底泥與水體微生物群落的PCoA分析（b）Figure 6 Statistical results of OTU of microorganisms in sediments and water（a）and PCoA analysis of microbial communities in sediment and water（b）

2.3 固定化菌劑曝氣裝置投放對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

固定化顆粒的緩釋可能會(huì)促進(jìn)池塘環(huán)境中微生物群落的改變，促進(jìn)特定群落的增殖或凋亡，從而改善養(yǎng)殖池塘水質(zhì)。從門水平優(yōu)勢(shì)細(xì)菌相對(duì)豐度可知（圖7），實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組水體中豐度大于5%的優(yōu)勢(shì)菌門[31]有藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobateria，36.76%和32.89%）、變形菌門（Proteobacteria 22.59%和20.15%）、放線菌門（Actinobacteriota，18.21% 和23.48%）、擬桿菌門（Bacteroidota，11.22%和14.02%），這與李革雷等[32]研究不同養(yǎng)殖模式下水體內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌門一致。相較對(duì)照組水體，實(shí)驗(yàn)組中藍(lán)細(xì)菌門、變形菌門等的相對(duì)豐度顯著提升，放線菌門、擬桿菌門等相對(duì)豐度則顯著降低。同時(shí)，添加固定化菌劑使得水體中的厚壁菌門（Firmicutes）相對(duì)豐度從對(duì)照組的0.26%提升至實(shí)驗(yàn)組的1.13%。養(yǎng)殖池塘水體中反映藍(lán)藻數(shù)量的藍(lán)細(xì)菌門相對(duì)豐度與以往土塘養(yǎng)殖研究吻合[33]，對(duì)照組藍(lán)藻相對(duì)豐度較實(shí)驗(yàn)組下降，而水體中TP 無顯著性差異。據(jù)分析是由于對(duì)照組養(yǎng)殖后期一部分對(duì)蝦發(fā)生了病變，減少了飼料投加，藍(lán)藻因缺乏養(yǎng)分相對(duì)豐度較低，而通過測(cè)定水質(zhì)后發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組水體中CODMn高于實(shí)驗(yàn)組，說明對(duì)照組水體中的有機(jī)污染物無法被藍(lán)藻利用。實(shí)驗(yàn)組中的藍(lán)藻可通過人工打撈等方式減少。變形菌門是自然環(huán)境中最常見的菌群，在很多養(yǎng)殖環(huán)境中也占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，且變形菌門類細(xì)菌在反硝化過程中占主導(dǎo)地位[34]，實(shí)驗(yàn)組變形菌門更高，因此實(shí)驗(yàn)組水體氨氮濃度穩(wěn)定在較低水平。而放線菌門作為優(yōu)勢(shì)門其作用主要是能促使動(dòng)物和植物遺骸腐爛，能有效降低廢水中的耗氧性有機(jī)污染物（本文用CODMn表示）[35]，但也存在致病菌[36]，實(shí)驗(yàn)組水體中放線菌門豐度比對(duì)照組低，據(jù)分析是固定化菌劑的加入使得實(shí)驗(yàn)組內(nèi)水體中CODMn被快速降解，CODMn濃度低導(dǎo)致放線菌門豐度相對(duì)降低。水體中的擬桿菌門是溶解性有機(jī)物的主要消費(fèi)者[37]。以往研究表明，當(dāng)養(yǎng)殖水體中有殘留餌料和生物糞便未被及時(shí)分解時(shí)，擬桿菌門細(xì)菌含量會(huì)增加[38]。因此，對(duì)照組中擬桿菌門含量更高，其原因是池塘內(nèi)溶解性有機(jī)物未被及時(shí)分解，而實(shí)驗(yàn)組良好的水質(zhì)降低了該菌種的生存空間。

圖7 底泥與水體微生物門水平下的物種豐度Figure 7 Species abundance at the level of microbial phylum in sediment and water

同時(shí)，從門水平優(yōu)勢(shì)細(xì)菌相對(duì)豐度可知（圖7），實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組底泥中占比前3 的優(yōu)勢(shì)門為變形菌門（23.32% 和17.98%）、放 線 菌 門（24.25% 和29.46%）、綠彎菌門（Chloroflexi，12.85%和15.35%），這與謝芹[39]對(duì)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖塘底泥的研究結(jié)果一致。經(jīng)對(duì)比，實(shí)驗(yàn)組底泥中變形菌門等的相對(duì)豐度顯著提升，放線菌門、綠彎菌門等相對(duì)豐度則顯著降低。同時(shí)，固定化菌劑的添加使得底泥中的厚壁菌門相對(duì)豐度從對(duì)照組的4.54%提升至實(shí)驗(yàn)組的5.34%。其中變形菌門與放線菌門的變化趨勢(shì)與水體中微生物群落結(jié)構(gòu)變化趨勢(shì)一致。實(shí)驗(yàn)組中綠彎菌門豐度下降，據(jù)分析是因?yàn)榫G彎菌門可以利用3-羥基丙酸途徑固定CO2產(chǎn)生能量[40]，說明它能在不同營養(yǎng)程度的環(huán)境中生存，富營養(yǎng)化程度越高的區(qū)域綠彎菌門越豐富，表明實(shí)驗(yàn)組底泥的富營養(yǎng)化程度低于對(duì)照組。綜上，固定化菌劑反應(yīng)器向養(yǎng)殖環(huán)境中緩釋有益于降解污染物的微生物菌群，總體上改善了養(yǎng)殖池塘的水質(zhì)，同時(shí)也優(yōu)化了池塘環(huán)境中的微生物群落結(jié)構(gòu)。

2.4 固定化菌劑曝氣裝置投放后環(huán)境微生物相對(duì)豐度變化與聚類分析

為進(jìn)一步揭示固定化菌劑反應(yīng)器對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，在屬水平上選擇相對(duì)豐度前50 的菌制作Heatmap 圖，進(jìn)行聚類分析[27]。由圖8 可得，固定化菌劑的添加確實(shí)改變了實(shí)驗(yàn)組養(yǎng)殖環(huán)境內(nèi)屬水平上的微生物相對(duì)豐度，其中水體中norank_f__JG30-KF-CM45、芽孢桿菌屬（Bacillus）、大理石雕菌屬（Marmoricola）以及底泥中hgcI_clade等的相對(duì)豐度有所上升。其中芽孢桿菌屬所屬厚壁桿菌門，其相對(duì)豐度的上升與前文相吻合。以往研究表明，大理石雕菌屬可以有效降解有機(jī)污染物[41]，實(shí)驗(yàn)組水體CODMn濃度較低，但其所屬放線菌門，而上文中實(shí)驗(yàn)組放線菌門豐度低于對(duì)照組，表明放線菌門中其余屬相對(duì)豐度下降，說明固定化菌劑的添加優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)組水體微生物群落結(jié)構(gòu)。同時(shí)相關(guān)研究表明，hgcI_clade 與氨氮濃度呈負(fù)相關(guān)[42]，符合本文中實(shí)驗(yàn)組氨氮濃度低于對(duì)照組的事實(shí)。綜合而言，固定化菌劑曝氣裝置的投放改善了養(yǎng)殖環(huán)境原有的微生物群落結(jié)構(gòu)，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了原位凈化養(yǎng)殖水體水質(zhì)。

圖8 底泥與水體微生物屬水平的相對(duì)豐度聚類熱圖Figure 8 Community heatmap analysis on genus level in sediment and water

3 結(jié)論

（1）原位使用固定化菌劑能較好地去除對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中的CODMn和氨氮，且適當(dāng)提高微生物量能使養(yǎng)殖過程中氨氮穩(wěn)定保持在較低水平，提高抵御惡劣環(huán)境條件的能力。

（2）固定化菌劑曝氣反應(yīng)器的投放可以提高養(yǎng)殖水體中微生物的多樣性，增加微生物群落豐富度；其向水體中緩釋菌群增加了某些特定微生物數(shù)量，使養(yǎng)殖環(huán)境的微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

（3）添加固定化菌劑后，水體中藍(lán)細(xì)菌門（Cyano?bateria）、變形菌門（Proteobacteria）等的相對(duì)豐度顯著提升，放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteriid?ota）等相對(duì)豐度則顯著降低；底泥中變形菌門（Proteo?bacteria）等的相對(duì)豐度顯著提升，放線菌門（Actino?bacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）等相對(duì)豐度則顯著降低。結(jié)果表明固定化菌劑反應(yīng)器能夠優(yōu)化環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)，有利于養(yǎng)殖池塘水質(zhì)的修復(fù)。同時(shí)屬水平的相對(duì)豐度聚類分析也有相似的結(jié)果。