張冰，王玖程，汪冬至，馮建騁，侯文峰，周雪，高強(qiáng)

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，長(zhǎng)春 130118）

三環(huán)唑是防治稻瘟病專用的內(nèi)吸性殺菌劑，隸屬于噻唑類，其殺菌機(jī)理是通過(guò)抑制孢子的萌發(fā)和附著孢的形成，阻止病菌入侵和減少稻瘟病菌孢子的產(chǎn)生[1]。自1987 年首次在我國(guó)河北省推廣并利用三環(huán)唑防治稻瘟病開(kāi)始，至今已有30多年[2]。二氯喹啉酸是一種激素型且具有高選擇性的水田專用化學(xué)除草劑[3]，其作用機(jī)理在于促進(jìn)ACC（1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸）在幼芽組織中合成并產(chǎn)生乙烯和氰化物，其大量積累后會(huì)產(chǎn)生毒害作用，導(dǎo)致雜草幼苗的黃化、失綠、壞死[4-5]。二氯喹啉酸自20 世紀(jì)80 年代末開(kāi)始被大面積的推廣使用，距今已有30多年[6]。

目前有關(guān)三環(huán)唑的研究主要集中在不同施用劑量對(duì)稻瘟病的防治效果[7-8]以及施用后其降解、殘留等污染情況與相應(yīng)修復(fù)技術(shù)[9-10]，微生物方面主要聚焦于相關(guān)降解[11]和拮抗菌株[12]的富集與篩選。二氯喹啉酸的相關(guān)研究主要集中在作用效果[13]、降解機(jī)制[14]、抗性機(jī)制[15]等方面，微生物方面主要關(guān)注降解菌的分離、鑒定[16]以及通過(guò)添加外源菌劑修復(fù)受二氯喹啉酸污染的土壤等方面[17]，也有一些研究利用磷脂脂肪酸分析（PLFA）技術(shù)分析培養(yǎng)條件下二氯喹啉酸對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果顯示稻田淹水情況不同，二氯喹啉酸對(duì)土壤微生物穩(wěn)定性的影響不同，但均具有含有相同標(biāo)致性脂肪酸（14：0、15：0、16：0和18：2n6c）[18]的優(yōu)勢(shì)類群，這說(shuō)明施用二氯喹啉酸會(huì)產(chǎn)生特異的優(yōu)勢(shì)類群。

三環(huán)唑和二氯喹啉酸在水稻種植中被廣泛使用，但有關(guān)其對(duì)稻田土壤細(xì)菌多樣性以及群落結(jié)構(gòu)實(shí)際變化影響的研究較少。農(nóng)藥對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響的研究主要采用室內(nèi)培養(yǎng)，技術(shù)手段為磷脂脂肪酸技術(shù)。本文以吉林省永吉縣的稻田土壤為研究對(duì)象，分別添加不同劑量（推薦施用量以及2 倍推薦施用量）的三環(huán)唑和二氯喹啉酸，利用高通量測(cè)序技術(shù)研究施用不同時(shí)間后其對(duì)土壤細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響，以期為安全與合理使用三環(huán)唑與二氯喹啉酸提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)地點(diǎn)位于吉林省吉林市永吉縣一拉溪鎮(zhèn)鞠家村（43°47'42.98″N，126°06'49.57″E），永吉縣為吉林省水稻主產(chǎn)區(qū)，該試驗(yàn)區(qū)常年施用三環(huán)唑和二氯喹啉酸。試驗(yàn)地屬于北溫帶半濕潤(rùn)大陸季風(fēng)性氣候，年平均日照時(shí)間約為2 600 h，日照充足，年均氣溫6.5 ℃，年均降水量在200~700 mm 之間。供試土壤為白漿型水稻土，基礎(chǔ)理化性質(zhì)如下：pH 5.3，有機(jī)質(zhì)15.7 g·kg-1，堿解氮89.6 mg·kg-1，速效磷45.7 mg·kg-1，速效鉀151.1 mg·kg-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究采用三環(huán)唑250 g·hm-2懸浮劑，推薦施用量（低劑量）750 g·hm-2，有效成分187.5 g·hm-2，2倍推薦施用量（高劑量）1 500 g·hm-2，有效成分375 g·hm-2。50%二氯哇琳酸可濕性粉劑，推薦施用量（低劑量）450 g·hm-2，有效成分225 g·hm-2，2 倍推薦施用量（高劑量）900 g·hm-2，有效成分450 g·hm-2。試驗(yàn)共設(shè)5 個(gè)處理：未施用三環(huán)唑和二氯喹啉酸處理（CK）、低劑量施用三環(huán)唑處理（TL）、高劑量施用三環(huán)唑處理（TH）、低劑量施用二氯喹啉酸處理（QL）、高劑量施用二氯喹啉酸處理（QH）。農(nóng)藥采用手動(dòng)噴灑方式施加，分別在第0、30、107 天進(jìn)行土壤樣本采集（其中0 d 采集樣本即為CK 處理），并迅速去除土樣中可見(jiàn)的動(dòng)植物殘?bào)w及石塊等，土樣一部分帶回實(shí)驗(yàn)室風(fēng)干，用于土壤理化性質(zhì)測(cè)定，一部分用干冰保存運(yùn)輸，-80 ℃冰箱儲(chǔ)存用于微生物送檢。

1.3 土壤化學(xué)性質(zhì)測(cè)定

土壤化學(xué)性質(zhì)測(cè)定參照《土壤農(nóng)化分析》[19]。通過(guò)電位法使用復(fù)合電極測(cè)定土壤pH；重鉻酸鉀外加熱法測(cè)定土壤有機(jī)質(zhì)含量；堿解擴(kuò)散法測(cè)定土壤堿解氮含量；NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測(cè)定土壤速效磷含量；NH4OAc浸提-火焰光度法測(cè)定速效鉀含量。

1.4 DNA提取、Illumina測(cè)序和數(shù)據(jù)處理

選 用OMEGA Soil DNA Kit（D5625-01，Omega Bio-Tek，Norcross，GA，美國(guó)）試劑盒，按試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行土壤總DNA 的提取。選用長(zhǎng)度約為468 bp 的細(xì)菌16S rRNA 基因的高度可變的V3~V4 區(qū)測(cè)序。PCR 擴(kuò)增選用細(xì)菌16S rDNA V3~V4區(qū)特異性引物338F（5'-barcode+ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAA T-3'）。16S rDNA 基因的測(cè)序在Illumina NovaSeq 上完成，首先調(diào)用qiime cutadapt trim-paired 切除序列的引物片段，棄去未匹配引物的序列，然后通過(guò)qiime dada2 de?noise-paired 調(diào)用dada2進(jìn)行質(zhì)控、去噪、拼接、去嵌合體，完成所有文庫(kù)的去噪后，合并ASVs 特征序列和ASV 表格，并去除singletons ASVs，最終基于Silva 數(shù)據(jù)庫(kù)（Release132）進(jìn)行物種注釋。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2019 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理?；赗 語(yǔ)言（4.1.3）中的vegan包，計(jì)算細(xì)菌群落的Shannon 指數(shù)和Chao1 指數(shù)，并進(jìn)行Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)和Dunn's test 檢驗(yàn)的顯著性標(biāo)記（P<0.05）以及NMDS 分析；利用RColorBrewer 包進(jìn)行基于Bray-Curtis 距離的ANOSIM 分析；利用ggplot2 包進(jìn)行豐富-稀有物種的統(tǒng)計(jì)分析、繪圖[20][稀有類群（ART）為在所有樣本中豐度均≤0.1%的ASV，豐富類群（AAT）為在所有樣本中豐度均≥1%的ASV，中間類群（MT）為在所有樣本中豐度均>0.1%且<1%的ASV，條件稀有類群（CRT）為在所有樣本中豐度均<1%且僅在部分樣本中豐度<0.1%的ASV，條件豐富類群（CAT）為在所有樣本中豐度均>0.1%且僅在部分樣本中豐度>1%的ASV，條件稀有或豐富類群（CRAT）為豐度跨越從稀有（最低豐度≤0.1%）到豐富（最高豐度≥1%）的ASV]，計(jì)算ASV在各組樣本中的特異性和占有率，并以閾值>0.7為條件進(jìn)行特化種的判定以及繪制SPEC-OCCU圖[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 三環(huán)唑與二氯喹啉酸對(duì)土壤細(xì)菌α多樣性的影響

圖1、圖2 分別為三環(huán)唑與二氯喹啉酸施用不同天數(shù)后稻田土壤細(xì)菌群落Simpson 指數(shù)和Chao1 指數(shù)箱線圖。30 d 時(shí)，與CK 相比，施用三環(huán)唑?qū)impson和Chao1 指數(shù)的影響均表現(xiàn)為低劑量施用時(shí)指數(shù)下降，高劑量施用時(shí)指數(shù)提高；施用二氯喹啉酸對(duì)Simp?son 指數(shù)的影響與三環(huán)唑一致，而高劑量和低劑量施用均造成了Chao1 指數(shù)的下降。107 d 時(shí)，同CK 相比，三環(huán)唑只有低劑量施用降低了Chao1 指數(shù)，而高劑量下的Chao1 指數(shù)和兩種劑量下的Simpson 指數(shù)均升高；二氯喹啉酸只有高劑量施用提高了Simpson 指數(shù)，而低劑量下的Simpson 指數(shù)和兩種劑量下的Chao1 指數(shù)均降低。但不論是低劑量還是高劑量，與未施藥（CK）相比，施用時(shí)長(zhǎng)對(duì)Chao1 指數(shù)和Simpson指數(shù)的影響均不顯著（P>0.05），說(shuō)明三環(huán)唑與二氯喹啉酸的添加對(duì)稻田土壤細(xì)菌α多樣性無(wú)顯著影響。

圖1 稻田土壤細(xì)菌群落的Simpson指數(shù)Figure 1 Simpson index of paddy soil bacterial communities

圖2 稻田土壤細(xì)菌群落的Chao1指數(shù)Figure 2 Chao1 index of paddy soil bacterial communities

2.2 三環(huán)唑與二氯喹啉酸對(duì)土壤細(xì)菌β多樣性的影響

通過(guò)NMDS 分析三環(huán)唑與二氯喹啉酸對(duì)稻田土壤細(xì)菌群落的影響（圖3a），結(jié)果表明在施用三環(huán)唑和二氯喹啉酸后的不同時(shí)間，不同處理的稻田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)了明顯的聚類分離。基于Braycurtis 距離的ANOSIM 分析結(jié)果表明（圖3b 至圖3e），0 d 時(shí)，各稻田土壤樣本之間微生物群落結(jié)構(gòu)無(wú)顯著差異（P>0.05）。30 d時(shí)，同CK 相比，施用三環(huán)唑和二氯喹啉酸均使稻田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了顯著差異，且高劑量施用引起的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異大于低劑量施用；107 d時(shí)，同CK相比，三環(huán)唑和二氯喹啉酸的施用均使稻田土壤微生物群落產(chǎn)生了顯著差異，且高劑量施用引起的差異大于低劑量。由此可知，三環(huán)唑與二氯喹啉酸的施用時(shí)長(zhǎng)顯著影響了稻田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，且高劑量施用對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響大于低劑量施用。

圖3 稻田土壤細(xì)菌群落NMDS分析及ANOSIM相似性分析Figure 3 NMDS analysis and ANOSIM similarity analysis of soil bacterial communities in paddy fields

2.3 三環(huán)唑與二氯喹啉酸施用時(shí)長(zhǎng)對(duì)土壤細(xì)菌物種組成的影響

2.3.1 對(duì)物種組成的影響

圖4 為三環(huán)唑與二氯喹啉酸施用后稻田土壤細(xì)菌群落門(mén)水平物種組成豐度圖。在三環(huán)唑與二氯喹啉酸處理門(mén)水平的物種中，Proteobacteria、Chloroflexi、Acidobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria 的總占比大于85%，為主要物種，其中Proteobacteria 菌門(mén)豐度占比最高（30%~35%）。第0 天各稻田土壤樣本之間豐度前20 的門(mén)水平注釋結(jié)果無(wú)顯著差異；同CK 相比，施用三環(huán)唑30 d 提高了Acidobacteria 菌門(mén)的相對(duì)豐度，降低了Actinobacteria 菌門(mén)的相對(duì)豐度，并表現(xiàn)出高劑量施用對(duì)菌門(mén)相對(duì)豐度的提高和降低程度大于低劑量施用；施用二氯喹啉酸30 d 提高了Chloro?flexi、Acidobacteria 菌門(mén)的相對(duì)豐度，降低了Proteo?bacteria 菌門(mén)的相對(duì)豐度，且高劑量施用對(duì)菌門(mén)相對(duì)豐度的提高、降低程度大于低劑量；施用三環(huán)唑107 d提高了Chloroflexi、Acidobacteria 菌門(mén)的相對(duì)豐度，降低了Proteobacteria、Actinobacteria 菌門(mén)的相對(duì)豐度，高劑量施用的影響大于低劑量；施用二氯喹啉酸107 d 提高了Acidobacteria 菌門(mén)的相對(duì)豐度，高劑量施用影響大于低劑量，降低了Actinobacteria菌門(mén)的相對(duì)豐度，低劑量施用影響大于高劑量。在不同時(shí)間，不同處理對(duì)門(mén)水平物種組成造成了不同程度的影響，且普遍表現(xiàn)為高劑量施用對(duì)稻田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響大于低劑量施用。

圖4 稻田土壤細(xì)菌群落豐度前20的門(mén)水平物種組成豐度圖Figure 4 Abundances of top20 phylum horizontal species in soil bacterial communities in paddy fields

2.3.2 對(duì)豐富和稀有類群的影響

圖5 為三環(huán)唑與二氯喹啉酸施用后稻田土壤細(xì)菌群落中優(yōu)勢(shì)與稀有物種的豐度圖。目前對(duì)土壤微生物的豐度研究較多關(guān)注于總類群和高豐度類群，而本研究關(guān)注了低豐度的稀有類群，結(jié)果表明三環(huán)唑與二氯喹啉酸施用對(duì)稀有和條件稀有類群造成了影響。整體觀測(cè)趨勢(shì)為：TL、TH 處理和QL、QH 處理在30 d和107 d時(shí)，稀有類群的相對(duì)豐度均降低，且高劑量施用對(duì)稀有類群相對(duì)豐度的降低程度大于低劑量施用；條件稀有類群的相對(duì)豐度增高，且低劑量施用增加程度大于高劑量。三環(huán)唑和二氯喹啉酸的施用主要影響了稀有和條件稀有類群，最終均造成了稀有類群減少，條件稀有類群增加，而沒(méi)有影響中間和條件豐富類群的相對(duì)豐度，因此三環(huán)唑和二氯喹啉酸的施用更偏向于影響低豐度類群。

2.3.3 對(duì)潛在關(guān)鍵物種（特化種）的影響

圖6 為三環(huán)唑與二氯喹啉酸施用后稻田土壤細(xì)菌群落中潛在關(guān)鍵物種（特化種，特定于處理的同時(shí)又在大多數(shù)生境中常見(jiàn)的物種）的分析圖，圖7 為進(jìn)一步的特化種組成分析圖。施用三環(huán)唑和二氯喹啉酸產(chǎn)生的特化種不同，施用三環(huán)唑處理產(chǎn)生的特化種主要隸屬于16 個(gè)菌門(mén)，其中低劑量施用三環(huán)唑產(chǎn)生的特化種所屬菌門(mén)8 個(gè)，高劑量施用產(chǎn)生的特化種所屬菌門(mén)13 個(gè)，共有菌門(mén)5 個(gè)，低劑量施用產(chǎn)生的特化種所分布的特有菌門(mén)為Actinobacteria、Cyanobacteria和Firmicutes 菌門(mén)，高劑量施用產(chǎn)生的特化種所分布的特有菌門(mén)為Elusimicrobia、Fibrobacteres、Kiritimati?ellaeota、Latescibacteria、Nitrospirae、Verrucomicrobiav、WOR-1 和WPS-2 菌門(mén)，高劑量施用三環(huán)唑產(chǎn)生的特化種所分布的菌門(mén)種類多，說(shuō)明在三環(huán)唑的施用中高劑量施用對(duì)特化種的影響更大。施用二氯喹啉酸處理產(chǎn)生的特化種主要隸屬于12 個(gè)菌門(mén)，其中低劑量和高劑量施用二氯喹啉酸產(chǎn)生的特化種所屬菌門(mén)均為11個(gè)，共有菌門(mén)10個(gè)，低劑量施用產(chǎn)生的特化種所分布的特有菌門(mén)為Zixibacteria，高劑量施用產(chǎn)生的特化種所分布的特有菌門(mén)為Cyanobacteria，說(shuō)明高劑量施用和低劑量施用二氯喹啉酸產(chǎn)生的特化種雖分布的門(mén)數(shù)相同，但實(shí)際分布的菌門(mén)并不相同。本研究最終發(fā)現(xiàn)：不同處理對(duì)共有的特化種菌門(mén)豐度均造成了影響，普遍規(guī)律為高劑量施用的影響大于低劑量施用；施用三環(huán)唑產(chǎn)生更多的特化種，其所分布的特有菌門(mén)（7 種）高劑量施用6 種，低劑量施用1 種，而二氯喹啉酸施用只在低劑量下具有1個(gè)特有菌門(mén)。

圖6 稻田土壤細(xì)菌群落潛在關(guān)鍵物種（特化種）分析Figure 6 Analysis of potential keystone species（specialized species）of paddy soil bacterial communities

圖7 稻田土壤細(xì)菌群落潛在關(guān)鍵物種（特化種）組成分析Figure 7 Analysis of the composition of potential keystone species（specialized species）in paddy soil bacterial communities

3 討論

近年來(lái)，三環(huán)唑和二氯喹啉酸的廣泛施用在一定程度上改變了稻田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[22]，本研究通過(guò)田間試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不論高劑量還是低劑量施用三環(huán)唑和二氯喹啉酸均不影響土壤α 多樣性指數(shù)。García-Jaramillo 等[23]研究三環(huán)唑?qū)ν寥牢⑸锶郝涞挠绊懓l(fā)現(xiàn)，隨著水稻生長(zhǎng)，三環(huán)唑不會(huì)影響細(xì)菌和真菌群落的多樣性，這與本文研究結(jié)果一致，分析原因可能是三環(huán)唑與二氯喹啉酸的施用對(duì)微生物群落的影響特異性低，專一性較高。謝泰祥等[24]的研究結(jié)果表明微生物的定殖與變化具有不同的喜愛(ài)偏好，其主要受外界不同因素的影響，可歸因于微生物的生態(tài)專一性和多樣性。但不同劑量三環(huán)唑和二氯喹啉酸與CK處理相比均顯著影響了稻田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，在施用不同時(shí)間后，時(shí)間不同處理的稻田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)均隨著時(shí)間的演替，出現(xiàn)了明顯的聚類分離。30 d和107 d 時(shí)，三環(huán)唑和二氯喹啉酸處理均是高劑量施用的影響大于低劑量施用，這與張妤[25]、楊彩宏等[26]利用磷脂脂肪酸法研究二氯喹啉酸對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響結(jié)論一致。因此，高劑量施用三環(huán)唑和二氯喹啉酸對(duì)稻田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響比低劑量施用更大。

在物種水平上進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，三環(huán)唑和二氯喹啉酸處理豐度前20 的門(mén)水平物種同樣受高劑量影響大于低劑量，其中優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為Proteobacteria 菌門(mén)[17]。其他研究也表明施用農(nóng)藥后Proteobacteria 為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)[27]。將不同豐度的ASV 劃分為豐富和稀有類群，發(fā)現(xiàn)三環(huán)唑和二氯喹啉酸的施用均造成稀有類群的減少，條件稀有類群的增加，中間類群和條件豐富類群并未受到影響。李濤等[28]在乙草胺對(duì)農(nóng)田土壤動(dòng)物群落結(jié)構(gòu)的影響研究中得出乙草胺施用主要是對(duì)常見(jiàn)類群和稀有類群的影響，這與本文研究結(jié)果趨同，均表明農(nóng)藥的添加與施用更偏向于對(duì)稀有類群的影響。Pedrós-Alió 等[29]發(fā)現(xiàn)豐富的物種生長(zhǎng)速度快，適應(yīng)性好，而稀有物種生長(zhǎng)速度慢，對(duì)外界條件更為挑剔。因此，土壤稀有微生物可能對(duì)環(huán)境變化更為敏感。本文通過(guò)計(jì)算物種的特異性和占有率來(lái)尋找可歸屬于不同處理的潛在關(guān)鍵物種（特化種），并分析在施用三環(huán)唑和二氯喹啉酸條件下，共有特化種的相關(guān)豐度變化以及特異性差異組成，研究結(jié)果表明，特化種中共有的Acidobacteria、Bacteroidetes、Gemmatimon?adetes、Chloroflexi、Proteobacteria 5 個(gè)菌門(mén)的相對(duì)豐度均受到不同程度的影響，且高劑量施用對(duì)菌門(mén)相對(duì)豐度的影響大于低劑量施用，高劑量與低劑量施用對(duì)微生物的穩(wěn)定性及豐度均造成不同程度的影響[30]。同時(shí)在對(duì)特化種組成進(jìn)一步分析中發(fā)現(xiàn)，施用三環(huán)唑處理產(chǎn)生的特異性物種及其分布的菌門(mén)遠(yuǎn)多于施用二氯喹啉酸處理，且高劑量施用的影響大于低劑量施用。目前對(duì)農(nóng)藥處理下特化種的研究較少，大多研究主要集中于施用農(nóng)藥與除草劑后土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[31]和物種組成的變化情況[32]。

4 結(jié)論

通過(guò)田間試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，三環(huán)唑和二氯喹啉酸的施用對(duì)稻田土壤細(xì)菌α多樣性無(wú)顯著影響，但顯著影響了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，且高劑量施用的影響大于低劑量施用，最終導(dǎo)致稀有類群的減少，條件稀有類群的增加。下一步可針對(duì)三環(huán)唑和二氯喹啉酸施用導(dǎo)致的土壤微生物整體群落功能及特化種功能的變化進(jìn)行深入研究。