李慧 張吳霞 熊燁

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一種全身性、異質(zhì)性的血液系統(tǒng)惡性腫瘤,是成年人中最常見且致死率較高的急性白血病[1]。未成熟的髓細(xì)胞在骨髓和外周血中積累和擴(kuò)增,導(dǎo)致造血功能異常,是AML的病理基礎(chǔ)[2]。AML的常規(guī)治療是誘導(dǎo)化療,但其治療效果并不理想,生存率并未顯著增加[3]。歐前胡素(imperatorin,IMP)是一種呋喃香豆素化合物,為中藥蛇床子、白芷、羌活的有效成分,具有抗腫瘤、抗炎癥、抗菌以及神經(jīng)保護(hù)等重要作用[4]。例如,IMP可通過調(diào)節(jié)HMGB2抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移[5];還可通過下調(diào)mTOR/p70S6K/4E-BP1和MAPK通路抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和血管生成[6]。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路在多種類型的癌癥發(fā)展中起關(guān)鍵作用,包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)為該蛋白激酶家族重要成員[7]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路,參與癌細(xì)胞生長過程中所需的各種代謝過程,p70核糖體S6蛋白激酶(p70S6K)是mTOR磷酸化的主要效應(yīng)物[8]。有研究已經(jīng)證明MAPK是mTOR/p70S6K通路的上游,且抑制MAPK/mTOR/p70S6K和Akt信號(hào)通路可抑制人胃癌細(xì)胞的生長[9]。本實(shí)驗(yàn)旨在基于MAPK/mTOR/p70S6K通路,探討歐前胡素對(duì)AML細(xì)胞的影響以及其中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人AML細(xì)胞HL-60(美國ATCC公司);歐前胡素(貨號(hào):N0048,四川恒誠致遠(yuǎn)生物科技有限公司);PD98059、Cearoin(貨號(hào):HY-12028、HY-N8418,美國Med Chem Express公司)。

1.2 試劑與儀器 MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):R20228,上海源葉生物科技有限公司);Annexin V-FITC/PI熒光雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):E-CK-A211,武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司);腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)ELISA檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):EK-H12145、EK-H10327、EK-H10352,上海酶研生物科技有限公司);ERK1/2、p-ERK1/2、mTOR、p-mTOR、p70S6K、p-p70S6K、Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ一抗(貨號(hào):ab184699、ab278538、ab32028、ab109268、ab184551、ab2571、ab32124、ab207612、ab128025,英國Abcam公司);羊抗兔IgG H&L(貨號(hào):ab6795,英國Abcam公司);流式細(xì)胞儀(型號(hào):BD LSR II,美國BD公司);iBright凝膠成像儀(型號(hào):CL750,賽默飛世爾科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng):將人AML細(xì)胞HL-60用含有10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的1640培養(yǎng)基培養(yǎng),并置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中,每3天按照1∶3 傳代,傳至第3代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 MTT法檢測(cè)IMP對(duì)HL-60細(xì)胞的毒性:將HL-60細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種至96孔板,培養(yǎng)24 h后,加入不同濃度的IMP(0、10、50、100、150、200、250 μmol/L)處理細(xì)胞24 h,并設(shè)置未用IMP處理的對(duì)照組作為陰性對(duì)照,然后在每孔加入10 μl MTT培養(yǎng)4 h。棄上清,每孔加100 μl的二甲亞砜(DMSO)混勻。用酶標(biāo)儀測(cè)量每孔在490 nm處的吸光值。并計(jì)算細(xì)胞的存活率以及半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.3.3 細(xì)胞分組:將HL-60細(xì)胞分為對(duì)照組,ERK抑制劑組(PD98059組),IMP低、中、高劑量組,IMP高劑量+ERK激活劑組(IMP高+Cearoin組),每組均設(shè)置6個(gè)重復(fù)。對(duì)照組用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)(PD98059終濃度為0 μmol/L),PD98059組用PD98059終濃度為10 μmol/L[9]的培養(yǎng)基培養(yǎng),IMP低、中、高劑量組分別用含終濃度為50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L IMP[6]的培養(yǎng)基培養(yǎng),IMP高+Cearoin組用終濃度150 μmol/L IMP和40 μmol/L Cearoin[10]的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3.4 MTT檢測(cè)HL-60細(xì)胞的增殖活性:將HL-60細(xì)胞依據(jù)1.3.3分組并以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種至96孔板中培養(yǎng)48 h,同時(shí)設(shè)置只有培養(yǎng)基的孔作為空白對(duì)照,利用1.3.2中的MTT法評(píng)估各組HL-60細(xì)胞活性。

1.3.5 軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HL-60細(xì)胞的增殖:1.2%瓊脂糖和2×1640培養(yǎng)基按1∶1混勻后,取3 ml加入6 cm培養(yǎng)皿中,靜置凝固。另將0.6%瓊脂糖和2×含不同藥物的1640培養(yǎng)基在無菌管中按1∶1混勻,加入200 μl HL-60細(xì)胞懸液(1×104個(gè)/ml)再次混勻,加入上述6 cm培養(yǎng)皿中,凝固后置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)15 d,肉眼對(duì)細(xì)胞克隆數(shù)量計(jì)數(shù)。

1.3.6 流式細(xì)胞儀術(shù)檢測(cè)HL-60細(xì)胞凋亡:將HL-60細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種至6孔板,按1.3.3的分組培養(yǎng)24 h,然后重懸細(xì)胞并離心,收集細(xì)胞。PBS洗滌后,加入500 μl稀釋的PBS重懸細(xì)胞,再加入5 μl Annexin V-FITC和5 μlPI染色液混勻,避光孵育20 min。用流式細(xì)胞儀系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞凋亡并分析凋亡率。

1.3.7 Transwell小室檢測(cè)HL-60細(xì)胞遷移和侵襲能力:將HL-60細(xì)胞消化并重懸,以4×104個(gè)/孔的密度接種至Transwell上室中并加入無血清培養(yǎng)基,下室按照1.3.3的分組加入含有10% FBS和不同藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng)。24 h后膜外側(cè)細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15 min,結(jié)晶紫染色10 min。在侵襲實(shí)驗(yàn)中,上室加入含有基質(zhì)膠(Matrigel)的無血清培養(yǎng)基,其余操作與遷移實(shí)驗(yàn)相同。顯微鏡下拍照并計(jì)算遷移和侵襲細(xì)胞數(shù),每組隨機(jī)選擇6個(gè)視野計(jì)算平均值。

1.3.8 ELISA檢測(cè)培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平:將HL-60細(xì)胞重懸,離心收集上清。然后按照ELISA試劑盒說明書相應(yīng)的操作步驟檢測(cè)HL-60細(xì)胞培養(yǎng)液的上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平。

1.3.9 Western blot檢測(cè)通路相關(guān)蛋白ERK1/2、mTOR、p70S6K及Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表達(dá):將HL-60細(xì)胞按照1.3.3的分組培養(yǎng)24 h后,重懸并收集細(xì)胞,加入蛋白裂解液提取總蛋白,用BCA試劑盒測(cè)量蛋白濃度。然后利用SDS-PAGE凝膠電泳分離目的蛋白,并轉(zhuǎn)至PVDF膜上。隨后將PVDF膜用5%的脫脂牛奶室溫振蕩孵育2 h,TBST洗膜,加入一抗稀釋液(ERK1/2、p-ERK1/2稀釋倍數(shù)1∶10 000,mTOR、p-mTOR、p-p70S6K、Bcl-2稀釋倍數(shù)1∶1 000,Beclin-1稀釋倍數(shù)1∶2 000,LC3Ⅱ/Ⅰ稀釋倍數(shù)1∶500)4℃孵育過夜,再加入羊抗兔二抗稀釋液(稀釋倍數(shù)1∶1 000),室溫振蕩孵育2 h,最后加入ECL試劑避光顯色,凝膠成像儀觀察蛋白條帶。以β-actin為內(nèi)參蛋白,用Gel-Pro analyzer4軟件分析蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 IMP對(duì)HL-60細(xì)胞毒性的影響 50、100、150、200、250 μmol/L IMP處理組的細(xì)胞存活率明顯低于對(duì)照組(P<0.05);且IC50為150.3 μmol/L。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇劑量為50、100、150 μmol/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中IMP的低、中、高劑量組。見表1。

表1 IMP對(duì)HL-60細(xì)胞存活率的影響

2.2 IMP對(duì)6組HL-60細(xì)胞存活率和克隆形成的影響 與對(duì)照組比較,PD98059組和IMP低、中、高劑量組HL-60細(xì)胞存活率和克隆數(shù)量降低(P<0.05);與IMP高劑量組比較,IMP高+Cearoin組細(xì)胞存活率和克隆數(shù)量顯著升高(P<0.05)。見表2,圖1。

圖1 6組HL-60細(xì)胞的克隆形成情況

表2 不同實(shí)驗(yàn)組HL-60細(xì)胞克隆數(shù)量

2.3 IMP對(duì)HL-60細(xì)胞凋亡率的影響 與對(duì)照組比較,PD98059組和IMP低、中、高劑量組HL-60細(xì)胞的凋亡率顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與IMP高劑量組比較,IMP高+Cearoin組細(xì)胞的凋亡率顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2,表3。

圖2 不同實(shí)驗(yàn)組HL-60細(xì)胞凋亡情況

表3 6組HL-60細(xì)胞凋亡率

2.4 IMP對(duì)HL-60細(xì)胞的遷移和侵襲的影響 與對(duì)照組比較,PD98059組和IMP低劑量組、中劑量組、高劑量組HL-60細(xì)胞的遷移和侵襲數(shù)量顯著減少,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與IMP高劑量組比較,IMP高+Cearoin組細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3,表4。

圖3 IMP對(duì)HL-60細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

表4 6組HL-60細(xì)胞的遷移和侵襲能力n=6,個(gè),

2.5 IMP對(duì)培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響 與對(duì)照組比較,PD98059組和IMP低、中、高劑量組培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著降低(P<0.05);與PD98059組比較,IMP低、中劑量組和IMP高+Cearoin組TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高(P<0.05);與IMP高劑量組比較,IMP高+Cearoin組培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平增高(P<0.05)。見表5。

表5 6組HL-60細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平

2.6 IMP對(duì)HL-60細(xì)胞中MAPK/mTOR/p70S6K通路蛋白及Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較,IMP低、中、高劑量組HL-60細(xì)胞中ERK1/2、mTOR、p70S6K蛋白表達(dá)無顯著變化,但其磷酸化形式p-ERK1/2、p-mTOR、p-p70S6K及Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低,Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05);與IMP高劑量組比較,IMP高+Cearoin組細(xì)胞中p-ERK1/2、p-mTOR、p-p70S6K及Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高,Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見表6,圖4。

圖4 不同實(shí)驗(yàn)組HL-60細(xì)胞中MAPK/mTOR/p70S6K通路蛋白及Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白的表達(dá);A 對(duì)照組;B PD98059組;C IMP低劑量組;D IMP中劑量組;E IMP高劑量組;F IMP高+Cearoin組

表6 6組HL-60細(xì)胞中MAPK/mTOR/p70S6K通路蛋白及自噬蛋白的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

AML是一種預(yù)后較差的遺傳異質(zhì)性的惡性腫瘤,為成人中最常見的急性白血病[11]。在AML中,未成熟的原始細(xì)胞存在于骨髓、外周血和髓外組織中,無法分化,從而抑制機(jī)體正常的造血功能。盡管近些年誘導(dǎo)化療使AML患者有所緩解,但復(fù)發(fā)也時(shí)常發(fā)生[12]。因此,迫切需要探索出治療AML的新方案和新藥物。已知香豆素具有心臟保護(hù),抗炎,抗腫瘤等生物活性,而IMP是一種天然衍生的香豆素,存在于多種天然植物中,具有廣泛的藥理活性,包括抗癌和抗菌特性[13]。由于炎癥與癌癥的發(fā)展過程密切相關(guān),因此TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子在AML細(xì)胞中也存在高表達(dá)[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,IMP低、中、高劑量組中HL-60細(xì)胞的存活率和克隆形成數(shù)量均逐漸降低,細(xì)胞凋亡率逐漸升高,細(xì)胞的遷移和侵襲數(shù)量以及促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平顯著降低,且IMP高劑量組各指標(biāo)與PD98059組接近。揭示了IMP能夠抑制HL-60細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及炎性因子的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞凋亡,從而抑制AML的發(fā)展。

MAPK作為經(jīng)典的細(xì)胞磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng),參與生命所必需的多種細(xì)胞和生理過程,同時(shí)在多種類型的癌癥發(fā)展中也具有顯著作用[15]。MAPKs家族包括ERK1/2、JNK和p38三種亞家族,其中ERK1/2信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)人類癌細(xì)胞的存活、增殖和傳播很重要[16]。mTOR是細(xì)胞生長和代謝的主要調(diào)節(jié)分子,能夠參與細(xì)胞生長、遷移、分化以及自噬等各種細(xì)胞過程[17]。已知mTOR的活化能夠磷酸化位于下游的p70S6K靶標(biāo),而p70S6K與腫瘤形成有關(guān),其磷酸化后可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞存活[18]。抑制mTOR激酶活性還可以通過抑制其下游底物p70S6K促進(jìn)自噬[19]。LC3是自噬體的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)志物,Bcl-2是一種細(xì)胞凋亡保護(hù)劑,代表自噬和凋亡之間的分子聯(lián)系[20]。研究發(fā)現(xiàn)mTOR的激活受MAPK亞家族激酶的調(diào)節(jié),且抑制mTOR/p70S6K信號(hào)通路的激活能夠促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤和胃癌細(xì)胞的自噬和凋亡[9,21]。本研究結(jié)果顯示,PD98059組和IMP低、中、高劑量組中通路相關(guān)蛋白的磷酸化形式p-ERK1/2、p-mTOR、p-p70S6K以及Bcl-2水平顯著降低,而自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ水平顯著升高,且呈現(xiàn)劑量依賴性。揭示了IMP可能是通過抑制MAPK/mTOR/p70S6K信號(hào)通路激活,從而抑制HL-60細(xì)胞的增殖、遷移,促進(jìn)細(xì)胞自噬和凋亡,抑制AML的發(fā)展。進(jìn)一步使用ERK1/2激活劑后發(fā)現(xiàn),ERK1/2激活劑可明顯消除IMP對(duì)HL-60細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。

綜上所述,IMP可能通過抑制MAPK/mTOR/p70S6K通路的激活,從而抑制AML細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移,促進(jìn)自噬、凋亡等生物學(xué)特性。本研究為AML的治療提供了潛在的治療藥物和思路。但本文中僅研究了MAPK/ERK信號(hào)通路的作用,還有其他幾種級(jí)聯(lián)反應(yīng)和調(diào)節(jié)機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究和探索。