吳澤龍,何建林,白鍇凱,唐 超,張 怡,洪碧紅*

(1.閩臺(tái)特色海洋食品加工及營(yíng)養(yǎng)健康教育部工程研究中心,福建 福州 350002;2.自然資源部第三海洋研究所海洋生物資源開(kāi)發(fā)利用工程技術(shù)創(chuàng)新中心,福建 廈門(mén) 361005;3.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建 福州 350002)

南美白對(duì)蝦(Penaeusvannamei)是中國(guó)主要的對(duì)蝦養(yǎng)殖品種,占對(duì)蝦養(yǎng)殖總產(chǎn)量的70%以上[1],在加工過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物(蝦頭蝦殼)占整蝦總重量40%～50%[2]。當(dāng)前,蝦加工副產(chǎn)物利用率低,絕大部分未經(jīng)利用而被丟棄,造成嚴(yán)重的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。但蝦加工副產(chǎn)物中富含有價(jià)值的生物活性物質(zhì),包括蛋白質(zhì)/肽[3]等,其中蝦頭中的蛋白質(zhì)含量達(dá)6.38%[4],且氨基酸種類齊全。研究表明蝦蛋白肽具有抗氧化[5-6]、降壓[7]、降血糖[8-9]、增強(qiáng)免疫[10]、抗菌[11-12]等生物活性,還有安全性高、易于人體吸收等優(yōu)點(diǎn),可應(yīng)用于開(kāi)發(fā)膳食補(bǔ)充劑、功能性食品等[13-14]。目前,蝦蛋白肽的提取方法主要包括酸堿法[15-16]、微生物發(fā)酵法[17]、酶解法等。在酸堿法中,常用堿法或堿溶酸沉法提取蛋白肽,其水解程度難以控制,蛋白提取率低,氨基酸易被破壞,環(huán)境污染嚴(yán)重。微生物發(fā)酵法則是將原料通過(guò)微生物發(fā)酵方式獲得蛋白肽等物質(zhì),其機(jī)理尚未完全明確,發(fā)酵過(guò)程難以調(diào)控,產(chǎn)物復(fù)雜、雜質(zhì)多。而酶解法具有水解高效、穩(wěn)定性好、酶解過(guò)程易控制等優(yōu)點(diǎn)[18],是當(dāng)前制備食源性肽或活性肽的理想生產(chǎn)方法。近年來(lái),利用酶解法制備蝦蛋白肽成為高值化開(kāi)發(fā)南美白對(duì)蝦副產(chǎn)物的重要發(fā)展方向。因此,本研究以南美白對(duì)蝦加工副產(chǎn)物為原料,考察不同外源酶對(duì)蝦頭內(nèi)源酶自溶酶解的協(xié)同作用,篩選出對(duì)內(nèi)源酶具有較好協(xié)同作用的堿性蛋白酶進(jìn)行單因素試驗(yàn),再經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化外源酶協(xié)同蝦頭內(nèi)源酶自溶酶解工藝。最后,測(cè)定蝦蛋白肽的分子量,并進(jìn)行功效評(píng)價(jià),以期為對(duì)蝦加工副產(chǎn)物高值化利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與動(dòng)物

南美白對(duì)蝦加工副產(chǎn)物(新鮮蝦頭蝦殼)由龍海市海澄萬(wàn)家福水產(chǎn)店提供。

胃蛋白酶(10萬(wàn)U/g),購(gòu)自河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司;酸性蛋白酶(20萬(wàn)U/g)、中性蛋白酶(20萬(wàn)U/g)、堿性蛋白酶(20萬(wàn)U/g)、風(fēng)味蛋白酶(2.5萬(wàn)U/g)、動(dòng)物蛋白酶(10萬(wàn)U/g)、胰蛋白酶(2 500 USP U/mg)、菠蘿蛋白酶(50萬(wàn)U/g),購(gòu)自廣西南寧龐博生物科技有限公司;高效凱氏定氮片,購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl ,DPPH)、甘氨酸(75.07 Da)、維生素B12(1 355.37 Da)、抑肽酶(6 511.44 Da)、細(xì)胞色素C(12 400 Da),購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;二甘氨酰甘氨酸(189.17 Da),購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司;脂多糖(LPS),購(gòu)自美國(guó)西格瑪奧德里奇公司;地塞米松磷酸鈉,購(gòu)自羅恩試劑公司;印度墨汁,購(gòu)自飛凈科研試劑;胎牛血清(FBS)、PBS緩沖溶液、RPMI 1640 Medium(Giboc)、CCK8,購(gòu)自北京索來(lái)寶科技有限公司;其余試劑均為市售分析純。

BALB/c種小鼠(SPF級(jí)),體質(zhì)量為16～18 g,雄性;動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0005,由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供。小鼠在溫度(22±1)℃、相對(duì)濕度(55±5)%、12 h明暗交替的SPF級(jí)動(dòng)物房中飼養(yǎng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循自然資源部第三海洋研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)管理規(guī)定。

1.2 儀器與設(shè)備

SHA-B型水浴恒溫振蕩器,購(gòu)自金壇市訊生儀器廠;CT14RD臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),購(gòu)自上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司;S210K 酸度計(jì),購(gòu)自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;RCT digital S025 磁力器攪拌器,購(gòu)自艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司;SCINO (KT260&DT208)定氮儀,購(gòu)自福斯賽諾分析儀器蘇州有限公司;SPPM-18S-1膜分離設(shè)備,購(gòu)自三達(dá)膜科技(廈門(mén))有限公司;1812卷式膜(編號(hào)116695,截留分子量：1 kDa),購(gòu)自法國(guó)蘇伊士公司;B-290噴霧干燥儀,購(gòu)自瑞士布奇公司;AKTA purifierTM10蛋白層析儀,購(gòu)自美國(guó)通用電氣公司;UV-1780 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),購(gòu)自島津儀器(蘇州)有限公司;MC21S電子分析天平,購(gòu)自賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;SUNRISE酶標(biāo)儀,購(gòu)自?shī)W地利蒂肯公司。

1.3 酶解工藝

南美白對(duì)蝦副產(chǎn)物粉碎后制得蝦頭蝦殼勻漿液,其中,新鮮蝦頭蝦殼勻漿液為生基原料;生基原料經(jīng)100 ℃ 滅酶10 min,即為熟基原料。根據(jù)試驗(yàn)條件進(jìn)行酶解,反應(yīng)結(jié)束后,于100 ℃ 滅酶10 min,待樣品冷卻后,于轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心10 min,取上清液并測(cè)定其氨基酸態(tài)氮含量并計(jì)算蝦蛋白水解度。

1.4 外源酶的篩選

以粉碎后蝦頭蝦殼生基或熟基勻漿液為原料,分別加入9種外源酶,酶添加量為原料的1%,在各自最適酶解條件下酶解3 h(表1),并以不加外源酶的生、熟基原料作為空白對(duì)照組(參考朱國(guó)萍等[19]的方法,結(jié)合前期實(shí)驗(yàn),酶解溫度為40 ℃,pH為8),探究外源酶協(xié)同蝦頭內(nèi)源酶自溶酶解的作用。根據(jù)蝦蛋白水解度對(duì)比不同外源酶及生、熟基原料對(duì)照組的酶解效果,篩選出最適外源酶。

表1 外源酶的酶解條件Tab.1 Enzymatic conditions for exogenous enzymes

1.5 外源酶協(xié)同蝦頭內(nèi)源酶自溶酶解單因素試驗(yàn)

取粉碎后的蝦頭蝦殼生基勻漿液為原料,以篩選的最適外源酶進(jìn)行酶解,單因素試驗(yàn)分別考察不同因素對(duì)蝦蛋白水解度的影響。各因素梯度為：酶添加量：1%、2%、3%、4%、5%;酶解時(shí)間：1、2、4、6、8 h;酶解溫度：30、35、40、45、50、55 ℃;料液比：1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6。

1.6 外源酶協(xié)同蝦頭內(nèi)源酶自溶酶解工藝響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,選取試驗(yàn)中對(duì)蝦蛋白水解度有顯著影響的三因素,采用 Design-Expert 11.0 軟件,按Box-Benken設(shè)計(jì)原理,以蝦蛋白水解度作為響應(yīng)函數(shù),選取適當(dāng)?shù)捻憫?yīng)面因素及其水平,通過(guò)響應(yīng)曲面分析回歸得出自變量與響應(yīng)函數(shù)之間的統(tǒng)計(jì)模型,優(yōu)化外源酶協(xié)同蝦頭內(nèi)源酶自溶酶解工藝,試驗(yàn)因素水平編碼如表2所示。

表2 響應(yīng)面因素水平Tab.2 Variables and experimental design levels for response surface analysis

1.7 蛋白水解度的測(cè)定

通過(guò)測(cè)定酶解液中氨基酸態(tài)氮的含量和原料中總氮的含量,按公式(1)進(jìn)行蛋白水解度(DH)計(jì)算。其中,氨基酸態(tài)氮的測(cè)定采取甲醛電位滴定法[20];總氮的測(cè)定參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[21],按凱氏定氮法測(cè)定。

(1)

式(1)中：X1為酶解液中氨基酸態(tài)氮含量;X2為原料中總氮含量。

1.8 揮發(fā)性鹽基氮含量的測(cè)定

參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》[22],按微量擴(kuò)散法測(cè)定。

1.9 蝦蛋白肽的分離及活性評(píng)價(jià)

1.9.1 蝦蛋白肽的制備及分離

取粉碎后的蝦頭蝦殼生基勻漿液為原料,加入堿性蛋白酶,按優(yōu)化后酶解工藝條件進(jìn)行酶解。反應(yīng)結(jié)束后于100 ℃滅酶10 min,待樣品冷卻后,于轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心10 min,即得蝦蛋白肽上清液。上清液用截留分子量為1 kDa的卷式膜分離,收集透過(guò)液,經(jīng)濃縮、噴霧干燥即得蝦蛋白肽粉末。

1.9.2 蝦蛋白肽分子量的測(cè)定

參照《海洋魚(yú)低聚肽粉》[23]標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定收集的蛋白肽分子量,色譜條件：凝膠柱為SuperdexTM 30 Increase 10/300 GL(10 mm×300 mm);流動(dòng)相為乙腈-超純水-三氟乙酸(45∶55∶0.1,體積比),流速0.5 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。校正曲線所用的標(biāo)準(zhǔn)品：甘氨酸、二甘氨酰甘氨酸、維生素B12、抑肽酶、細(xì)胞色素C。

1.9.3 羥自由基清除能力測(cè)定

配制FeSO4溶液(8 mmol/L)、水楊酸溶液(3 mmol/L,避光保存)以及過(guò)氧化氫溶液(20 mmol/L)備用。取試管依次加入樣品與上述溶液,渦旋混勻后置于37 ℃水浴鍋中恒溫30 min,反應(yīng)結(jié)束后取出冷卻至室溫,再加入定量蒸餾水。于轉(zhuǎn)速5 500 r/min條件下離心15 min,取上清液備用,記為A2樣品組。用蒸餾水代替樣品,經(jīng)相同處理后,記為A1空白對(duì)照組。在510 nm處測(cè)定吸光值[24]。按公式(2)計(jì)算羥自由基清除率：

(2)

1.9.4 DPPH自由基清除能力測(cè)定

稱取適量1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)粉末,溶解于無(wú)水乙醇,配制終濃度為0.5 mmol/L的DPPH溶液。取不同濃度樣品溶液加入等體積DPPH溶液,為樣品組B1;取不同濃度樣品溶液加入等體積乙醇溶液,為對(duì)照組B2;取DPPH溶液加入等體積的乙醇溶液,為空白組B0。以上試驗(yàn)組渦旋混勻后,室溫避光反應(yīng)30 min,于517 nm處測(cè)定吸光度[25]。按公式(3)計(jì)算DPPH自由基清除率：

(3)

1.9.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(BALB/c小鼠)適應(yīng)性飼養(yǎng)10 d后,隨機(jī)分為5組,包括陰性對(duì)照組、免疫低下模型組和蝦蛋白肽給藥組(低劑量1 mg/kg、中劑量10 mg/kg、高劑量100 mg/kg),每組11只。免疫低下模型組的造模方法采用隔日腹腔注射地塞米松,每次40 mg/kg,給藥10次;陰性對(duì)照組注射等量的生理鹽水。給藥組和模型組一樣給予地塞米松,給藥方法為灌胃給予不同劑量的蝦蛋白肽,連續(xù)灌胃給藥21 d。陰性對(duì)照組、模型組灌胃同體積的無(wú)菌水。

1.9.6 蝦蛋白肽對(duì)BALB/c鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響

小鼠處死后,立即浸泡于75%酒精中5 min,無(wú)菌取出脾臟,在磷酸鹽緩沖液(PBS)中清洗2遍后,放置在盛有4 ℃預(yù)冷PBS的200目細(xì)胞篩中,注射器活塞研磨后,經(jīng)細(xì)胞篩過(guò)濾即得脾細(xì)胞懸液。于1 500 r/min,4 ℃條件下,離心5 min,棄上清;加入Tris-HCl溶液混勻,同上述條件離心,棄上清,加入含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,靜置,以200 μL/孔鋪96孔板(密度5×106個(gè)細(xì)胞/mL),2 h后加入蝦活性肽及絲裂源LPS處理。46 h后,以1∶10的比例加入CCK8(20 μL/200 μL),培養(yǎng)3 h后在450 nm處檢測(cè)光密度(OD)值[26]。

1.9.7 蝦蛋白肽對(duì)免疫力低下模型小鼠免疫功能的影響

末次給藥1 h后,從小鼠尾靜脈注入印度墨汁(劑量為每10 g體重0.05 mL),立即計(jì)時(shí),于2、8 min時(shí)分別從內(nèi)眥靜脈叢取血10 μL,并立即將其加到1 mL 0.1% Na2CO3溶液中。用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值,以Na2CO3溶液作空白對(duì)照。將小鼠處死,取肝臟和脾臟,用濾紙吸干臟器表面血污,稱重。以吞噬指數(shù)表示小鼠碳廓清的能力,按公式(4)、(5)計(jì)算廓清指數(shù)(K)值和吞噬指數(shù)(a),按公式(6)、(7)計(jì)算小鼠胸腺指數(shù)(b)和脾臟指數(shù)(c)[27]。

(4)

(5)

(6)

(7)

式(4)至(7)中：M1為小鼠處死后體質(zhì)量(g);m1為肝臟質(zhì)量(mg);m2為脾臟質(zhì)量(mg);m3為胸腺質(zhì)量(mg);M2為小鼠處死前體質(zhì)量(g)。

1.10 數(shù)據(jù)處理方法

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行 3 次平行實(shí)驗(yàn),數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,采用 Design-Expert 11.0、Excel 2016 和GraphPad Prism 8.0 軟件分析處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 外源酶篩選結(jié)果

9種外源酶,在各自最適酶解條件下酶解3 h,與空白(無(wú)外源酶)相比,水解度均有提高,且外源酶的生基原料試驗(yàn)組水解度均高于熟基原料試驗(yàn)組,以堿性蛋白酶效果最優(yōu),其熟基試驗(yàn)組水解度為(26.50±0.23)%,生基試驗(yàn)組水解度高達(dá)(40.88±0.40)%(圖1),表明堿性蛋白酶與南美白對(duì)蝦內(nèi)源酶自溶酶解具有較好的協(xié)同作用,因此,選用堿性蛋白酶與生基原料進(jìn)行后續(xù)酶解工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)研究。

圖1 外源酶對(duì)蝦蛋白水解度(DH)的影響Fig.1 Effect of exogenous enzymes on the degree of shrimp proteolysis

2.2 外源酶協(xié)同蝦頭內(nèi)源酶自溶酶解單因素試驗(yàn)

各因素對(duì)蝦蛋白水解度的影響見(jiàn)圖2。如圖2(a)所示,隨酶添加量增大,水解度呈上升趨勢(shì),當(dāng)酶添加量為4%時(shí),水解度達(dá)最大值。繼續(xù)增加酶用量,水解度趨于平緩。這是由于酶添加量過(guò)高會(huì)影響酶活性中心對(duì)底物的定位和接近,抑制酶的活性[28],且繼續(xù)增加酶用量,酶與底物結(jié)合趨于飽和,出現(xiàn)酶過(guò)?，F(xiàn)象,抑制酶解反應(yīng)的進(jìn)行[29],使得水解度趨于平緩。因此,選取酶添加量為4%。

圖2 各因素對(duì)蝦蛋白水解度(DH)的影響Fig.2 Effects of various factors on the degree of shrimp proteolysis

如圖2(b)所示,酶解6 h時(shí)水解度達(dá)最高值,而后趨于平緩。酶解反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)可能引起酶活力下降,底物肽鏈中可與酶活性位點(diǎn)結(jié)合的肽鍵數(shù)減少[30],導(dǎo)致水解度基本不變。因此,選取酶解時(shí)間為6 h。

如圖2(c)所示,在酶解溫度為40 ℃ 時(shí)水解度達(dá)到最高值,而后溫度繼續(xù)升高,酶的活性降低,甚至使其永久性失活,從而導(dǎo)致水解度降低[31]。因此,選取酶解溫度為40 ℃。

如圖2(d)所示,隨著料液比升高,水解度顯著增加。適宜的料液比,使得酶與底物在酶解時(shí)有充分的接觸,從而提高水解度。過(guò)高的料液比,導(dǎo)致底物濃度降低,酶解速率減慢,酶解效率下降,水解度趨于平緩。因此,選取料液比為1∶5。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化外源酶協(xié)同內(nèi)源酶自溶酶解工藝

2.3.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案與實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在外源酶協(xié)同蝦頭內(nèi)源酶自溶酶解單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面優(yōu)化進(jìn)行酶解工藝條件的優(yōu)化,響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.3 Response surface experimental factors and responses

2.3.2 二次回歸擬合及方差分析

以蝦蛋白水解度為響應(yīng)值,根據(jù)表3的數(shù)據(jù),利用 Design-Expert 11.0軟件進(jìn)行多元回歸分析,擬合得到二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=49.71+0.586 3A-0.48B+2.15C-0.212 5AB+0.43AC-0.952 5BC-2.15A2-2.32B2-3.22C2。

該模型的方差分析見(jiàn)表4。模型(P<0.000 1)極顯著,失擬項(xiàng)(P=0.221 1>0.05)不顯著,相關(guān)系數(shù)R2=0.985 8,表明模型與試驗(yàn)結(jié)果擬合較好,預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值間具有高度的相關(guān)性。各因素對(duì)蝦蛋白水解度的影響程度大小順序?yàn)椋好附鈺r(shí)間>酶添加量>酶解溫度。

表4 回歸系數(shù)模型及方差分析表Tab.4 Model summary and analysis of variance

2.3.3 各因素間對(duì)蝦蛋白水解度交互作用的響應(yīng)面分析

各因素間交互作用對(duì)蝦蛋白水解度的影響,可從響應(yīng)面與等高線的變化得到直觀反映[32]。如圖3所示,因素B與因素C曲線最為陡峭,等高線為橢圓形,說(shuō)明酶解時(shí)間與酶解交互作用最為顯著;因素A與因素B、因素A與因素C交互作用均不顯著,其中因素A與因素B,曲線平滑,等高線為圓形,交互作用最弱,與方差分析結(jié)果一致。

圖3 各因素交互作用對(duì)蝦蛋白水解度影響的響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface diagram of the interaction of various factors on the degree of shrimp proteolysis

2.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)驗(yàn)證

采用 Design-Expert 11.0 軟件優(yōu)化功能,在試驗(yàn)因素取值范圍內(nèi)選擇響應(yīng)值最大值,可得到最佳試驗(yàn)條件：酶添加量4.05%、酶解溫度39.90 ℃、酶解時(shí)間6.48 h,此時(shí)預(yù)測(cè)的酶解液中蛋白水解度為50.12%。根據(jù)試驗(yàn)實(shí)際操作可行性,取最優(yōu)酶解條件為：酶添加量4%,酶解溫度40 ℃,酶解時(shí)間6.5 h,試驗(yàn)重復(fù)3次,此條件下酶解,測(cè)得蛋白水解度實(shí)際值為(50.02±0.13)%,接近理論值。結(jié)果表明該工藝模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果擬合度高,利用響應(yīng)面法優(yōu)化南美白對(duì)蝦副產(chǎn)物酶解工藝準(zhǔn)確可行。

2.4 揮發(fā)性鹽基氮含量的測(cè)定結(jié)果

揮發(fā)性鹽基氮含量與海水魚(yú)、蝦、頭足類等水產(chǎn)品的新鮮度有明顯的對(duì)應(yīng)關(guān)系?！妒称钒踩珖?guó)家標(biāo)準(zhǔn) 鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品》指出通過(guò)測(cè)定揮發(fā)性鹽基氮含量可反應(yīng)水產(chǎn)品的新鮮度,并要求海水魚(yú)、蝦、頭足類揮發(fā)性鹽基氮含量小于等于30 mg/100 g[21]。在響應(yīng)面模型優(yōu)化的最優(yōu)酶解工藝條件下,檢測(cè)在酶解過(guò)程中,蝦加工副產(chǎn)物揮發(fā)性鹽基氮含量的變化。如圖4所示,在酶解0～6 h范圍內(nèi),揮發(fā)性鹽基氮含量平緩上升,在10 h才超過(guò)限定標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明：所用蝦加工副產(chǎn)物原料新鮮度、加工適用性好,且在酶解時(shí)間8 h范圍內(nèi),揮發(fā)性鹽基氮含量不超限,可用于開(kāi)展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 揮發(fā)性鹽基氮含量在酶解過(guò)程中的變化Fig.4 Changes of volatile base nitrogen content during enzymatic hydrolysis

2.5 蝦蛋白肽分子量的測(cè)定及活性評(píng)價(jià)結(jié)果

2.5.1 蝦蛋白肽分子量測(cè)定

選取5種標(biāo)準(zhǔn)品,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品過(guò)凝膠柱的色譜圖,測(cè)定蝦蛋白肽樣品的分子量。標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的洗脫時(shí)間為：細(xì)胞色素C 9.25 min,抑肽酶11.73 min,維生素B12 15.10 min,二甘氨酰甘氨酸18.00 min,甘氨酸19.30 min。同等條件下測(cè)定蝦蛋白肽的分子量。如圖5所示,蝦蛋白肽的分子量主要分布在1.5 kDa以下,其中75～1 355 Da占比為76.35%。

2.5.2 羥自由基清除率

活性肽的羥自由基清除能力主要由暴露的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)和肽序列所決定。與維生素C(VC)相比,蝦蛋白肽清除羥自由基(·OH)的能力相對(duì)較弱(圖6)。隨著反應(yīng)濃度的增加,兩者清除·OH的能力也隨之升高。通過(guò)GraphPad Prism 8.0分析擬合并計(jì)算半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50),可得VC的IC50為0.17 mg/mL,蝦蛋白肽的IC50為4.64 mg/mL,表明蝦蛋白肽具有一定的清除·OH能力。

圖6 VC和蝦蛋白肽對(duì)·OH的清除作用Fig.6 Hydroxyl radical scavenging activity of VC and shrimp peptide on ·OH

2.5.3 DPPH自由基清除率

如圖7所示,VC和蝦蛋白肽對(duì)DPPH的清除率隨著樣品濃度的增加而呈上升趨勢(shì),存在量效關(guān)系。當(dāng)蝦蛋白肽含量在5 mg/mL 時(shí),DPPH清除率達(dá)到了85.13%。通過(guò)GraphPad Prism 8.0分析擬合并計(jì)算,可得VC的IC50為0.03 mg/mL,蝦蛋白肽的IC50為3.08 mg/mL。表明蝦蛋白肽具有一定的DPPH清除能力。

2.5.4 蝦蛋白肽對(duì)BALB/c鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響

機(jī)體的特異性免疫主要包括細(xì)胞免疫和體液免疫。在細(xì)胞免疫中,淋巴細(xì)胞增殖活性的提高對(duì)機(jī)體免疫具有正向調(diào)節(jié)作用。如圖8所示,蝦蛋白肽單獨(dú)給藥對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖無(wú)影響;但是同時(shí)添加蝦蛋白肽(1 μg/mL或10 μg/mL)和絲裂源LPS(10 μg/mL)具有促進(jìn)作用,顯著刺激了小鼠淋巴細(xì)胞增殖,且與絲裂源LPS(10 μg/mL)相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明蝦蛋白肽具有一定的促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的作用。

圖8 蝦蛋白肽對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig.8 Effect of shrimp peptides on the proliferation of splenic lymphocytes“***”表示P<0.001(與對(duì)照組相比);“#”表示P<0.05,“##”表示P<0.01(與LPS組相比)。

2.5.5 蝦蛋白肽對(duì)免疫力低下模型小鼠免疫功能的影響

吞噬指數(shù)反映了巨噬細(xì)胞的吞噬能力,進(jìn)而反映機(jī)體非特異性免疫水平。而胸腺和脾臟是機(jī)體重要的免疫器官,免疫器官的質(zhì)量變化可反映機(jī)體的免疫功能,免疫器官質(zhì)量增加為免疫增強(qiáng)的表現(xiàn),反之則為免疫抑制。如圖9所示,模型組小鼠的吞噬指數(shù)、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)明顯降低,說(shuō)明免疫力低下的模型成功建立。用蝦蛋白肽給藥21 d的小鼠,3個(gè)劑量組均能顯著提高免疫低下模型小鼠的胸腺指數(shù),中劑量組(10 mg/kg)能顯著提高吞噬指數(shù)和脾臟指數(shù)。以上結(jié)果表明蝦蛋白肽能使免疫力低下小鼠的免疫器官增重并提高免疫細(xì)胞的吞噬能力,顯示出提高免疫力的功效。

圖9 蝦蛋白肽對(duì)免疫抑制小鼠吞噬指數(shù)、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響Fig.9 Effects of shrimp peptides on phagocytic index,thymic index,and splenic index in immunosuppressed mice“*”表示P<0.05,“***”表示P<0.001(與陰性組相比);“#”表示P<0.05,“##”表示P<0.01,“###”表示P<0.001(與模型組相比)。

2.6 討論

利用酶解法提取蛋白肽,主要包括內(nèi)源酶自溶酶解法及外加酶復(fù)合酶解法。內(nèi)源酶自溶酶解法對(duì)副產(chǎn)物蝦頭蝦殼的水解能力普遍不足,本研究采用9種外源蛋白酶與蝦頭內(nèi)源酶對(duì)蝦頭蝦殼進(jìn)行復(fù)合酶解,結(jié)果表明：堿性蛋白酶對(duì)蝦頭內(nèi)源酶具有較好的協(xié)同作用,經(jīng)單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面優(yōu)化后的蝦蛋白水解度達(dá)(50.02±0.13)%,高于藍(lán)尉冰等的堿性蛋白酶解工藝[蝦蛋白水解度為(43.88±0.03)%][33]和何穎恒等的超聲波輔助堿性蛋白酶與中性蛋白酶復(fù)合酶解(蝦蛋白平均水解度為42.5%)[34],本研究的酶解工藝更具優(yōu)勢(shì)。

文獻(xiàn)報(bào)道酶解工藝制備的蝦蛋白肽具有顯著的抗氧化、清除自由基、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)肝腎等功能,而且蝦蛋白肽的活性與酶解位點(diǎn)及蛋白肽的分子量緊密相關(guān)。如分子量小于 6 kDa的低分子量肽更容易穿過(guò)胃腸屏障與目標(biāo)物質(zhì)結(jié)合發(fā)揮作用[35]。王晉等采用風(fēng)味蛋白酶制備蝦蛋白肽,其中3～10 kDa的多肽組分具有顯著的抗氧化作用[36]。黃湛媛等采用中性蛋白酶酶解,從竹節(jié)蝦(Penaeusjaponicus)蝦頭酶解產(chǎn)物中分離制備抗氧化肽中分子量在<3 kDa的組分具有顯著的抗氧化活性[37]。姜爍琦經(jīng)體外模擬胃腸道消化制備低分子量(小于1 kDa的組分占84.38%)中華管鞭蝦(Solenoceracrassicornis)蝦頭肽,其低分子量肽可增強(qiáng)小鼠體液免疫、細(xì)胞免疫及改變腸道菌群結(jié)構(gòu),改善小鼠免疫低下,并恢復(fù)小鼠的肝腎代謝功能[38]?？梢?jiàn),低分子肽段可能顯示出更佳的生物學(xué)功效。本研究采用堿性蛋白酶協(xié)同蝦頭內(nèi)源酶自溶酶解,酶解產(chǎn)物經(jīng)膜分離后獲得的蝦蛋白肽分子量主要分布在1.5 kDa以下,屬于低分子量肽段。此蝦蛋白肽對(duì)羥自由基、DPPH自由基具有一定的清除能力,較方磊等報(bào)道的南極磷蝦肽的羥自由基清除能力[39]更優(yōu)。此外,蝦蛋白肽可顯著促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖,并能顯著提高小鼠的胸腺指數(shù),特別是中劑量組(10 mg/kg)能顯著提高吞噬指數(shù)和脾臟指數(shù),顯示出免疫增強(qiáng)功效。后續(xù)工作可結(jié)合蝦蛋白肽的氨基酸序列研究,探究蝦蛋白肽的結(jié)構(gòu)特征與其功效活性(抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等)的構(gòu)效關(guān)系,為開(kāi)發(fā)高質(zhì)化功能性蛋白肽產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

本研究以南美白對(duì)蝦加工副產(chǎn)物(蝦頭蝦殼)為原料,通過(guò)外源酶協(xié)同蝦頭內(nèi)源酶自溶酶解工藝制備蝦蛋白肽,并對(duì)其進(jìn)行功效評(píng)價(jià)。結(jié)果表明堿性蛋白酶協(xié)同內(nèi)源自溶酶具有較好的酶解效果。通過(guò)單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化,得到最佳酶解工藝條件為：酶添加量4%、酶解時(shí)間6.5 h、酶解溫度40 ℃、料液比1∶5。在此條件下,蝦蛋白水解度為(50.02±0.13)%,且在酶解8 h內(nèi),蝦加工副產(chǎn)物的揮發(fā)性鹽基氮含量符合《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品》限定標(biāo)準(zhǔn)。酶解產(chǎn)物經(jīng)膜分離后,所得蝦蛋白肽分子質(zhì)量主要分布在75～1 355 Da,占比為76.35%,其對(duì)羥自由基、DPPH的IC50分別為4.64 mg/mL和3.08 mg/mL ,具有一定的自由基清除能力。此外,南美白對(duì)蝦副產(chǎn)物蝦蛋白肽能促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖,改善胸腺和脾臟萎縮,提高免疫細(xì)胞的吞噬能力,顯示出較明顯的免疫增強(qiáng)功效,具有開(kāi)發(fā)成為功能性免疫調(diào)節(jié)劑的潛能,值得深入研究和開(kāi)發(fā)。