劉嘉嘉,梁小君,周琳琳,鐘晨輝,郭辰濤,唐隆晨,林 琪*

(1.福建省水產(chǎn)研究所、福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 廈門(mén)361013;2.上海海洋大學(xué)、水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 201306;3.海洋生物種業(yè)技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心,福建 廈門(mén) 361013)

光是植物賴(lài)以生存的重要環(huán)境因子,不僅作為光合作用的能量來(lái)源,還參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)與發(fā)育,光的光譜組分(光質(zhì))是光因子的一種重要屬性[1]。大部分藻類(lèi)植物生長(zhǎng)在水環(huán)境中,由于水層深度和水體組分差異造成了水體對(duì)不同波長(zhǎng)光的選擇性折射和吸收,不同水體的光質(zhì)組分存在差異[2-3]。為適應(yīng)水體環(huán)境的光譜組分,藻類(lèi)在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中獲得了多樣的光質(zhì)適應(yīng)機(jī)制[4]。大量研究指出,可見(jiàn)光區(qū)的不同光質(zhì)(白、藍(lán)、紅、綠光)可對(duì)藻類(lèi)的光合效率、形態(tài)建成、生長(zhǎng)發(fā)育[5-7]、細(xì)胞結(jié)構(gòu)[8]以及生化代謝[9-15]等多個(gè)方面產(chǎn)生顯著的影響。例如,藍(lán)光可提高硬石莼(Ulvarigida)、長(zhǎng)珊瑚藻(Corallinaelongata)和海頭紅(Plocamiumcartilagineum)[10]以及角刺藻(Chaetocerossp.)[11]的葉綠素含量,促進(jìn)真江蘺(Gracilariavermiculophylla)的氨基酸合成[12]以及海帶(Saccharinajaponica)幼孢子體的生長(zhǎng)、細(xì)胞分裂[6]和卵母細(xì)胞形成[7];紅光處理可促進(jìn)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻(Caulerpalentillifera)增重[13];綠光處理可提高龍須菜(Gracilariopsislemaneiformis)相對(duì)生長(zhǎng)率和光合效率[5],并有利于紫球藻(Porphyridiumcruentum)[9]和海膜(Halymeniafloresii)[14]的生長(zhǎng)及光合色素積累。另外,藻類(lèi)具有豐富迥異的生活史形式,有些藻類(lèi)在不同生活史階段對(duì)光質(zhì)的響應(yīng)也存在差異,例如,藍(lán)光可促進(jìn)小球藻(Chlorella)突變體休眠細(xì)胞對(duì)氨基酸的吸收,但卻抑制了生長(zhǎng)期細(xì)胞對(duì)氨基酸的吸收[15]。

壇紫菜(Pyropiahaitanensis)是一種具異形世代交替生活史的大型海洋紅藻,其果孢子與殼孢子是實(shí)現(xiàn)世代交替的關(guān)鍵發(fā)育細(xì)胞[16]。目前,盡管關(guān)于不同光質(zhì)對(duì)紫菜絲狀體及葉狀體的影響已有報(bào)道[8,17-22],但光質(zhì)是否在壇紫菜孢子萌發(fā)過(guò)程中發(fā)揮作用目前尚不太清楚。因此,本研究以壇紫菜的果孢子和殼孢子為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,探討白、藍(lán)、紅、綠光4種光質(zhì)對(duì)壇紫菜果孢子和殼孢子萌發(fā)的影響,旨在為探究壇紫菜對(duì)光質(zhì)的適應(yīng)性響應(yīng)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用果孢子由福建省霞浦海區(qū)養(yǎng)殖筏架上具成熟果孢子囊的壇紫菜葉狀體經(jīng)陰干刺激后放散獲得[23],殼孢子由實(shí)驗(yàn)室內(nèi)保存的壇紫菜純系絲狀體經(jīng)擴(kuò)培促熟后放散獲得[24]。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件設(shè)定

實(shí)驗(yàn)所用組合光源(白光)及單色光源(藍(lán)、紅、綠光)由功率為11 W的發(fā)光二極管(light emitting diode,LED)提供,其波長(zhǎng)范圍分別為：白光400～760 nm、藍(lán)光455～475 nm、紅光580～630 nm、綠光510～550 nm。通過(guò)增減LED燈管的數(shù)量及其與實(shí)驗(yàn)材料的距離對(duì)光量子通量密度進(jìn)行調(diào)節(jié),并采用PLA-20光譜分析儀測(cè)量實(shí)驗(yàn)光源的波長(zhǎng)與光量子通量密度,培養(yǎng)果孢子和殼孢子的光量子通量密度分別為(15±1) μmol photons/(m2·s)和(40±2 ) μmol photons/(m2·s);溫度與光周期均統(tǒng)一設(shè)置為(22±1)℃、10L∶14D。

1.3 孢子的培養(yǎng)與攝片記錄

實(shí)驗(yàn)使用的培養(yǎng)液均為MES(modified ES)培養(yǎng)基[25]。將含有果孢子的海水經(jīng)過(guò)200目篩絹濾去雜質(zhì)后攪拌均勻,取等體積果孢子懸濁液于無(wú)色培養(yǎng)皿(Φ=9 cm)中黑暗靜置12 h,待孢子附著后分別置于不同光質(zhì)的光源下培養(yǎng),每個(gè)光質(zhì)組設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。每3 d更換1/3培養(yǎng)液,并用Leica DMI8倒置顯微鏡進(jìn)行觀察、攝片,隨機(jī)統(tǒng)計(jì)20個(gè)果孢子萌發(fā)體的萌發(fā)管分枝數(shù)目及萌發(fā)管總長(zhǎng)度。殼孢子的培養(yǎng)與攝片方法同上,培養(yǎng)過(guò)程中統(tǒng)計(jì)60個(gè)殼孢子萌發(fā)體的細(xì)胞數(shù)目。另外,在培養(yǎng)皿中隨機(jī)選取30個(gè)視野(Φ=2 mm),統(tǒng)計(jì)區(qū)域內(nèi)的孢子數(shù)量,在不同光質(zhì)下培養(yǎng)15 d后,再次以同樣的方法統(tǒng)計(jì)隨機(jī)30個(gè)視野的孢子數(shù)量,并計(jì)算孢子的存活率。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用圖像測(cè)量軟件Digimizer V4.3.4測(cè)量果孢子萌發(fā)管總長(zhǎng)度,Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計(jì),Origin 9.0作圖,IBM SPSS 19進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組間的單因素ANOVA檢驗(yàn),設(shè)置差異顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同光質(zhì)對(duì)壇紫菜果孢子萌發(fā)的影響

2.1.1 果孢子萌發(fā)的細(xì)胞學(xué)觀察

如圖1所示,果孢子經(jīng)12 h避光附著后,可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)具明顯的凝集狀黃褐色色素體[圖1(a)、(g)、(m)、(s)]。遇光后的果孢子迅速萌發(fā),并很快在各光質(zhì)處理組間出現(xiàn)顏色差異。在白光與藍(lán)光下的果孢子萌發(fā)體始終色澤飽滿(mǎn),呈鮮紅色[圖1(b)至(f)、(h)至(l)],而經(jīng)紅、綠光培養(yǎng)3 d的果孢子萌發(fā)體已呈黃褐色,并隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行,其色澤愈發(fā)暗淡,與白光組和藍(lán)光組的萌發(fā)體顏色形成鮮明對(duì)比,最終呈現(xiàn)淺黃褐色[圖1(n)至(r)、(t)至(x)]。在培養(yǎng)后期觀察到紅光組萌發(fā)體的萌發(fā)管明顯較其他光質(zhì)組少而短[圖1(q)、(r)],而綠光組的萌發(fā)體雖然色澤與紅光組類(lèi)似,呈暗淡的淺黃褐色,但其萌發(fā)管較其他光質(zhì)組更長(zhǎng),且具更多的分枝[圖1(w)、(x)]。

圖1 不同光質(zhì)下培養(yǎng)的壇紫菜果孢子的形態(tài)變化Fig.1 Morphogenetic developments of carpospores of P. haitanensis cultured under different light qualities(a)至(f)分別為白光下培養(yǎng)0、3、6、9、12、15 d的壇紫菜果孢子和萌發(fā)體;(g)至(l)分別為藍(lán)光下培養(yǎng)0、3、6、9、12、15 d的壇紫菜果孢子和萌發(fā)體;(m)至(r)分別為紅光下培養(yǎng)0、3、6、9、12、15 d的壇紫菜果孢子和萌發(fā)體;(s)至(x)分別為綠光下培養(yǎng)0、3、6、9、12、15 d的壇紫菜果孢子和萌發(fā)體。

2.1.2 萌發(fā)管分枝形成的時(shí)序

對(duì)果孢子萌發(fā)體萌發(fā)管分枝形成時(shí)序的量化統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,綠光下果孢子萌發(fā)管的分枝形成速度最快,白光下次之,藍(lán)光下再次之,紅光下最慢。在培養(yǎng)至第3天時(shí),紅光組萌發(fā)體的平均萌發(fā)管分枝數(shù)目已顯著低于白光對(duì)照組(P<0.05),其余各組間未形成顯著差異(P>0.05)。在培養(yǎng)進(jìn)行至第9天時(shí),各組間平均萌發(fā)管分枝數(shù)目開(kāi)始出現(xiàn)較明顯的差異,其中綠光組最多,白光組次之,紅光組、藍(lán)光組則顯著低于其余各組(P<0.05),二者間暫無(wú)顯著差異(P>0.05)。從第12天起至培養(yǎng)結(jié)束,各光質(zhì)組萌發(fā)體的平均萌發(fā)管分枝數(shù)目表現(xiàn)出綠光組>白光組>藍(lán)光組>紅光組,且在各組間差異顯著(P<0.05)。其結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同光質(zhì)下培養(yǎng)的壇紫菜果孢子的平均萌發(fā)管分枝數(shù)目Fig.2 Average numbers of germ tube branches of carpospores of P. haitanensis cultured under different light qualitiesn=20,不同字母代表同一時(shí)間內(nèi)組間差異顯著(P<0.05),下同。

2.1.3 萌發(fā)管長(zhǎng)度比較

與萌發(fā)管分枝數(shù)目相似,在不同光質(zhì)條件培養(yǎng)下果孢子萌發(fā)體的萌發(fā)管長(zhǎng)度也存在較明顯的差異。在培養(yǎng)至第3天時(shí),綠光組萌發(fā)體的平均萌發(fā)管長(zhǎng)度已開(kāi)始明顯大于其他光質(zhì)組(P<0.05),其余各組間則無(wú)顯著差異(P>0.05)。從第6天起,紅光組萌發(fā)體的平均萌發(fā)管長(zhǎng)度顯著小于白光組(P<0.05),藍(lán)光組則與白光組之間暫未形成顯著差異(P>0.05),但從第9天起至培養(yǎng)結(jié)束,藍(lán)光組萌發(fā)體的平均萌發(fā)管長(zhǎng)度一直處于略大于紅光組,但與之無(wú)顯著差異的水平(P>0.05),而二者均顯著小于白光組(P<0.05),并呈現(xiàn)出綠光組>白光組>藍(lán)光組>紅光組(P<0.05)。其結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同光質(zhì)下培養(yǎng)的壇紫菜果孢子萌發(fā)體的平均萌發(fā)管長(zhǎng)度Fig.3 Mean lengths of germ tubes of carpospore germlings of P. haitanensis cultured under different light qualities n=20。

2.1.4 果孢子存活率

在白、藍(lán)、紅、綠光4種不同光質(zhì)下培養(yǎng)15 d后的壇紫菜果孢子其存活率分別為87.53%、88.28%、82.19%和89.68%,紅光組的壇紫菜果孢子的存活率略低于其他3個(gè)光質(zhì)組,但各組間無(wú)顯著差異(P>0.05),其結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同光質(zhì)下培養(yǎng)15 d的壇紫菜果孢子的存活率Fig.4 Survival rates of carpospores of P. haitanensis cultured under different light qualities for 15 days n=30。

2.2 不同光質(zhì)對(duì)壇紫菜殼孢子萌發(fā)的影響

2.2.1 殼孢子萌發(fā)的細(xì)胞學(xué)觀察

萌發(fā)前的壇紫菜殼孢子通常呈球狀,深黃褐色或暗橙黃色(圖5)。在培養(yǎng)初期,各光質(zhì)組的殼孢子萌發(fā)過(guò)程相似,細(xì)胞發(fā)生橫向分裂,并形成明顯的假根。培養(yǎng)至第6天時(shí),藍(lán)光組的萌發(fā)體細(xì)胞顏色開(kāi)始逐漸變紅[圖5(i)];而培養(yǎng)至第9天時(shí),各光質(zhì)條件下的萌發(fā)體色澤出現(xiàn)明顯差異,藍(lán)光組的萌發(fā)體細(xì)胞顏色加深并呈現(xiàn)鮮紅色[圖5(j)],白光組則呈現(xiàn)紅棕色[圖5(d)],而紅、綠光組仍然保持暗淡的黃褐色[圖5(p)、(v)]。培養(yǎng)至第15天時(shí),各組中以藍(lán)光組的萌發(fā)體顏色最深,呈深紫紅色[圖5(k)、(l)],白光組次之,呈鮮紅色[圖5(e)、(f)],紅光組和綠光組萌發(fā)體均呈暗淡的淺黃褐色,且紅光組色澤較綠光組稍淺[圖5(q)、(r)、(w)、(x)]。

圖5 不同光質(zhì)下培養(yǎng)的壇紫菜殼孢子萌發(fā)過(guò)程的形態(tài)變化Fig.5 Germination morphogenesis of P. haitanensis conchospores cultured under different light qualities(a)至(f)分別代表白光下培養(yǎng)0、3、6、9、12、15 d的壇紫菜殼孢子和萌發(fā)體;(g)至(l)分別代表藍(lán)光下培養(yǎng)0、3、6、9、12、15 d的壇紫菜殼孢子和萌發(fā)體;(m)至(r)分別代表紅光下培養(yǎng)0、3、6、9、12、15 d的壇紫殼孢子和萌發(fā)體;(s)至(x)分別代表綠光下培養(yǎng)0、3、6、9、12、15 d的壇紫菜殼孢子和萌發(fā)體。

2.2.2 殼孢子的發(fā)育時(shí)序

與白光組相比,綠光組的殼孢子萌發(fā)體細(xì)胞分裂較快,而藍(lán)光組和紅光組則相對(duì)較慢。在前9天培養(yǎng)過(guò)程中,4種光質(zhì)條件下培養(yǎng)的殼孢子萌發(fā)體的平均細(xì)胞數(shù)目未出現(xiàn)顯著差異 (P>0.05)。但培養(yǎng)至第12天時(shí),與白光組相比,藍(lán)光組和紅光組萌發(fā)體的平均細(xì)胞數(shù)目明顯偏少(P<0.05),而綠光組則顯著高于其余光質(zhì)組(P<0.05)。培養(yǎng)至第15天時(shí),藍(lán)光組萌發(fā)體的平均細(xì)胞數(shù)目仍顯著低于白光對(duì)照組(P<0.05),綠光組萌發(fā)體的細(xì)胞數(shù)目則仍保持顯著最高的水平(P<0.05)。其結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同光質(zhì)下培養(yǎng)的壇紫菜殼孢子萌發(fā)體的平均細(xì)胞數(shù)目Fig.6 Average cell numbers of conchospore germlings of P. haitanensis cultured under different light qualities n=60。

2.2.3 殼孢子存活率

藍(lán)、紅、綠3種單色光下培養(yǎng)的殼孢子在第15天時(shí)的存活率分別為91.62%、93.03%和91.99%,均略低于白光組(96.71%),但各光質(zhì)組間無(wú)顯著差異(P>0.05)。其結(jié)果如圖7所示。

圖7 不同光質(zhì)下培養(yǎng)15 d的壇紫菜殼孢子的存活率Fig.7 Survival rates of conchospores of P. haitanensis cultured under different light qualities for 15 days n=30。

3 討論

水對(duì)不同波段可見(jiàn)光的吸收具有明顯的選擇性[2-3]。受所處水層深度及水體成分的影響,不同藻類(lèi)生境的光譜組分存在明顯差異,因此,不同種類(lèi)的海洋藻類(lèi)在長(zhǎng)期的適應(yīng)性進(jìn)化過(guò)程中對(duì)光質(zhì)變化表現(xiàn)出豐富的響應(yīng)模式[4,26]。在本研究中,不同光質(zhì)下培養(yǎng)的壇紫菜果孢子和殼孢子均能萌發(fā),但萌發(fā)速度與細(xì)胞顏色表現(xiàn)出明顯差異,這表明不同波長(zhǎng)的光在壇紫菜孢子的生長(zhǎng)發(fā)育中不僅能夠充當(dāng)能量供應(yīng)的角色來(lái)驅(qū)動(dòng)光合作用的進(jìn)行,還能影響孢子早期萌發(fā)時(shí)的形態(tài)建成和生長(zhǎng)發(fā)育。

光合色素是藻類(lèi)吸收光能的重要物質(zhì)基礎(chǔ),包括葉綠素、藻膽素、類(lèi)胡蘿卜素等,這些色素的含量和組成決定了藻體的顏色[27],并可隨著藻體對(duì)外界環(huán)境的光譜組分的適應(yīng)而發(fā)生改變[10,28]。海藻所含光合色素種類(lèi)、含量及其吸收光譜特性決定了它們對(duì)不同波段光的利用勢(shì)必是不同的[29]。本研究觀察到綠光與紅光下的萌發(fā)體細(xì)胞出現(xiàn)明顯的顏色變淺,而藍(lán)光下的細(xì)胞顏色明顯加深,這與壇紫菜絲狀體和葉狀體在這兩種光質(zhì)下的藻體色澤變化相類(lèi)似,說(shuō)明紅光與綠光可能不利于藻膽色素的積累,藍(lán)光則反之[17-18]。單一的紅光或綠光照射下萌發(fā)體的色澤消退可能與天線(xiàn)蛋白的解耦和藻膽素的降解有關(guān),這是由于紫菜的天線(xiàn)色素藻膽素對(duì)紅綠光具有很強(qiáng)的吸收作用[28],光合作用的過(guò)量激發(fā)能會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生有害的自由基,因此,天線(xiàn)蛋白解耦和藻膽素降解對(duì)避免這種過(guò)激是十分有利的[30-31]。相反,有研究表明臍形紫菜 (Porphyraumbilicalis)葉狀體對(duì)藍(lán)光的吸收作用較弱[21],在單一藍(lán)光照射下細(xì)胞光合作用的光能捕獲能力十分有限,但其適應(yīng)性地提高了與光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)緊密相關(guān)的藻膽素的含量,這可能對(duì)維持藻體穩(wěn)定的光合作用具有重要意義。目前,長(zhǎng)期的紅光或綠光照射已被證實(shí)不利于壇紫菜葉狀體和絲狀體的生長(zhǎng)[17-18],且綠光還會(huì)抑制壇紫菜殼孢囊枝細(xì)胞的形成[32],但本研究中綠光照射下的孢子卻表現(xiàn)出比白光下孢子的萌發(fā)速度更快的現(xiàn)象,這與壇紫菜雌性配子體在綠光下能夠最早形成生殖細(xì)胞并促進(jìn)單性生殖孢子的發(fā)生與萌發(fā)相似[18]。事實(shí)上,綠光已被發(fā)現(xiàn)能以最低光照強(qiáng)度促使多種紅藻孢子的萌發(fā)[33],一些富含藻紅素的紅藻和藍(lán)藻種類(lèi)也表現(xiàn)出對(duì)綠光的利用效率比其他光質(zhì)更高效的現(xiàn)象[34-36]。本研究中,綠光下培養(yǎng)的壇紫菜果孢子、殼孢子及其萌發(fā)體生長(zhǎng)速度明顯優(yōu)于其他光質(zhì)條件下的生長(zhǎng)速度,暗示壇紫菜可能對(duì)綠光具有較高的利用效率。然而目前有關(guān)紫菜對(duì)不同光質(zhì)光源的適應(yīng)性響應(yīng)機(jī)制還知之甚少,還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

光質(zhì)顯著影響壇紫菜果孢子和殼孢子萌發(fā)過(guò)程中細(xì)胞的色澤變化。白光和藍(lán)光能使果孢子和殼孢子的萌發(fā)體顏色加深,最終變?yōu)轷r紅色或深紫紅色,紅光和綠光則使兩者顏色變淺,最終呈淺黃褐色。綠光能明顯促進(jìn)壇紫菜孢子萌發(fā)體的生長(zhǎng),暗示壇紫菜可能對(duì)綠光具有更高的利用效率。