李明嘉 趙苗妙 楊金奎*

(1. 首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科,北京 102600;2. 北京市糖尿病研究所,北京 100730)

糖尿病(diabetes mellitus, DM)是內(nèi)分泌系統(tǒng)的一種代謝紊亂疾病,由內(nèi)源性胰島素水平缺乏或活性不足引起。隨著生活水平的提高及全球老齡化,DM患病率越來越高,成為各國主要的健康負擔。據(jù)統(tǒng)計,2019年全球約有4.63億DM患者,達到了9.3%的全球患病率,預計到2045年,這一數(shù)字將增加到7.002億[1]。我國DM患病率也從2013年的10.9%增長到2018年的12.4%,遠高于全球估計值(8.3%)[2]。糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是DM患者常見的慢性微血管并發(fā)癥,已成為全球慢性腎疾病(chronic kidney disease, CKD)的首要病因[3]。2017年全球有6.97億CKD患者[4],其中DN是CKD的最常見病因。目前對于DN的治療主要還是應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白2抑制劑來降低腎小球內(nèi)壓、減少蛋白尿、保護腎功能,缺乏針對發(fā)病機制的特異性療法。

值得注意的是,組織蛋白酶(cathepsin,CTS)與DM的發(fā)病密切相關(guān),并參與了DM及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。研究[5]表明,缺乏組織蛋白酶S(cathepsin S, CTSS)的非肥胖糖尿病(non obese diabetes, NOD)小鼠、缺乏組織蛋白酶B(cathepsin B, CTSB)的NOD小鼠以及缺乏組織蛋白酶L(cathepsin L, CTSL)的NOD小鼠中DM發(fā)病率分別為33%、28%、0%,而野生型NOD小鼠的DM發(fā)病率為69%,差異有統(tǒng)計學意義。Garsen等[6]證明了缺乏CTSL的小鼠與野生型小鼠相比,前者沒有出現(xiàn)蛋白尿、系膜基質(zhì)擴張、小管間質(zhì)纖維化,顯示出了正常腎功能。在一項研究隊列包括1 270名參與者,平均隨訪8年的Meta分析[7]中,尿中組織蛋白酶D(cathepsin D, CTSD)含量與1型糖尿病中估算腎小球濾過率(estimated glomerular filtration rate, eGFR)快速下降相關(guān),并反映腎小管間質(zhì)損傷。以上證據(jù)都提示了多種組織蛋白酶參與到DM及DN的發(fā)病與進展過程。

本課題組前期致力于研究CTSL的作用與機制,前期工作利用冷凍電鏡與臨床患者血清揭示了CTSL在新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)感染中的重要作用及機制[8],并通過機器學習的方法篩選出多種CTSL抑制劑[9],證實了CTSL在感染性疾病中所發(fā)揮的重要作用。本文將對CTSB、CTSD、CTSL與CTSS,這幾個研究較為廣泛的分子在非感染性代謝性疾病中發(fā)揮的重要作用進行討論,系統(tǒng)性回顧它們在DM及DN中的作用及機制。

1 CTS家族蛋白

一個健康生物體的維持很大程度上依賴于蛋白質(zhì)的合成、成熟、執(zhí)行功能和最終分解。為了完成上述過程,人類基因組編碼了550多種蛋白酶和200多種內(nèi)源性蛋白酶抑制劑[10],CTS就是其中的一個龐大家族。到目前為止,在人類中已發(fā)現(xiàn)了15類CTS,主要包括了CTS A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、O、S、V、W、Z,根據(jù)其蛋白水解機制又可分為絲氨酸蛋白酶(CTSA、CTSG)、天冬氨酸蛋白酶(CTSD、CTSE)、半胱氨酸蛋白酶(CTSB、CTSC、CTSF、CTSH、CTSK、CTSL、CTSO、CTSS、CTSV、CTSW、CTSZ)[11],其中半胱氨酸組織蛋白酶占據(jù)了組織蛋白酶家族的主要部分(圖1)。

一般來說,CTS家族成員在酸性細胞器中,即在溶酶體和核內(nèi)體中是穩(wěn)定的,并能夠高效地裂解各種底物,執(zhí)行其功能。CTSB可以促進淀粉樣斑塊形成、降解基質(zhì)從而促進病毒等進入細胞,主要與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移、胰腺炎、阿爾茨海默病、呼吸道炎癥性疾病、肝纖維化等疾病有關(guān)[12]。CTSD可以促進侵襲、裂解細胞外基質(zhì)蛋白,主要與乳腺癌、阿爾茨海默病、神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥等疾病有關(guān)[13]。CTSL可以降解基質(zhì)、促進病毒入侵細胞,主要與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移、牙齦增生等疾病有關(guān)[14-15]。CTSS可以提呈抗原、重塑結(jié)締組織和基底膜,主要與Ⅳ型星形細胞瘤、動脈粥樣硬化等疾病相關(guān)[16]。

雖然CTS普遍分布于哺乳動物細胞,但它們在組織和器官中表達水平不同,一些CTS如B、L普遍表達,而F、K、S等在細胞和組織中的分布是有限的[17]。

2 CTSB、CTSD、CTSL、CTSS在DM中的作用

CTS與DM的相關(guān)關(guān)系已得到驗證。Huang等[18]通過實驗發(fā)現(xiàn)肌肉CTSL基因在DM易感小鼠中表達增加,并與糖耐量有關(guān)。Chen等[19]發(fā)現(xiàn)在超重和肥胖的中國成人中,循環(huán)中CTSS濃度升高與代謝綜合征密切相關(guān)。Ding等[20]分別收集了男性2型糖尿病患者及年齡匹配的健康男性人群的血漿樣本,發(fā)現(xiàn)患者群體中血漿CTSD活性而非濃度增加,此外CTSD活性還與2型糖尿病的代謝參數(shù)顯著相關(guān)(糖化血紅蛋白、胰島素抵抗指數(shù)和血糖),所以這些數(shù)據(jù)都指向血漿CTSD作為男性2型糖尿病的代謝調(diào)節(jié)因子。此外,Ding等[21]還在一項臨床試驗中證明了血漿CTSD活性與肝胰島素敏感性呈負相關(guān),以往認為“高胰島素-正糖鉗夾”是評估外周和肝胰島素敏感性的金標準,由此提出血漿CTSD活性檢測可能被用作人類肝胰島素敏感性的非侵入性檢查指標。一項前瞻性隊列研究[22]顯示較高的CTSS與胰島素敏感性降低相關(guān)、與較高的DM發(fā)病風險相關(guān),所以CTSS活性可能參與早期葡萄糖和胰島素代謝異常。有研究者[23]利用蛋白質(zhì)組學和基因分型數(shù)據(jù)找到了29種DM的生物標志物,其中就包括CTSD,另外一項蛋白質(zhì)組學研究量化了1型糖尿病患者與其健康兄弟姐妹之間的尿液中低豐度蛋白質(zhì)的差異,發(fā)現(xiàn)CTSB在二者中發(fā)生變化,并參與炎癥和代謝過程[24]。這對于預測、診斷DM具有臨床指導意義。

2.1 CTSB、CTSD、CTSL介導自身免疫反應(yīng)導致1型糖尿病

早在2005年,Maehr等[25]的研究結(jié)果就已經(jīng)表明CTSL活性對NOD小鼠1型糖尿病的發(fā)生至關(guān)重要。1型糖尿病是一種自身免疫性疾病,人和小鼠的主要組織相容性復合體Ⅱ(major histocompatibility complex Ⅱ, MHC Ⅱ)類區(qū)域是其關(guān)鍵易感位點,CTS生成肽,由Ⅱ類MHC分子提呈給CD4+T細胞進而引發(fā)免疫反應(yīng)[26]。CTSL缺失對小鼠提供了保護作用,CTSL缺失小鼠與野生型小鼠相比,調(diào)節(jié)性T細胞比例增加,所以認為調(diào)節(jié)性T細胞與侵略性CD4+T細胞之間的失衡提供了保護作用。CT4+T細胞肽表位驅(qū)動自身免疫性疾病的鑒定一直非常困難,最近Reed等[27]提出1型糖尿病的發(fā)生與MHCⅡ類分子所呈現(xiàn)的肽表位相關(guān),一些肽表位通過分泌顆粒蛋白的不同肽片段融合拼湊在一起,創(chuàng)建了一種新的嵌合表位。這些表位是由CTSL 消化適當?shù)臒o活性顆粒蛋白片段產(chǎn)生的。Serpin B13是一種在胰腺上皮中表達的CTSL抑制劑。在體內(nèi)外抑制Serpin B13,可通過Notch1使Ngn3+內(nèi)分泌祖細胞的數(shù)量增加,并增強了向β細胞的轉(zhuǎn)化。抗Serpin B13抗體可刺激胰腺中Ngn3+內(nèi)分泌祖細胞的形成,并使兒童1型糖尿病進展延遲[28]。混合胰島素肽通過胰島素原片段與其他肽段之間的肽鍵在胰腺β細胞中形成,并且可以被1型糖尿病患者的CD4+T細胞以及NOD小鼠的致病性CD4+T細胞靶向。通過蛋白質(zhì)組學分析,Crawford等[29]確定了CTSD、CTSL分別是驅(qū)動疾病中混合胰島素肽特異性形成、水解的主要蛋白酶。敲除CTSB可下調(diào)自身反應(yīng)性CD4+T細胞對胰腺β細胞的侵襲性,胰島周圍細胞浸潤減少[30]。

2.2 CTSB、CTSL、CTSS通過多種機制導致2型糖尿病

Yang等[31]發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者循環(huán)CTSL濃度升高,并且CTSL通過降解基質(zhì)纖維連接蛋白、胰島素受體(insulin receptor, IR)和胰島素樣生長因子-1受體(insulin-like growth factor-1 receptor, IGF-1R)參與了2型糖尿病的發(fā)病機制,提示CTSL可作為治療靶點。Urbich等[32]指出高糖顯著降低了CTSL的蛋白表達和活性,而內(nèi)皮祖細胞侵入缺血組織需要CTSL將基質(zhì)降解,所以這限制了內(nèi)皮祖細胞改善DM新生血管的能力。2014年Lafarge等[33]發(fā)現(xiàn)了CTSS基因敲除鼠相較于對照組血糖顯著改善,通過研究發(fā)現(xiàn)CTSS敲除可減少肝葡萄糖生成,可能有助于改善葡萄糖耐量,但對胰島素敏感性沒有明顯影響。最近,日本學者[34]提出CTSS通過抑制肝細胞肝糖輸出來改善糖代謝,并且可誘導胰高血糖素樣肽-1 (glucagon like peptide-1,GLP-1)分泌,循環(huán)中的CTSS有助于改善小鼠糖代謝。由此可見有一些機制尚未得到公認,有的甚至相反。CTSB可能是通過炎癥和細胞凋亡參與DM的發(fā)病過程,在敲除CTSB后,腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)誘導的細胞凋亡減輕[35]。

3 CTSB、CTSD、CTSL、CTSS在DN中的作用

3.1 CTSL介導腎小球濾過屏障損傷

DN早期表現(xiàn)為微量白蛋白尿,隨著疾病的進展表現(xiàn)為持續(xù)性白蛋白尿,這提示腎小球濾過屏障受損。足細胞附著在腎小球濾過屏障的外層,是維持腎小球濾過屏障完整性的主要成分[36]。由于它們是終末分化細胞,在體內(nèi)沒有增殖能力,因此足細胞的損傷和丟失在DN進展過程中發(fā)揮重要作用[37]。CTSL可降解維持足突正常結(jié)構(gòu)的蛋白,如突觸蛋白(synaptopodin)[38]、動力蛋白(dynamin)[39],進而介導蛋白尿表型。環(huán)孢素A可通過阻斷CTSL介導的足細胞突觸蛋白降解來預防蛋白尿[10]。

3.2 CTSB促進近端小管重吸收蛋白質(zhì)的降解

在DM患者中,近端小管暴露于大量的營養(yǎng)物質(zhì)中,易發(fā)生營養(yǎng)超載,進而導致腎小管肥大、損傷[40],CTSB在內(nèi)皮細胞和腎小管近端高表達[41]。然而在DM早期,腎小管細胞因CTSB活性降低而導致蛋白分解降低。此外,CTSB被證明參與尿調(diào)素肽的形成[42],它們具有腎特異性并表現(xiàn)出促炎活性,在DN早期變化中可能發(fā)揮作用;在病變晚期,白蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)變化,可抑制CTSB功能,導致溶酶體功能障礙并進一步造成損傷[43]。研究[44]表明經(jīng)腎小球濾過后的CTSB可被低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1和巨蛋白(megalin)捕獲,隨后內(nèi)化入細胞,并通過M6P通路進入溶酶體,繼續(xù)發(fā)揮蛋白水解功能。

3.3 CTSB、CTSS介導基質(zhì)蛋白降解和內(nèi)皮損傷

CTSB有助于DM腎組織中纖連蛋白(fibronectin)的降解從而緩解病理改變[45]。CTSS是單核-巨噬細胞來源的循環(huán)中蛋白酶激活受體-2(protease-activated receptor-2, PAR-2)激動劑,與DM微血管并發(fā)癥相關(guān)。其致病機制主要是通過內(nèi)皮一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)表達下調(diào)、內(nèi)皮對白蛋白的通透性增加所致[46-47]。

3.4 CTSL創(chuàng)造慢性炎癥微環(huán)境

CTSL可以激活乙酰肝素酶(heparanase),裂解硫酸乙酰肝素(heparan sulfate, HS),硫酸乙酰肝素在基底膜和各種細胞表面豐富表達,并作為多種生物活性分子的協(xié)同受體發(fā)揮作用[6]。既往,人們認為乙酰肝素酶通過降解腎小球基底膜上的HS導致DN,但越來越多的數(shù)據(jù)[48]表明乙酰肝素酶的激活形成了一個慢性炎癥微環(huán)境,保護了巨噬細胞的異常激活、 防止炎癥消退,通過Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)途徑來激活巨噬細胞,隨后NF-κB通路被激活,促進了TNF-α的表達,由此介導了炎癥反應(yīng)、腎損傷。

3.5 CTSD、CTSL促進晚期糖基化終產(chǎn)物的降解

晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products, AGEs)是還原糖和活性醛與蛋白質(zhì)、脂類和核酸發(fā)生非酶促反應(yīng)的最終產(chǎn)物,在DM中有所積累。AGEs通過與受體結(jié)合或被炎癥細胞內(nèi)化產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species, ROS),同時誘導細胞因子的釋放,促進炎癥反應(yīng)。Grimm等[49]的研究表明,施加AGEs刺激后,細胞中溶酶體數(shù)量增多、溶酶體蛋白酶活性增強,CTSD mRNA水平增高、成熟體增多;CTSL mRNA不變、成熟體增多。因此CTSD、CTSL可降低AGEs的毒性。

4 抑制CTS的小分子藥物的研究現(xiàn)狀

鑒于CTS在疾病中所發(fā)揮的巨大作用,開發(fā)CTS抑制劑一直都是研究的熱點。近年來,新藥的開發(fā)雖然取得了一些進展,但仍存在一些缺陷:①治療劑量的CTS抑制劑對細胞有毒性作用;②廣譜的CTS抑制劑可能會導致其他不良反應(yīng);③可能存在生物利用度低的問題[50]。下面對本文中重點介紹的幾種CTS抑制劑研發(fā)現(xiàn)狀進行介紹。

目前臨床應(yīng)用的CTSS抑制劑是來自羅氏公司的Compound RO5459072[51],它基于原有的化合物結(jié)構(gòu)進行改造,增加了藥物的體內(nèi)穩(wěn)定性和代謝參數(shù),該藥物已在乳糜瀉、干燥綜合征等自身免疫性疾病的臨床試驗中進行測試[52]。通過口服RO5461111(也是一種CTSS抑制劑)兩個月,治療組2型糖尿病db/db小鼠中蛋白尿較對照組減少了60%,治療期間產(chǎn)生的穩(wěn)定血漿濃度為400～600 ng/mL[53]。Kwork等[54]揭示了一種完全人源化的抗CTSS抗體Fsn0503 h,介導抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC),也是抑制CTSS的一種候選藥物。

目前已知的天冬氨酸蛋白酶抑制劑是來自放線菌的蛋白酶抑素A,但由于其非特異性,可能會引起不良反應(yīng),然而在哺乳動物中還沒有已知的CTSD內(nèi)源性抑制劑[55]。中藥的某些有效成分已被證明可下調(diào)CTSD的表達[56],黃酮類化合物水合桑葚苷、番石榴等成分可抗氧化、抗炎癥,最近已被證明可以抑制慢性腎損傷小鼠腎中的CTSD[57]。最近,以蛋白酶抑素A為基礎(chǔ)設(shè)計出了一種大環(huán)擬肽類抑制劑,與蛋白酶抑素A相比,它們在納摩爾范圍內(nèi)抑制CTSD,而沒有毒性[58]。另外,還通過機器學習的方法篩選出許多種候選化合物,但缺乏體內(nèi)外驗證的數(shù)據(jù)。

CTSB抑制劑作為潛在的抗癌和抗轉(zhuǎn)移劑曾一度受到追捧,但至今仍未開發(fā)出共價可逆特異性的抑制劑。目前文獻[59-60]中常用到的CTSB抑制劑為CA-074/CA-074Me,半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)為2～5 nmol/L。有學者[50]提出了新型CTSB抑制劑,不過與CA-074/CA-074Me相比,還相差甚遠(IC50分別為:<1 μmol/L、8～125 nmol/L)。

和CTSB一樣,目前缺乏特異性針對CTSL的抑制劑,到目前為止還沒有用于臨床的CTSL抑制劑。本課題組從小分子文庫、天然化合物中篩選CTSL抑制劑,并通過結(jié)構(gòu)優(yōu)化、分子改造(引入腈基)來提高候選分子的活性、選擇性和可逆性。不過這些分子的藥代動力學、藥物效應(yīng)學還不夠完善,有待于進一步驗證。

隨著對致病機制的深入了解,將會有越來越多的CTS抑制劑進入臨床試驗。這將為治療DM、DN,甚至其他疾病提供新的思路。

5 結(jié)語

本文重點回顧了CTSB、CTSD、CTSL、CTSS與DM及DN的關(guān)系及其背后的作用機制。CTSB、CTSD、CTSL、CTSS有可能作為預測、診斷和治療疾病的重要分子。盡管目前的研究已取得可喜的進展,但關(guān)于組織蛋白酶致病機制及藥物開發(fā)方面的研究還有巨大的空間。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明李明嘉:提出研究思路,撰寫論文;趙苗妙:提出研究思路,撰寫論文;楊金奎:提出研究思路,論文總體把關(guān)、審定。