軒 冉，薛丹丹，王春楊，鮑金鳳，虞亞菲，段晉燕 解放軍醫(yī)學院，北京 0085；解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心檢驗科，北京 0085；解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心泌尿外科，北京 0085

男性不育中無精子癥占5% ~ 10%，是男性不育患者十分嚴重的一種情況[1-2]。無精子癥分為梗阻性無精子癥(obstructive azoospermia，OA)和非梗阻性無精子癥(non-obstructive azoospermia，NOA)兩大類。OA 指睪丸內精子發(fā)生正常，但由于雙側睪丸網至射精管開口的任意部位生殖道梗阻，導致精子不能正常排出體外[3]；NOA 指原發(fā)性睪丸功能衰竭或下丘腦/垂體功能異常等引起的生精功能障礙從而導致射出的精液中無精子，是無精子癥中更嚴重的類型[4]。NOA 的病理生理學較復雜，遺傳/先天性異常、泌尿生殖道感染、精索靜脈曲張、創(chuàng)傷、內分泌失調等都可能與疾病發(fā)生發(fā)展相關[5]。目前，不明病因的NOA 臨床鑒別診斷主要方法是睪丸活檢，但侵入性手術可能導致NOA 患者更嚴重的性腺功能減退[5-6]?；诖?，尋找鑒別NOA 病理亞型的非侵入性術前標志物具有重要臨床意義。采用LC-MS/MS 進行蛋白質組學的高通量檢測和分析，已廣泛應用于疾病病理、發(fā)病機制及發(fā)生發(fā)展的新型生物標志物的鑒定[7-9]。本實驗應用超高效液相色譜串聯質譜技術，基于數據依賴采集(data-dependent acquisition，DDA)模式，比較NOA 不同亞型患者精漿差異表達蛋白，以期為NOA 不同亞型的病理生理提供分子生物學視角。

對象與方法

1 研究對象及 分組 收集2020 年10 月 - 2022年1 月于解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心門診行精液常規(guī)分析的非梗阻性無精子癥患者精液，在精液常規(guī)分析檢測后將樣本分裝，于-80℃冷凍備用。納入標準：參照WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5 版標準，至少3 次精液常規(guī)分析中無精子，且睪丸活檢證實為非梗阻性無精子癥。排除標準：已知的獲得性(如化療、雙側隱睪和睪丸扭轉等) 和遺傳(核型畸變、Y 染色體AZF 缺失)等原因導致的非梗阻性無精子癥。根據血清性激素[睪酮(testosterone，T)、卵泡刺激素(folliclestimulating hormone，FSH)、黃體生成素(luteinizing hormone，LH)] 水平將患者分為：(1)原發(fā)性性腺功能減退(primary hypogonadism，PH) 組，血清T 濃度低于正常值，且血清LH 和(或)FSH 濃度高于正常值；(2) 繼發(fā)性性腺功能減退(secondary hypogonadism，SH)組，血清T 低于正常值，且血清LH 和(或)FSH 濃度正常或低下；(3)血清性激素水平正常組(NH 組)[10]。本研究通過解放軍總醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準(S2021-669-01)。

2 精液標本處理 取出凍存標本，3 000 r/min 離心10 min，留取上清(精漿)待用。采用NanoDrop微量分光光度計檢測精漿蛋白濃度。5 μL 精漿與65 μL 金標水混合，95℃變性5 min；加入4 μL 1 mol/L 碳酸氫銨和8 μL 100 mmol/L 2-巰基乙醇，混勻后37℃孵育4 h；再加入9 μL 500 mmol/L 碘乙酰胺，室溫避光40 min。取20 μL 上述溶液與60 μL 50 mmol/L 碳酸氫銨于新的EP 管進行酶切，以胰蛋白酶∶蛋白為1∶50 的比例加入胰酶后，37℃酶切12 ~ 16 h。過夜酶切后，加入9 μL 5%甲酸(formic acid，FA) 16 000 r/min 離心15 min；C18 膜經80 μL 100%甲醇活化及80 μL 0.1% FA平衡后，80 μL 樣本經膜過濾3 次；加入80 μL 0.1% FA 800 × g 離心1 min 脫鹽，此步驟重復3 次；用50%乙腈(acetonitrile，ACN)-0.1% FA-水混合液800 × g 離心1 min 洗脫樣本，此步驟重復3 次；最后45℃下220 r/min 熱干2 h 后收集樣本。

3 LC-MS/MS 檢測 0.1% FA 復溶后，各樣品分別取350 ng 肽段上樣。上樣泵流動相由Loading pump A 液98% 水-2% ACN-0.05% FA 和Loading pump B、Loading pump C 液甲醇水-0.05% FA 構成，流速為2 μL/min。采用C18 色譜柱對樣品進行分級，色譜柱以A 液100% 水-0.1% FA 平衡，以B 液20% 水-80% ACN-0.08% FA 洗脫，流速為0.6 μL/min，梯度：0 ~ 5 min，B 液0 ~ 10%；5 ~ 10 min，B 液10% ~ 12.5%；10 ~ 85 min，B 液12.5% ~ 27.5%；85 ~ 110 min，27.5% ~ 50%；110 ~115 min，維持B 液95%；115 ~ 120 min，95% ~ 5%。經色譜分離后的樣品進樣到Q-Exactive 質譜儀進行質譜測定，檢測時長為120 min，檢測方式為正離子，母離子掃描范圍300 ~ 1400 m/z，一級分辨率為70000，AGC target 為3e6，一級Maximum IT 為60 ms。每次全掃描(full mass)為20 個循環(huán)計數(loop count)，MS2 二級分辨率為17500，AGC target 為5e4，二 級Maximum IT 為80 ms，Isolation window 為3.0 m/z，Normalized CE/stepped NCE 為27 eV。

4 質譜結果分析 使用Proteome Discoverer 2.2.0軟件將質譜原始raw 文件在Uniprot 蛋白數據庫進行搜庫計算分析，根據錯誤發(fā)現率(false discovery rate，FDR)＜0.01 的標準對數據進行篩選。使用Perseus1.6.15 軟件對搜庫文件進行數據前處理，去除50%缺失值，將數據進行對數轉換，之后做標準化處理。

5 生 物學 信息 處 理 篩 選 差異 蛋白 的 條 件 為：Student’st檢 驗P＜0.05 且 差 異 倍 數＞1.5 或＜0.67 倍(|log2 fold change|＞0.58)。使用SRING 11.0(https://string-db.org)對差異蛋白進行功能富集分析，包括GO 富集分析和Pathway 通路富集分析等，P＜0.05 為顯著富集的通路。

6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 26.0 對數據進行統(tǒng)計分析，呈正態(tài)分布的計量資料以xˉ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。質譜原始數據去除50%缺失值后，剩余缺失值用中值以下高斯分布中的隨機值代替。兩組間差異蛋白質比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義；FDR 采用BH多重檢驗校正計算，以FDR＜0.01 為過濾閾值。差異表達蛋白通路聚類分析采用Hyper geometry檢驗和BH 多重檢驗校正。

結 果

1 研究對象一般資料 共納入患者21 例，年齡26 ~ 34 歲。按性激素水平(表1)將其分為原發(fā)性性腺功能減退組(12 例)、繼發(fā)性性腺功能減退癥(6 例)和性激素水平正常組(3 例)。由于非梗阻性無精子癥患者多伴隨性激素水平異常，故本研究中NOA 患者性激素水平正常組納入例數較少。

表1 三組非梗阻性無精子癥血清性激素水平Tab. 1 Sera sex hormone levels in three groups of NOA

2 差 異蛋 白 鑒 定 和篩 選 通 過Label-free 定 量蛋白質組學技術，三組患者精漿共鑒定出1144種蛋白質。與性激素水平正常組相比，原發(fā)性性腺功能減退組上調差異蛋白32 個、下調差異蛋白8 個，繼發(fā)性性腺功能減退組上調差異蛋白14 個、下調差異蛋白99 個(表2，表3)。與繼發(fā)性性腺功能減退組相比，原發(fā)性性腺功能減退組上調差異蛋白146 個、下調差異蛋白21 個(表4)。差異蛋白火山圖中綠色代表下調蛋白，紅色代表上調蛋白(圖1)。

圖1 差異表達蛋白火山圖A：原發(fā)性性腺功能減退組和性激素水平正常組差異蛋白火山圖；B：繼發(fā)性性腺功能減退組和性激素水平正常組差異蛋白火山圖；C：原發(fā)性性腺功能減退組和繼發(fā)性性腺功能減退組差異蛋白火山圖Fig.1 Volcano of DEPs A: primary hypogonadism group vsnormal sex hormone group; B: secondary hypogonadism group vsnormal sex hormone group;C: primary hypogonadism group vssecondary hypogonadism group

表2 原發(fā)性性腺功能減退組和性激素水平正常組主要差異蛋白Tab. 2 Details of the main DEPs in the primary hypogonadism group compared with normal sex hormone group

表3 繼發(fā)性性腺功能減退組和性激素水平正常組主要差異蛋白Tab. 3 Details of the main DEPs in the secondary hypogonadism group compared with normal sex hormone group

表4 原發(fā)性性性腺功能減退組和繼發(fā)性性腺功能減退組主要差異蛋白Tab. 4 Details of the main DEPs in the primary hypogonadism group compared with secondary hypogonadism group

3 差異表達蛋白生物信息學分析 與性激素水平正常組相比，原發(fā)性性腺功能減退組的差異表達蛋白GO 富集分析中，主要參與的生物學過程包括嗜中性粒細胞脫顆粒、蛋白質運輸和凋亡過程調節(jié)等，主要參與細胞組分包括胞外外泌體、質膜外區(qū)域、細胞囊泡和溶酶體等，主要參與的分子功能包括G 蛋白結合、蛋白質結構域特殊結合和肝素結合等(圖2)；在KEGG 通路分析中，差異表達蛋白主要富集于軸突導向和內質網中蛋白質加工(圖3)。與性激素水平正常組相比，繼發(fā)性性腺功能減退組的差異表達蛋白在GO 富集分析中，主要參加的生物學過程包括小分子化合物的代謝和分解、對外部及化學刺激的反應和胞外分泌調節(jié)，主要參與的細胞成分包括胞外外泌體和細胞囊泡，主要參與的分子功能包括酶催化活性和蛋白質結合(圖4)；在KEGG 通路分析中，差異表達蛋白主要富集于代謝途徑(圖5)。與繼發(fā)性性腺功能減退組相比，原發(fā)性性腺功能減退組差異表達蛋白在GO 富集分中，主要參加的生物學過程包括細胞過程、代謝過程和對刺激及化學刺激反應，主要參加的細胞組分包括胞外區(qū)域和囊泡，主要參與的分子功能包括水解酶活性、酶催化活性和受體結合(圖6)；在KEGG 通路分析中，差異表達蛋白主要富集到溶酶體、糖降解、補體和凝血級聯和阿米巴病(圖7)。值得注意的是，在Tissue Expression 數據庫中，繼發(fā)性性腺功能減退組與性激素水平正常組間差異表達蛋白、原發(fā)性性腺功能減退組與繼發(fā)性性腺功能減退組間的差異表達蛋白多富集于生殖系統(tǒng)、內分泌腺、男性內部生殖器官和男性生殖腺體等(圖8)。

圖2 原發(fā)性性腺功能減退組和性激素水平正常組差異蛋白GO 富集分析Fig.2 GO function analysis for DEPs of the primary hypogonadism group compared with the normal sex hormone group

圖3 原發(fā)性性腺功能減退組和性激素水平正常組差異蛋白KEGG通路Fig.3 KEGG pathway analysis for DEPs of primary hypogonadism group compared with normal sex hormone group

圖4 繼發(fā)性性腺功能減退組和性激素水平正常組差異蛋白GO 富集Fig.4 GO function analysis for DEPs of the secondary hypogonadism group compared with the normal sex hormone group

圖5 繼發(fā)性性腺功能減退組和性激素水平正常組差異蛋白KEGG通路Fig.5 KEGG pathway analysis for DEPs of the secondary hypogonadism group compared with the normal sex hormone group

圖6 原發(fā)性性腺功能減退組和繼發(fā)性性腺功能減退組差異表達蛋白GO 富集Fig.6 GO function analysis for DEPs of the primary hypogonadism group compared with the secondary hypogonadism group

圖7 原發(fā)性性腺功能減退組和繼發(fā)性性腺功能減退組差異表達蛋白KEGG 通路Fig.7 KEGG pathway analysis for DEPs of the primary hypogonadism group compared with the secondary hypogonadism group

圖8 差異表達蛋白Tissue Expression 富集B-C：繼發(fā)性性腺功能減退組和性激素水平正常組；A-B：原發(fā)性性腺功能減退組和繼發(fā)性性腺功能減退組?？v坐標為組間差異表達蛋白富集到該組織中的蛋白質數占總差異表達蛋白數的比例Fig.8 Tissue expression analysis for DEPs B-C: secondary hypogonadism group vsnormal sex hormone group; A-B: primary hypogonadism group vssecondary hypogonadism group. The ordinate is the ration of the number of DEPs enriched into the tissue to the total number of DEPs

4 蛋白質間相互作用(protein-protein interaction，PPI)分析 使用STRING 數據庫進行PPI 分析。原發(fā)性性腺功能減退組與性激素水平正常組間差異表達蛋白的PPI 主要由STXBP2、SOD1、VCP、VIM、MDH2 和RAB8B 蛋白編碼基因組成；繼發(fā)性性腺功能減退組與性激素水平正常組間差異表達蛋白的PPI 主要由TPI1、PPIA、HSP90B1、ITIH4、AHSG、MDH2、CCT2、RPL18A、GNB2L1、C9 和CD44 蛋白編碼基因組成；原發(fā)性性腺功能減退組與繼發(fā)性性腺功能減退組間差異表達蛋白的PPI 主要由HSP90AA1、HSP90B1、CD44、ITIH4、APP、PPIA、CLU、APOM、AHSG、CTSD、TTR、LDHA 和C9 蛋白編碼基因組成。結果表明，MDH2、PPIA、HSP90B1、ITIH4、AHSG、CD44 和C9 蛋白編碼基因可能在非梗阻無精子癥患者精子生成的調控網絡中發(fā)揮重要作用(圖9)。這些蛋白編碼基因是首次被報道可能在非梗阻性無精子癥患者精子生成調控網絡中發(fā)揮作用，其中動物實驗已證實MDH2 和HSP90B1 在精子發(fā)生調控起到重要作用。

圖9 差異表達蛋白間相互作用(PPI)橙色背景為上調蛋白(原發(fā)性性腺功能減退組＞繼發(fā)性性腺功能減退組)；藍色背景為下調蛋白(原發(fā)性性腺功能減退＜繼發(fā)性性腺功能減退組)Fig.9 Protein-protein interaction network of DEPs Orange background: up-regulated proteins (primary hypogonadism group ＞ secondary hypogonadism group); Blue background:down-regulated proteins (primary hypogonadism group ＜ secondary hypogonadism group)

討 論

目前無非侵入性檢測方法能夠準確鑒別NOA亞型及預判患者睪丸中是否存在精子[11]。睪丸的主要功能包括精子產生和睪酮產生，睪丸疾病導致功能異常時為原發(fā)性性腺功能減退，而下丘腦或垂體疾病引起異常為繼發(fā)性性腺功能減退[10,12]。睪丸精子發(fā)生受下丘腦-垂體-睪丸軸的調節(jié)，主要通過下丘腦分泌促性腺激素釋放激素，作用于腺垂體的靶細胞，以分泌與合成LH 和FSH[13-14]。LH 作用于睪丸間質細胞，刺激睪丸合成分泌T，供精子生成需要；FSH 作用于睪丸精曲小管生精上皮的支持細胞，刺激性激素結合球蛋白的生成，刺激性激素結合球蛋白與T 結合使精曲小管內高T 狀態(tài)，維持生精微環(huán)境，促進精子生成。目前國內外對NOA 的研究多集中于血清性激素聯合評估睪丸功能，而蛋白質組學研究相對較少。研究發(fā)現，血清性激素升高或有所改變時生精功能受損[15]；其中FSH 和抑制素B 水平分別與生精功能呈負相關和正相關，且聯合檢測較單項檢測對睪丸生精功能的評估有更高的預測價值[1,4,16-17]。在蛋白組學研究方面，Yao 等[18]通過分析無精子癥患者精漿外泌體蛋白組學，篩選出多種與男性不育相關的差異表達蛋白；還發(fā)現SLC5A12 和HIST1H2BA 在鑒別NOA 患者唯支持細胞綜合征亞型時有100% 的敏感度和特異度?；诖耍ㄟ^FSH、LH 和T 水平將NOA 患者進行分組，采用基于二級譜圖質量更高的DDA 采集模式的質譜技術對精漿進行蛋白組學分析[19]；初探NOA 相關的候選生物標志物，旨在分子水平為NOA 的發(fā)病機制和臨床診療提供新視野。

本研究共發(fā)現1144 種蛋白質，分別有40 種、113 種和167 種蛋白質在性激素水平正常組與原發(fā)性性腺功能減退組間、性激素水平正常組與繼發(fā)性性腺功能減退間、原發(fā)性性腺功能減退組與繼發(fā)性性腺功能減退組間表達有顯著差異。Tissue Expression 富集分析中，組間差異表達蛋白主要富集于生殖系統(tǒng)、男性內部生殖器官和男性生殖腺體等，說明這些差異蛋白可以作為篩選NOA 相關候選生物標志物的來源。PPI 分析表明，MDH2、PPIA、ITIH4、HSP90B1、AHSG、CD44 和C9 可能在NOA 患者精子生成調控網絡中發(fā)揮重要作用。

MDH2 在三羧酸循環(huán)最后一步利用NAD+/NADH 作為輔因子催化蘋果酸酯氧化為草酰乙酸。Muhammad Aslam 等[20]發(fā)現MDH2 減少會降低精子內部能量分布，從而影響精子生成、超活化和受精能力。本研究發(fā)現，與繼發(fā)性性腺功能減退組相比，MDH2 在原發(fā)性性腺功能減退組低表達，進一步證實了MDH2 表達水平的降低會影響睪丸精子生成。此外，非梗阻無精子癥患者MDH2 表達降低或可提示睪丸功能異常致NOA。

HSP90 是細胞中最豐富的蛋白質之一，在精子細胞中可調節(jié)激酶活性、調控減數分裂和精子成熟等過程[21]。目前發(fā)現HSP90 家族有4 個成員：HSP90α、HSP90β、GRP94、TRAP1。研究發(fā)現，缺乏HSP90α 亞型的雄性小鼠由于減數分裂阻滯導致不育；缺乏HSP90β 亞型的動物更容易產生圓頭精子和頂體缺陷的精子；GRP94 和TRAP1 兩種亞型對精子生成的具體調控機制尚不清楚[22]。2018年，有研究發(fā)現包括HSP90B1 在內的6 種熱休克蛋白可能在NOA 發(fā)病機制中發(fā)揮作用[3]。HSP90B1定位于細胞內質網。本研究中在繼發(fā)性性腺功能減退組低表達，我們推測其對精子生成的調控，可能是在滑面內質網通過調節(jié)脂質代謝影響性激素水平，從而在精子生成調控網絡中發(fā)揮作用。

GO 分析表明，差異表達蛋白的主要功能包括小分子化合物的代謝和分解、胞外分泌、小分子生物合成、運輸、對外部及化學刺激反應、酶活性、肽鏈內切酶調節(jié)活性和抑制活性、免疫反應等。這些結果提示，外部及化學刺激、小分子化合物合成分泌異常、酶調節(jié)異常等可能影響精原細胞分化、精母細胞減數分裂、精子細胞變態(tài)過程、類固醇加工、成熟和分泌，從而導致NOA。KEGG 富集分析中，差異表達蛋白主要富集于氨基酸代謝、溶酶體、糖降解、補體和凝血級聯、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、阿米巴病。這些結果表明，氨基酸代謝異常、溶酶體消化功能異?？赡軙鹣虑鹉X-垂體-性腺軸正負反饋調節(jié)異常，從而導致NOA；代謝途徑異常、糖降解紊亂、補體和凝血級聯紊亂可能會引起睪丸功能障礙從而導致NOA。其中，補體和凝血級聯紊亂、糖代謝異常導致男性不育已有報道證實[11,23]。

總而言之，本實驗采用基于DDA 的質譜技術，對NOA 患者精漿進行蛋白組學定性及相對定量分析，初步篩選出的差異表達蛋白在未來有望作為候選生物標志物。但它們確切的生物學功能和機制尚不清楚，因此進一步的實驗研究對闡明它們在NOA 患者發(fā)病機制中所起到的作用至關重要。此外對差異表達蛋白的生物信息學分析，可在分子層面為NOA 患者發(fā)病機制研究及臨床診療提供新的視野。本實驗標本數較少，在接下來的研究中，將擴大樣本量繼續(xù)圍繞本實驗結果進行深入的驗證與探索，以揭示導致NOA 的差異表達蛋白的潛在機制。

作者貢獻軒冉：設計實驗，實施研究，分析數據，撰寫初稿；薛丹丹：采集樣本，解釋數據；王春楊：對文章的知識性內容作批判性審閱；鮑金鳳：分析/解釋數據；虞亞菲：調查研究，數據管理；段晉燕：實驗設計指導，對文章的知識性內容作批判性審閱，獲取研究經費和技術或材料支持。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突。

數據共享聲明本篇論文相關數據可依據合理理由從作者處獲取，Email：xuanxuanr2020@163.com。