孫耕天，任金娜 綜述，錢明 審校

吉林大學(xué)口腔醫(yī)院口腔修復(fù)科，吉林 長春 130021

近年來，水凝膠在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用越來越廣泛，其具有類似組織的機(jī)械性能、高吸水性以及良好的生物相容性，因此適用于生物醫(yī)學(xué)。而組織生物工程學(xué)的主要目標(biāo)是模仿細(xì)胞外基質(zhì)再生受損組織，由于水凝膠具有良好的孔隙率和極為親水的3D結(jié)構(gòu)，在攝取大量的水或液體時溶脹而不溶解，是組織生物工程學(xué)中良好的細(xì)胞載體或基質(zhì)。但當(dāng)細(xì)胞以水凝膠為載體進(jìn)行培養(yǎng)時，水凝膠需與外界培養(yǎng)基進(jìn)行物質(zhì)交換，進(jìn)而保證細(xì)胞的活力及生長，行使其相應(yīng)功能，如藥物輸送［1-2］、修復(fù)受損的神經(jīng)系統(tǒng)［3］、3D 打印［4］等，而兩者的交換方式及影響因素尚不成熟。

本文對影響水凝膠與培養(yǎng)基滲透性的因素及其兩者的交換方式作一綜述，以期為組織生物工程的發(fā)展和研究提供參考。

1 水凝膠的種類

水凝膠是由1 個或多個單體簡單反應(yīng)產(chǎn)生的水膨隆和交聯(lián)聚合物的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其較強(qiáng)的親水特性取決于附著在高分子鏈上的親水官能團(tuán)，而對溶解的抵抗能力來自于網(wǎng)絡(luò)鏈之間的交聯(lián)結(jié)構(gòu)［5］。“水凝膠”一詞最早由Lee，Kwon 和Park 于1894 年在文章中提出，但最早對水凝膠特性進(jìn)行系統(tǒng)性描述并開發(fā)聚甲基丙烯酸羥乙酯［poly（hydroxyethyl methacrylate），PHEMA］水凝膠是Wichterle 和Lim 于1960年在文獻(xiàn)中發(fā)表的，主要目的是使其與人體組織產(chǎn)生永久聯(lián)系，如隱形眼鏡的生產(chǎn)［6］。從那時起，水凝膠被廣泛應(yīng)用于藥物控制給藥系統(tǒng)［7］、生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域作為細(xì)胞載體和生物分子［8］、洗滌劑的開發(fā)、農(nóng)業(yè)、食品業(yè)以及其他領(lǐng)域［9］。水凝膠根據(jù)不同的基礎(chǔ)分類如下。

1.1 根據(jù)來源分類

1.1.1 天然高分子水凝膠 天然高分子水凝膠主要包括：蛋白質(zhì)類（膠原蛋白、明膠、蠶絲蛋白、纖維蛋白等）和多糖類（殼聚糖、透明質(zhì)酸、海藻酸鹽、瓊脂糖等），其優(yōu)點(diǎn)是由于與細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成相似，具有良好的生物相容性、不刺激炎癥和排斥反應(yīng)，且具有良好的力學(xué)性能［10］；缺點(diǎn)為大多數(shù)天然聚合物的強(qiáng)度和韌性較差，不能滿足相關(guān)醫(yī)學(xué)要求［11］。

1.1.2 合成高分子水凝膠 合成高分子水凝膠是指將兩種或兩種以上的天然聚合物相互絡(luò)合而形成的水凝膠，包括PHEMA、聚丙烯酰胺（polyacryla-mide，PAM）、聚乙烯醇［poly（vinyl alcohol），PVA］、聚乙二醇（polyethylene，PEG）及其衍生物等各種高分子材料［12］。復(fù)合水凝膠將不同聚合物的優(yōu)點(diǎn)有效組合，相比天然高分子水凝膠，具有高吸水性、良好的生物相容性及生物降解性、有效期長以及凝膠強(qiáng)度有所增加及其他功能［13］。

1.2 根據(jù)聚合物的組成分類

1.2.1 均聚水凝膠 由單一單體衍生的聚合物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)組成的基本網(wǎng)絡(luò)單元。其性質(zhì)由單體的性質(zhì)和聚合技術(shù)所決定［14］。

1.2.2 共聚水凝膠 由兩種或兩種以上具有至少1種親水性組分的不同單體所構(gòu)成，沿聚合物鏈以隨機(jī)、塊狀或交替結(jié)構(gòu)排列［15］。

1.2.3 互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠 由兩種或兩種以上聚合物交聯(lián)合成或天然聚合物組分制成，分子鏈相互貫穿，至少由1 種聚合物通過化學(xué)鍵的方式交聯(lián)而形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，又稱互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)?；ゴ┚酆衔锞W(wǎng)絡(luò)具有兩種形式［13］：①半互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)：一種聚合物網(wǎng)絡(luò)發(fā)生交聯(lián)，而另一種聚合物與其發(fā)生物理結(jié)合而形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；②全互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)：一種聚合物發(fā)生交聯(lián)后，另一種聚合物與其聚合物網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)從而形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

1.3 根據(jù)交聯(lián)類型分類

1.3.1 物理水凝膠 交聯(lián)過程通過疏水締合、鏈聚集、聚合物鏈絡(luò)合離子和氫鍵等物理過程形成的凝膠，其構(gòu)象的變化具有可逆性。

1.3.2 化學(xué)水凝膠 通過化學(xué)共價鍵等交聯(lián)過程形成的水凝膠，其構(gòu)象的變化具有永久性和不可逆性。

1.3.3 雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠 由物理和化學(xué)交聯(lián)過程形成的水凝膠在靜電相互作用下形成的。相對于物理或化學(xué)水凝膠的性質(zhì)而言，雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠具有更強(qiáng)的液體吸收能力及對pH 變化更加敏感［16］。傳統(tǒng)聚合物水凝膠通常強(qiáng)度弱、機(jī)械性能差，其斷裂能較低，一般在1 ～10 J／m2的范圍內(nèi)［17］；而一般情況下，雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的斷裂能為100 ～1 000 J／m2［18］，因此，雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠特有的結(jié)構(gòu)可改善水凝膠的性能。

水凝膠基于在不同基礎(chǔ)上分類方法眾多，除上述分類方法外，還可根據(jù)其結(jié)構(gòu)（即結(jié)晶式、非結(jié)晶式或半結(jié)晶式）、網(wǎng)絡(luò)電荷的有無（包含中性、離子、兩性電解質(zhì)或兩性離子）、外觀等進(jìn)行分類［19］。

2 水凝膠與培養(yǎng)基滲透性的影響因素

細(xì)胞培養(yǎng)是組織工程學(xué)中最常用且重要的研究方法之一，其技術(shù)對實(shí)驗(yàn)的研究成果至關(guān)重要。水凝膠具有高滲透性的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可用于營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸和細(xì)胞代謝廢物的排放，這對維持細(xì)胞的生存和功能必不可少［20-24］。水凝膠可為細(xì)胞培養(yǎng)與增殖提供適宜且溫和的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）環(huán)境［25］，而培養(yǎng)基中主要包含各種氨基酸、碳水化合物、無機(jī)鹽、維生素以及其他輔助物質(zhì)，為細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)并促進(jìn)其生長與增殖。因此，水凝膠與培養(yǎng)基的滲透性是決定細(xì)胞能否存活與增殖的關(guān)鍵因素之一，而影響其交換方式的因素更為重要。

2.1 水凝膠與培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的擴(kuò)散類型

ALFREY 等［26］通過培養(yǎng)液的擴(kuò)散速率和水凝膠中聚合物的松弛速率將擴(kuò)散分為兩大類型：Fickian（CaseⅠ）型和Non-Fickian（CaseⅡ和不規(guī)則型）型。當(dāng)擴(kuò)散時間為t時，單位面積聚合物所吸收的溶劑量（Mt）為ktn（k 為常數(shù)，n 為與擴(kuò)散機(jī)理有關(guān)的一個參數(shù)，一般在1／2 ～1 之間）。該公式可用來描述任意溫度下高分子聚合物體系中的溶劑擴(kuò)散行為。

2.1.1 Fickian 擴(kuò)散 在穩(wěn)態(tài)擴(kuò)散的條件下，單位時間內(nèi)與擴(kuò)散方向相垂直的單位面積內(nèi)的擴(kuò)散物質(zhì)流量（擴(kuò)散通量）與該橫截面積處的濃度梯度成正比，即濃度梯度越大，擴(kuò)散通量越大。Fickian 擴(kuò)散的特征為在溶脹過程中小分子的擴(kuò)散速率明顯小于高分子結(jié)構(gòu)的松弛速率。因此，水凝膠中溶劑的濃度存在較大的濃度梯度，從聚合物溶脹區(qū)到聚合物中心部位溶劑濃度分布呈指數(shù)衰減。溶劑的擴(kuò)散距離與時間的平方根呈正比：Mt=kt1／2。

2.1.2 Non-Fickian 擴(kuò)散 在非穩(wěn)態(tài)擴(kuò)散過程中，擴(kuò)散物質(zhì)的濃度隨時間的變化而發(fā)生變化。Non-Fickian 型擴(kuò)散可分為兩種：一種為CaseⅡ型擴(kuò)散：在溶脹過程中，溶劑的擴(kuò)散速率大于聚合物網(wǎng)絡(luò)的松弛速率，擴(kuò)散的距離與時間成正比，即Mt= kt，但溶劑向高分子聚合物中心擴(kuò)散時，存在一段呈現(xiàn)Fickian擴(kuò)散濃度特征的誘導(dǎo)時間［27］；另一種為非常規(guī)擴(kuò)散：在此狀態(tài)下，溶劑的擴(kuò)散速率與高分子聚合物的松弛速率在同一個數(shù)量級，擴(kuò)散距離與時間的關(guān)系為：Mt=ktn（1／2 ＜n ＜1）。

研究水凝膠與培養(yǎng)基物質(zhì)擴(kuò)散的類型對于細(xì)胞的培養(yǎng)、藥物的傳遞與釋放等功能起著前瞻性和重要的作用。

2.2 影響水凝膠與培養(yǎng)基滲透性的因素

細(xì)胞體外培養(yǎng)對外界環(huán)境的要求較高，首先要求具備無菌、無毒的培養(yǎng)環(huán)境，其次要具有充足的蛋白質(zhì)、糖類、脂類、維生素、無機(jī)離子等營養(yǎng)物質(zhì)，最后還需具備適宜的pH、溫度、滲透壓以及合適的氧氣和二氧化碳［28］。在此基礎(chǔ)上，還需了解影響水凝膠與培養(yǎng)基滲透性的因素，這也是決定細(xì)胞能否存活與繁殖的關(guān)鍵因素之一。

2.2.1 Michael 加成型反應(yīng) Michael 加成型反應(yīng)又稱1，4 型加成反應(yīng)，該反應(yīng)發(fā)生在親核試劑（如胺、硫醇等）和不飽和羰基化合物（如醛、酮等）之間。ELBERT 等［29］是第1批開發(fā)并利用Michael 加成型反應(yīng)制備水凝膠的研究者。其使用多丙烯酸聚乙二醇與聚乙二醇二硫醇交聯(lián)制備水凝膠，探究運(yùn)送蛋白質(zhì)的可能性，結(jié)果表明，從凝膠基質(zhì)中釋放蛋白質(zhì)超過12 d。LUTOLF等［30］觀察到，當(dāng)硫醇基團(tuán)附著在多肽鏈上時，凝膠的形成具有不同的動力學(xué)。PHELPS等［31］研究了聚乙二醇-4-馬來酰亞胺在離體心臟中的原位應(yīng)用，該水凝膠形成迅速，能夠與周圍組織很好地黏附，組織滲透率高達(dá)50 μm。

因此，Michael 加成型反應(yīng)對于水凝膠與培養(yǎng)基滲透性具有輔助增強(qiáng)效果。但由于親核試劑中胺、氰離子、鹵離子等帶來因環(huán)境、溫度以及毒性產(chǎn)生的不良影響，硫醇作為主要的優(yōu)選材料，主要原因是Michael加成型反應(yīng)是在生理?xiàng)l件下自發(fā)進(jìn)行的［32-33］。

2.2.2 孔隙度 在凝膠過程中，相互連接的多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有利于培養(yǎng)基中的溶質(zhì)、營養(yǎng)物質(zhì)等更有效地向水凝膠中移動，促進(jìn)以水凝膠為載體的細(xì)胞更快地生長和增殖［34］?？紫抖瓤赏ㄟ^制備水凝膠前后不同的技術(shù)來調(diào)節(jié)［35］。研究表明，孔隙度較小的水凝膠與培養(yǎng)基的滲透性越好，因?yàn)樘烊唤M織中的孔隙度是納米級別的，但具有較大孔隙度的水凝膠對于細(xì)胞的生長與增殖需要更長的時間［36-37］。通過研究發(fā)現(xiàn)［38］，相比具有更大或更小孔隙度的水凝膠來說，細(xì)胞在孔徑為0.8 ～8 μm的水凝膠中生長能力增強(qiáng)。YESILYURT 等［39］發(fā)現(xiàn)，聚合物網(wǎng)絡(luò)之間的孔徑大小對培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)的流動性會造成影響。PRASOPTHUM 等［40］和DALY 等［41］研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞會隨著孔隙度的變化而發(fā)生變化。當(dāng)孔徑較小時，細(xì)胞會出現(xiàn)去分化現(xiàn)象；而在較大孔徑的支架中，細(xì)胞停止增殖而分泌ECM 成分。因此，支架中孔徑的大小在水凝膠與培養(yǎng)基滲透性之間起著重要作用。調(diào)節(jié)孔隙度最常用的方法之一是改變交聯(lián)劑的種類以及控制交聯(lián)劑的量［38］，增加交聯(lián)劑的量會導(dǎo)致更多交聯(lián)的產(chǎn)生，從而使支架的孔徑變小。而增加孔隙數(shù)量的方法有：溶劑澆鑄、顆粒浸出、氣體發(fā)泡以及冷凍干燥等技術(shù)，均會留下多孔結(jié)構(gòu)。凝膠過程中支架孔徑的大小還決定培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)的釋放效應(yīng)［39］，這對體外細(xì)胞培養(yǎng)更為重要。

2.2.3 交聯(lián)劑的種類與交聯(lián)方式 交聯(lián)劑是構(gòu)成水凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的重要組成部分，也是水凝膠制備過程中必不可少的成分。水凝膠從液體狀態(tài)轉(zhuǎn)化為凝膠狀態(tài)主要通過物理（疏水締合、鏈聚集和氫鍵）或化學(xué)（共價鍵）交聯(lián)方法實(shí)現(xiàn)［42］。不同交聯(lián)方式的水凝膠與培養(yǎng)基的滲透性不同，從而導(dǎo)致水凝膠承載的細(xì)胞活性不同［43］。因此，聚合物在水凝膠制備過程中交聯(lián)劑的使用對三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成至關(guān)重要。但由于目前的交聯(lián)劑對細(xì)胞活性均有一定影響，近年來學(xué)者們嘗試不同的交聯(lián)方法以及優(yōu)化交聯(lián)過程，從而促進(jìn)細(xì)胞的活力和生物學(xué)性能。LI等［44］以海藻酸鈉和絲素蛋白溶液為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)了雙組分雙交聯(lián)水凝膠，構(gòu)建了中空管道結(jié)構(gòu)及管壁的微孔結(jié)構(gòu)，為毛細(xì)血管的長入提供更多的空間和通道，從而增加了細(xì)胞的生物學(xué)性能。

2.2.4 其他 除了Michael 加成型反應(yīng)、孔隙度以及交聯(lián)劑之外，學(xué)者們還研究了其他影響水凝膠與培養(yǎng)基滲透性的因素，如剪切速率等。對于可注射水凝膠，注射器和針頭的剪切速率會改變水凝膠的黏度，進(jìn)而使水凝膠與培養(yǎng)基的通透性發(fā)生改變。根據(jù)LOPEZ HERNANDEZ 等［45］研究表明，通過對剪切速率的提高，使水凝膠的黏度下降，為培養(yǎng)基的物質(zhì)與水凝膠進(jìn)行物質(zhì)交換提供了相對較低的阻力。

3 小結(jié)

綜上所述，水凝膠和培養(yǎng)基兩者之間的滲透性與Michael 加成型反應(yīng)、孔隙度以及交聯(lián)劑的種類及交聯(lián)方式密切相關(guān)。近年來，研究者也從三方面進(jìn)行了大量研究與實(shí)驗(yàn)，并取得了較豐碩的成果。但目前仍存在一些問題：影響水凝膠與培養(yǎng)基兩者之間滲透性的重疊因素較多，且細(xì)胞活力較為敏感，如何通過控制單一變量研究兩者之間滲透性的影響因素是目前面臨的巨大挑戰(zhàn)，今后應(yīng)更加關(guān)注相關(guān)研究。