馬春英，王美皓 綜述，馬忠仁，王家敏 審校

1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；3.甘肅省生物工程材料工程研究中心，甘肅 蘭州 730010；4.西北民族大學(xué)生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030

從1962年Capstick等成功進(jìn)行BHK21細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)開(kāi)始，動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)入了規(guī)?；a(chǎn)階段，發(fā)展至今已成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究和應(yīng)用中廣泛采用的技術(shù)方法［1］。動(dòng)物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)技術(shù)主要是指在控制溫度、溶氧、pH、流體動(dòng)力學(xué)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物濃度等參數(shù)條件下，依附于生物反應(yīng)器的懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)。而動(dòng)物細(xì)胞貼壁培養(yǎng)作為分泌產(chǎn)物（如重組蛋白和病毒）等生物制品規(guī)?；a(chǎn)的基本技術(shù)支持，其大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)一直是業(yè)內(nèi)研究和關(guān)注的焦點(diǎn)，尤其對(duì)大規(guī)模培養(yǎng)基質(zhì)載體技術(shù)的開(kāi)發(fā)和實(shí)施，從20世紀(jì)50年代至今未停止過(guò)［2-3］。

作為細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)，其材料需具有物理結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、有效的高表面積和機(jī)械穩(wěn)定性、不含動(dòng)物源性成分、耐高壓性和化學(xué)及生物惰性等特性。目前市售的細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)主要包括離子交換交聯(lián)葡聚糖、纖維素、玻璃纖維、膠原蛋白、明膠、海藻酸鈣、聚乳酸-乙醇酸、三甲基銨包被聚苯乙烯、聚氨酯、聚賴氨酸／氟碳乳液以及聚酯纖維等天然高分子材料［4-5］，而以聚酯纖維高分子材料為基質(zhì)的片狀載體作為動(dòng)物細(xì)胞高密度培養(yǎng)的一種有效載體之一，在疫苗生產(chǎn)、細(xì)胞治療和組織工程等不同醫(yī)療應(yīng)用中具有重要意義。

片狀載體又稱紙片載體或大載體，主要是由醫(yī)用級(jí)高分子化合物聚酯纖維［聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate，PET）］通過(guò)靜電超聲波紡絲技術(shù)熱黏合加工成多孔結(jié)構(gòu)的無(wú)紡布基材，進(jìn)一步經(jīng)焊接、成型、清洗和表面改性處理等工藝后，制備的用于貼壁依賴型細(xì)胞和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的片狀固體支持生長(zhǎng)基質(zhì)［6-7］。目前，結(jié)合填充床生物反應(yīng)器的片狀載體技術(shù)高密度灌注培養(yǎng)模式，在生物制品研發(fā)和實(shí)際生產(chǎn)中得到了廣泛應(yīng)用［8］。本文從片狀載體的研究現(xiàn)狀、基質(zhì)材料的合成構(gòu)建、材料表面基質(zhì)的設(shè)計(jì)、細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境系統(tǒng)以及在不同醫(yī)療制品生產(chǎn)中的應(yīng)用等方面作一綜述，為后期片狀載體的繼續(xù)研發(fā)以及選擇片狀載體進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)提供參考。

1 片狀載體的研究現(xiàn)狀

從20 世紀(jì)80 年代至今，在片狀載體的研究、應(yīng)用和銷售領(lǐng)域，國(guó)外一直保持領(lǐng)先地位，已研制出各種不同類型的片狀載體。1976年，SPIER等［9］利用纖維圓形片狀載體（Fibra-Cel disks）成功實(shí)現(xiàn)了BHK-21 細(xì)胞的培養(yǎng)。之后各種不同類型的片狀載體相繼出現(xiàn)，見(jiàn)圖1。這些載體材料相似，僅形狀和結(jié)構(gòu)有所不同，主要分為以聚丙烯（polypropylene，PP）為支架的聚酯圓片載體，如纖維圓片載體（Fibra-Cel disks）［10-11］，以及由100%聚酯纖維制成的各種不同形狀的片狀載體，如多層菱形纖維載體（BioNOCⅡ?）和各種微型聚酯片狀載體等［12-16］。由于結(jié)合填充床生物反應(yīng)器灌注培養(yǎng)模式的片狀載體技術(shù)避開(kāi)了傳統(tǒng)球狀微載體的不足，自動(dòng)化程度高且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，一出現(xiàn)便迅速搶占市場(chǎng)。如德國(guó)Eppendorf 公司的Fibra-Cel disks結(jié)合New BrunswickTMCelliGen?生物反應(yīng)器，可從0.7 L至150 L 進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。中國(guó)臺(tái)灣CESCO 公司的BioNOCⅡTM多層片狀載體結(jié)合Tide Cell?生物反應(yīng)器，可從500 mL小試規(guī)模放大至5 000 L的生產(chǎn)規(guī)模，是世界上唯一一款可進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞收獲的培養(yǎng)系統(tǒng)［12］。

圖1 不同類型片狀載體Fig.1 Different types of fibracel carriers

由于國(guó)內(nèi)動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)起步較晚，規(guī)?；a(chǎn)能力和技術(shù)創(chuàng)新實(shí)力相對(duì)較弱，在片狀載體的研發(fā)及生產(chǎn)上一直處于起步階段，尤其載體原材料受限，主要依賴進(jìn)口。因此，國(guó)內(nèi)生物制藥領(lǐng)域急需加快片狀載體原材料的研發(fā)及生產(chǎn)。上海楚鯤生物科技有限公司、中生天信和生物科技有限公司、蘭州百靈生物技術(shù)有限公司及武漢賽科成科技有限公司等也一直在開(kāi)展片狀載體的研究工作。其中中生天信和生物科技有限公司宣稱開(kāi)發(fā)了從原材料、關(guān)鍵技術(shù)到核心工藝全面國(guó)產(chǎn)化的產(chǎn)品編碼為ZT 的Cellcomb 載體，擺脫了一直以來(lái)片狀載體高度依賴進(jìn)口的“卡脖子”困境［13］。

2 片狀載體的性能

片狀載體作為動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的載體基質(zhì)，其良好的生物相容性以及細(xì)胞培養(yǎng)效果主要由載體材料的表面性能和基于載體的整個(gè)培養(yǎng)環(huán)境的提供及優(yōu)化共同組成。

2.1 合成構(gòu)建依據(jù) 作為細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)材料，最基本的條件就是蛋白質(zhì)吸附。而吸附蛋白層的組成和結(jié)構(gòu)取決于材料表面的化學(xué)和物理性質(zhì)，以及細(xì)胞響應(yīng)和黏附強(qiáng)度。細(xì)胞的黏附是由整合素引起。整合素是一種位于細(xì)胞膜上的受體蛋白，其與被吸附的蛋白層相黏附，之后，由于應(yīng)力纖維（肌動(dòng)蛋白絲）的形成，細(xì)胞開(kāi)始擴(kuò)散和增加表面接觸面積，最后形成細(xì)胞附著點(diǎn)，從而引起細(xì)胞的黏附及生長(zhǎng)。而片狀載體作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)基質(zhì)，其合成構(gòu)建的研究方向主要集中在材料的各種理化性質(zhì)等表面特性的優(yōu)化以及不同形態(tài)的研究及開(kāi)發(fā)，包括表面化學(xué)結(jié)構(gòu)、電荷分布、孔徑大小和表面粗糙度等均能影響細(xì)胞貼壁和黏附效果。適度親水性的材料更有利于誘導(dǎo)細(xì)胞黏附［17］，材料表面引入羰基（-C=O）、羧基（-COOH）和羥基（-OH）等含氧基團(tuán)，可改善其與細(xì)胞的生物相容性；而含氮基團(tuán)的引入不僅能改善親水性，還能影響材料表面電荷分布以及與細(xì)胞膜上蛋白質(zhì)肽鏈產(chǎn)生相互作用等，從各個(gè)角度促進(jìn)細(xì)胞的黏附生長(zhǎng)［18］。粗糙表面有利于生物膜的迅速再生長(zhǎng)，更有利于細(xì)胞的貼壁黏附［19］。多孔結(jié)構(gòu)有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的滲透和細(xì)胞正常代謝，也對(duì)細(xì)胞的黏附生長(zhǎng)有積極作用，且孔徑的大小對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)也有影響，如用不同孔徑尼龍網(wǎng)培養(yǎng)3T3 成纖維細(xì)胞，小孔徑尼龍網(wǎng)的細(xì)胞量遠(yuǎn)高于大孔徑尼龍網(wǎng)［20］。因此，載體基質(zhì)材料表面條件的優(yōu)化與重組，一直是其合成制備工藝中的重要組成部分。

2.2 表面基質(zhì)優(yōu)化 聚酯纖維類聚合物PET 作為片狀載體的主要材料，其形成的3D 網(wǎng)狀空間立體結(jié)構(gòu)織物具有良好的耐酸堿、耐熱性及無(wú)毒、不可生物降解等特點(diǎn)，剛度適中、柔韌性好，對(duì)高流體應(yīng)力有很好的耐受性。對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)而言，是一個(gè)極具經(jīng)濟(jì)效益和良好結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)的基質(zhì)材料［16］。主要缺點(diǎn)為疏水性強(qiáng)，表面能低，不具備細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)，影響細(xì)胞黏附及生長(zhǎng)［21］。需進(jìn)行一定的表面改性修飾以增強(qiáng)其生物相容性和細(xì)胞親和性。目前文獻(xiàn)報(bào)道最多的表面改性方法主要有化學(xué)法、常壓等離子體法和輻射接枝法等。其中，運(yùn)用最多的為化學(xué)接枝法和常壓等離子體法。如OZAKI 等［22］通過(guò)1-乙基-3-（二甲氨基丙基）鹽酸碳二亞胺交聯(lián)水溶劑將凝集素I（ulex europaeus I，UEAI）與PET 共價(jià)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了低聚糖介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的特異性黏附；DESAI 等［23］在PET 表面共價(jià)結(jié)合強(qiáng)親水性聚乙烯氧化物（polyethylene oxide，PEO）改善其親水性；PET 也可在堿性溶液中部分水解，使表面基團(tuán)轉(zhuǎn)變產(chǎn)生羥基，與乙二胺反應(yīng)引入胺基，通過(guò)親水性基團(tuán)的含量提高細(xì)胞生物相容性［17］；TURKOGLU 等［24］通過(guò)低壓H2O／O2等離子體處理NWPE（non-woven polyethylene）無(wú)紡布，使牙周韌帶成纖維細(xì)胞的增殖和活力均獲得改善；劉偉等［16］通過(guò)氬氣等離子體處理在PET 支架上接枝與肝細(xì)胞表面去唾液酸糖蛋白受體（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）特異性結(jié)合的L-NH2半乳糖內(nèi)酯配體，使支架表面產(chǎn)生胺基和羧基等基團(tuán)調(diào)節(jié)其細(xì)胞生物相容性，有效促進(jìn)肝細(xì)胞的黏附、增殖、高密度生長(zhǎng)和分化；利用氬氣等離子體將碳納米顆粒（carbon nano particles，CNPs）接枝到PET 表面，也可增強(qiáng)血管平滑肌細(xì)胞的黏附及增殖［25］；而Fibra-Cel disks 載體通過(guò)甲醇清洗和靜電技術(shù)處理后，產(chǎn)生了凈結(jié)合電荷，使細(xì)胞流過(guò)載體時(shí)截獲至內(nèi)部纖維并貼附生長(zhǎng)，從而增強(qiáng)細(xì)胞的黏附及生長(zhǎng)［7］。另外，還可通過(guò)輻射引起PET 表面大分子的降解生成自由基，而參與接枝的單體同時(shí)受輻射引發(fā)，與大分子鏈上的自由基產(chǎn)生接枝反應(yīng)；如用激光束照射處理PET，通過(guò)增加極性基團(tuán)而提高PET 的極性，從而修飾其表面特性［26］。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境 以聚酯纖維為基質(zhì)的片狀載體作為細(xì)胞生長(zhǎng)基質(zhì)的新選擇廣泛應(yīng)用于各種細(xì)胞規(guī)模化培養(yǎng)，除了材料表面基質(zhì)優(yōu)化設(shè)計(jì)誘導(dǎo)細(xì)胞黏附生長(zhǎng)，還主要依賴于載體自身宏觀的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及在不同類型生物反應(yīng)器中培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)提供的培養(yǎng)環(huán)境。

首先，就載體本身而言，高表面積與體積比為細(xì)胞貼附和生長(zhǎng)提供了更多的有效面積，如Fibra-Cel disks 載體有效面積為1 200 cm2／g，BioNOCⅡTM多層片狀載體可達(dá)2 400 cm2／g，其三維立體空間結(jié)構(gòu)和高孔隙率，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中形成吸附面和保護(hù)層，減少了載體內(nèi)擴(kuò)散限制，可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行高效的捕獲及吸附，使細(xì)胞均能貼附在片狀載體的表面和內(nèi)部纖維上生長(zhǎng)。見(jiàn)圖2。固定在反應(yīng)器罐內(nèi)的片狀載體相互堆積，貼附在載體上的細(xì)胞可遷移至臨近載體上增加其相互作用，使片狀載體不僅對(duì)細(xì)胞的接種密度要求低，還使細(xì)胞的貼附和生長(zhǎng)迅速［27-29］；一般以1×106cells／mL 的初始密度接種，片狀載體在15 ～60 min 即可迅速完成貼附，且?guī)缀跛匈N壁細(xì)胞均能在片狀載體上生長(zhǎng)，除一般貼壁細(xì)胞外，更有利于如MRC-5 和293T 細(xì)胞等一些黏附性較低，難以附著的細(xì)胞培養(yǎng)［30］。目前成功用于片狀載體的細(xì)胞有123A、127A、GAMMA、67-9-B、DA4-4、3T3、Tn-368、Sf9、rSf9、Hi-5、Vero、MDCK、HEK293、BHK、ST、MRC-5、COS、CHO 細(xì)胞及小倉(cāng)鼠腎細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、肝細(xì)胞和人成纖維細(xì)胞等［31-35］。

圖2 片狀載體3D模擬及細(xì)胞生長(zhǎng)圖Fig.2 3D simulation and cell growth diagram of fibracel carriers

其次，片狀載體培養(yǎng)系統(tǒng)主要是指在控制溫度、溶氧、pH、流體動(dòng)力學(xué)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物濃度等參數(shù)條件下，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供極具生理學(xué)特性的微環(huán)境。目前主要依靠籃式生物反應(yīng)器、潮汐式生物反應(yīng)器和激流式生物反應(yīng)器等填充床生物反應(yīng)器完成，這些反應(yīng)器的設(shè)計(jì)主要針對(duì)載體固定化與懸浮、床層等各種培養(yǎng)方式之間的相互關(guān)系。如籃式生物反應(yīng)器配有提升槳，通過(guò)提升槳旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生離心力將細(xì)胞培養(yǎng)液從溢流口甩出，致使攪拌槳內(nèi)部的導(dǎo)管形成負(fù)壓并產(chǎn)生吸力，將罐體底部的培養(yǎng)液吸入導(dǎo)管內(nèi)。而從溢流口流出的培養(yǎng)液自上而下流穿床層內(nèi)固定的載體，從而實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)液載體罐體內(nèi)的循環(huán)。導(dǎo)管底部設(shè)置有氣體分布器，培養(yǎng)基在導(dǎo)管內(nèi)部獲得氧氣供應(yīng)，并避免通氣產(chǎn)生的泡沫與細(xì)胞接觸。提升槳頂部增設(shè)消泡腔，對(duì)導(dǎo)管內(nèi)產(chǎn)生的泡沫進(jìn)行收集并消除，有效降低了因機(jī)械攪拌以及泡沫破裂產(chǎn)生的剪切力。激流式生物反應(yīng)器采用分體設(shè)計(jì)，分為激流細(xì)胞培養(yǎng)袋和灌注細(xì)胞培養(yǎng)袋兩部分，載體置于灌注細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)，通過(guò)表層通氣方式進(jìn)行無(wú)泡通氣，再通過(guò)振蕩器振蕩細(xì)胞培養(yǎng)袋產(chǎn)生激流，增加氣液接觸面和液體混合性能，在最大振蕩速度［120 r／（min·kLa）］下，混合培養(yǎng)液通過(guò)蠕動(dòng)泵泵入灌注細(xì)胞培養(yǎng)袋中，為細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而流穿的培養(yǎng)液回流至激流細(xì)胞培養(yǎng)袋中，往復(fù)循環(huán)培養(yǎng)。而潮汐式反應(yīng)器同樣采用分體式設(shè)計(jì)，反應(yīng)器分為儲(chǔ)液罐和載體罐，片狀載體裝填于載體罐。通過(guò)對(duì)儲(chǔ)液罐中正壓或負(fù)壓的控制，將培養(yǎng)液周期性地從儲(chǔ)液罐壓入載體罐并浸潤(rùn)片狀載體，再吸回至儲(chǔ)液罐使載體暴露空氣中。當(dāng)培養(yǎng)液浸潤(rùn)載體時(shí)，細(xì)胞吸收培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，當(dāng)載體暴露于空氣中時(shí)，細(xì)胞獲得空氣中氧氣。儲(chǔ)液罐采用表層通氣，通過(guò)攪拌的方式進(jìn)行混合［23］。這些填充床生物反應(yīng)器的獨(dú)特設(shè)計(jì)，在細(xì)胞規(guī)模化培養(yǎng)過(guò)程中降低剪切應(yīng)力對(duì)細(xì)胞毒性效應(yīng)的同時(shí)，還有效擴(kuò)大了細(xì)胞產(chǎn)量。一般填充床生物反應(yīng)片狀載體的裝載量可達(dá)30 ～40 g／L，收獲的細(xì)胞量高達(dá)108cells／mL［36］。另外，再結(jié)合灌注培養(yǎng)模式，使細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中實(shí)現(xiàn)高效的氧傳遞效率和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的及時(shí)補(bǔ)充，以及代謝產(chǎn)物的及時(shí)去除，從而使細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中實(shí)現(xiàn)持續(xù)的高密度和高活力生長(zhǎng)，通常可超過(guò)1 ～2個(gè)月，并且不會(huì)發(fā)生堵塞的風(fēng)險(xiǎn)［34］。

3 片狀載體應(yīng)用

隨著生物制藥領(lǐng)域的不斷發(fā)展，以動(dòng)物細(xì)胞為基質(zhì)的生物制品的規(guī)?；a(chǎn)對(duì)當(dāng)代生物技術(shù)的發(fā)展具有極其重要的意義。而片狀載體作為提供哺乳動(dòng)物及昆蟲(chóng)細(xì)胞生長(zhǎng)的一種固體支持基質(zhì)，除用于前期實(shí)驗(yàn)研究和商業(yè)生產(chǎn)中動(dòng)物細(xì)胞的規(guī)?；囵B(yǎng)外，主要還應(yīng)用于以下幾個(gè)方面。

3.1 在疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用 疫苗作為預(yù)防和控制傳染病爆發(fā)最有效的手段，在公共衛(wèi)生防護(hù)安全中具有重要作用。細(xì)胞源病毒疫苗的生產(chǎn)作為疫苗生產(chǎn)的主要方法，需要高密度細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)更高的疫苗生產(chǎn)水平。片狀載體培養(yǎng)系統(tǒng)為高滴度病毒疫苗生產(chǎn)提供了一個(gè)理想平臺(tái)。其高密度和高活力細(xì)胞灌注培養(yǎng)模式，不僅為病毒擴(kuò)增提供了相對(duì)穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，還延長(zhǎng)了病毒培養(yǎng)時(shí)間并增加了收獲量，在一定程度上減小了批間差異、縮小了生產(chǎn)空間和時(shí)間，在降低經(jīng)濟(jì)投入的同時(shí)保證了產(chǎn)品均一性［33］。而由于載體對(duì)細(xì)胞有一定的截留作用，在獲取細(xì)胞收獲液時(shí)，無(wú)需采用旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器或沉降柱等細(xì)胞截留裝置，使收獲液中的細(xì)胞、宿主蛋白和DNA 含量降低，相較于其他培養(yǎng)系統(tǒng)，更有利于下游純化，可降低整體疫苗生產(chǎn)的成本［36］。

另外，大規(guī)模生產(chǎn)疫苗需要大量種子細(xì)胞接種培養(yǎng)，若使用轉(zhuǎn)瓶或細(xì)胞工廠進(jìn)行種子鏈擴(kuò)增，增加了成本和污染風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，低傳代和高傳代細(xì)胞系間的基因表達(dá)和表型也存在差異［37］。而片狀載體培養(yǎng)則不存在該方面的困擾，非常有助于擴(kuò)大疫苗生產(chǎn)的需求，廣泛應(yīng)用于大規(guī)模病毒疫苗生產(chǎn)。

片狀載體目前已成功用于日本腦炎、流感、牛皰疹、裂谷熱、牛結(jié)節(jié)疹、脊髓灰質(zhì)炎、腎綜合癥出血熱、豬瘟、小反芻動(dòng)物麻疹、豬腹瀉、桿狀病毒及腺相關(guān)病毒的高滴度培養(yǎng)，為疫苗的規(guī)模化生產(chǎn)提供了更多的選擇［34-38］。并且，隨著新冠疫情的爆發(fā)，片狀載體技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于新冠疫苗的規(guī)?；a(chǎn)，如北京生物制品研究所有限責(zé)任公司的SARS-CoV-2全病毒滅活苗就是通過(guò)片狀載體制備的［39-40］。

3.2 在治療類生物制品生產(chǎn)中的應(yīng)用 片狀載體培養(yǎng)技術(shù)除了在病毒疫苗生產(chǎn)中具有優(yōu)勢(shì)外，在其他多種重組蛋白細(xì)胞因子、干擾素、激素、單克隆抗體等的規(guī)?；a(chǎn)中同樣具有優(yōu)勢(shì)，包括世界上首個(gè)批準(zhǔn)上市的基因治療產(chǎn)品“今又生（Gendicine）”就是利用Fibra-Cel disks 載體培養(yǎng)技術(shù)制備的［41］。如制備單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞天生對(duì)代謝廢物堆積比較敏感，獨(dú)特的灌注式片狀載體培養(yǎng)可滿足雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的特定需求［40］；而在慢病毒載體制備中，利用片狀載體培養(yǎng)技術(shù)不僅可提高PEI 轉(zhuǎn)染效率，降低PEI 毒性對(duì)細(xì)胞的持續(xù)影響，還可連續(xù)灌流收獲病毒液，提高病毒收獲液總量，在制備出高滴度慢病毒原液同時(shí)，降低了后期純化的壓力，從而提高了慢病毒的質(zhì)量和產(chǎn)量［33，42］。另外，有研究證明，結(jié)合Fibra-Cel disks 載體技術(shù)，組織纖維溶酶原激活蛋白等重組蛋白的表達(dá)活性相較于傳統(tǒng)微載體可提高十幾倍［32］。

3.3 在組織工程中的應(yīng)用 人類疾病的細(xì)胞治療和組織再生需大量細(xì)胞，片狀載體培養(yǎng)技術(shù)除了具有生產(chǎn)大量細(xì)胞的巨大潛力外，在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中也具有較廣泛的應(yīng)用前景，如在干細(xì)胞的應(yīng)用評(píng)估以及生物人工肝等各種體外器官模型的構(gòu)建中，提供比常規(guī)培養(yǎng)更穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境［17］。

大量功能細(xì)胞的生產(chǎn)一直是臨床應(yīng)用的一大挑戰(zhàn)，尤其是干細(xì)胞，如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）體外擴(kuò)增培養(yǎng)后，會(huì)表現(xiàn)為表型改變、細(xì)胞缺失及快速老化［43］。因此，干細(xì)胞穩(wěn)定的體外放大培養(yǎng)方法成為近年來(lái)再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的一個(gè)重要課題。而一般廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞研究的大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)主要是T 型燒瓶和旋轉(zhuǎn)燒瓶，雖然是一種可行和簡(jiǎn)單的培養(yǎng)方法，但在控制pH 值、氧壓力、代謝活性等，以及可擴(kuò)展性方面是有限的。

因此，片狀載體培養(yǎng)技術(shù)在干細(xì)胞的應(yīng)用評(píng)估中具有重要意義。有研究表明，在Fibra-Cel disks 片狀載體上，干細(xì)胞（如MSCs）可分泌廣泛的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），并能更好地保持其莖干性和增殖潛力的固有特性，可用于大規(guī)模的人造血干細(xì)胞擴(kuò)張［42］；而由纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）共軛的片狀載體支架（polyethylene terephthalate，PET），可實(shí)現(xiàn)人造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells，HCS）的體外擴(kuò)增［43］；TSAI等［44］也證明，F(xiàn)ibra-Cel disks載體在500 mL一次性生物反應(yīng)器中可擴(kuò)增產(chǎn)生（4.15 ±0.81）×108個(gè)／mL人類臍帶血來(lái)源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human mesenchymal stem cells，hMSCs）。

另外，VENTRE 等［45］利用片狀載體基質(zhì)PET 薄膜制成一種用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞高密度貼壁培養(yǎng)的可伸縮滾轉(zhuǎn)支架（roll support，RS），實(shí)現(xiàn)了小鼠胚胎干細(xì)胞（mouse embryonic stem cells，mESCs）的成功培養(yǎng)等。因此，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的飛速發(fā)展，片狀載體在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中將會(huì)展示出更高的應(yīng)用價(jià)值。

4 展望

如今市面上超過(guò)一半的治療性生物制品均是通過(guò)動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的，而以動(dòng)物細(xì)胞為基質(zhì)的疫苗生產(chǎn)更被認(rèn)定為現(xiàn)代疫苗技術(shù)的支柱。因此，快速實(shí)現(xiàn)各種動(dòng)物細(xì)胞的規(guī)?；囵B(yǎng)是現(xiàn)代生物制藥行業(yè)發(fā)展的重點(diǎn)。

以高分子材料聚酯纖維為基質(zhì)的片狀載體技術(shù)已成為大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞的關(guān)鍵技術(shù)手段之一，廣泛用于疫苗生產(chǎn)、細(xì)胞治療和組織工程等不同醫(yī)療應(yīng)用中［46-47］。但片狀載體仍存在一些有待解決的問(wèn)題，如不可重復(fù)利用；在培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，且細(xì)胞位于纖維微結(jié)構(gòu)深處，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣供應(yīng)不充分，細(xì)胞生長(zhǎng)不均勻；不易消化；由于載體自身對(duì)細(xì)胞的截留，使細(xì)胞收獲不完全等［35-36，48］。總之，片狀載體在生物制品生產(chǎn)應(yīng)用中具有巨大的優(yōu)越性，如何攻克其弊端和缺點(diǎn)，有待進(jìn)一步研究。

目前我國(guó)在片狀載體技術(shù)上的研發(fā)雖初有成效，但在原材料的精細(xì)化研究以及更高層次的規(guī)?；瘧?yīng)用研究上仍面臨巨大挑戰(zhàn)。這一挑戰(zhàn)不僅體現(xiàn)在優(yōu)化出具有良好生物相容性、促使細(xì)胞黏附生長(zhǎng)等的載體原材料本身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，還包括與其相匹配的生物反應(yīng)器的理想設(shè)計(jì)，在保證良好生物相容性的同時(shí)，提供與生理學(xué)相關(guān)的培養(yǎng)環(huán)境是片狀載體技術(shù)成功的關(guān)鍵。而這一難題，除了材料科學(xué)，還需生物工程、流體力學(xué)和分析化學(xué)等綜合學(xué)科的介入。本文從片狀載體的研究現(xiàn)狀、載體特性以及應(yīng)用方面進(jìn)行了詳細(xì)介紹，以便了解片狀載體目前的研究狀況及今后發(fā)展趨勢(shì)，為片狀載體技術(shù)的繼續(xù)研發(fā)以及生產(chǎn)上的應(yīng)用提供參考。