汪夢俊 綜述，申碩 審校

武漢生物制品研究所有限責任公司病毒性疫苗研究一室，湖北 武漢 430207

冠狀病毒（coronaviruses，CoV）是人類生命健康的一大威脅，由其引起的大流行已暴發(fā)過多起，以2019 年暴發(fā)的嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory symptom coronavirus 2，SARS-CoV-2）為例，因其具備極高的傳染性、致病性及變異性，對全球各國經(jīng)濟及公共衛(wèi)生安全造成了沉重的打擊，截至2023 年5 月10 日，全球由SARS-CoV-2 導致的死亡人數(shù)已近700萬人，與此同時，超過19種引起關切的變異株正在全球傳播，包括α、β、γ及ο等［1］。

目前，應對SARS-CoV-2 疫情最有效的方式是通過疫苗接種建立群體免疫，阻斷或減緩病毒在人群中的傳播，降低發(fā)病率、重癥率和病死率，進而結束病毒流行。但隨著SARS-CoV-2 變異株的不斷涌現(xiàn)而發(fā)生免疫逃逸，現(xiàn)有上市疫苗的保護效力正面臨巨大挑戰(zhàn)。新的、能夠針對變異株的疫苗急需被研發(fā)。但現(xiàn)有的疫苗研發(fā)策略均存在一些問題。以滅活疫苗為例，盡管滅活疫苗具有安全、有效、免疫原性強等優(yōu)點，但疫苗的生產(chǎn)條件要求較高，且合適候選疫苗株的獲取較困難［2］。

針對目前SARS-CoV-2 疫苗研發(fā)過程中面臨的一些問題，反向遺傳學系統(tǒng)是一個極具潛力的工具，與經(jīng)典遺傳學相比，反向遺傳學系統(tǒng)能夠通過基因組修飾產(chǎn)生變異及重組病毒，快速、高效、定向地研究CoV 基因組不同區(qū)域或位點的生物學功能及作用機制，獲得特定性狀的重組毒株。了解病毒的致病機理及入侵機制，可以研究特定的疫苗接種方式，從而更高效地發(fā)揮疫苗的保護效力。在對SARS-CoV-2致病機理的研究中，實驗人員利用反向遺傳學系統(tǒng)將SARS-CoV-2的開放閱讀框（open reading frame，ORF）7 替換為GFP 及GFP-nLuc 報告基因，通過重組病毒感染，證明了鼻腔對于SARS-CoV-2 的易感性，并推測鼻腔是介導病毒感染肺部的初始部位［3］，意味著鼻內(nèi)給藥可能是一種預防SARS-CoV-2 感染較為有效的方式。在另一項對貓傳染性腹膜炎病毒（feline infectious peritonitis virus，F(xiàn)IPV）的研究中，實驗人員通過S 蛋白（spike protein）的替換方式構建1 個基于血清型Ⅰ型FECV的反向遺傳學系統(tǒng)，拯救得到了能夠導致貓產(chǎn)生持續(xù)性感染的重組病毒［4］，為FIPV 基因型轉換的研究提供了一個強有力的工具。本文現(xiàn)就目前應用于CoV 研究中的幾種反向遺傳學技術及其可能在CoV疫苗研發(fā)中的應用作一綜述。

1 CoV中常用的反向遺傳學系統(tǒng)

CoV是一種有包膜的正義RNA病毒，屬于網(wǎng)巢病毒目、CoV科病毒，具有已知RNA 病毒中最大的基因組。由于正鏈RNA 病毒基因組可直接啟動病毒蛋白翻譯以及病毒負鏈RNA 的轉錄，啟動病毒生命周期［5］。當將包含病毒基因組全長的cDNA 修飾，制備正鏈RNA 轉染至細胞后，即可獲得完整的、具有感染性的病毒顆粒，因此，CoV 是反向遺傳學研究的重要平臺。利用反向遺傳學系統(tǒng)，能夠對CoV基因組進行特定的修改，從而更好地研究病毒不同基因的生物學功能，獲得各種帶有特定性狀的重組毒株，為疫苗的研發(fā)提供更多安全、高效的途徑［6］。目前，應用于CoV基因組的反向遺傳學技術主要有：靶向RNA重組、體外連接、細菌人工染色體系統(tǒng)（bacterial artificial chromosome，BAC）、痘病毒載體以及基于酵母人工染色體（yeast artificial chromosome，YAC）的轉化相關重組（transformation-associated recombination，TAR）技術等。以下主要對這些常用技術路線進行簡單介紹。

1.1 基于病毒RNA的反向遺傳學系統(tǒng) 靶向RNA重組是第一個應用于CoV 研究的反向遺傳學系統(tǒng)［7］，其主要利用在RNA 病毒復制過程中，RNA 聚合酶表現(xiàn)出的一種模板轉移機制［8］，能夠在沒有病毒感染性全長cDNA 的情況下，對CoV ORF1ab 區(qū)域以外的基因進行操作。主要包括2 個步驟：首先，構建1 個帶有篩選標記的重組嵌合病毒；其次，構建1 條帶有篩選基因的野生型對應片段及病毒基因組中需要操作區(qū)域的片段的RNA，將其轉染至感染有嵌合病毒的細胞中，通過負篩選的方式得到引入目標突變的重組病毒。該方案首先應用于小鼠肝炎病毒（mouse hepatitis virus，MHV）的反向遺傳學改造，后又被應用于豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、FIPV等其他CoV的全長cDNA構建［9-10］。但該方案在應用時，需保留病毒本身的復制能力，因此并不能對病毒復制酶相關基因，即ORF1ab進行操作，因此，極大地限制了其在病毒復制、毒性等研究方面的應用［11］。有研究人員利用基于RNA 重組的反向遺傳學系統(tǒng)，將FIPV 的S 蛋白基因替換至MHV相應部位，使構建得到的重組CoV 在新的宿主細胞增殖，為減毒活疫苗及滅活疫苗的毒種研發(fā)提供了參考［12］。

1.2 基于病毒全長cDNA的反向遺傳學系統(tǒng)

1.2.1 基于體外線性化的反向遺傳學系統(tǒng) 該方案最早由ALMAZAN 等［13］在對黃熱病病毒的研究中提出，主要通過體外連接病毒基因組cDNA片段來生成全長的病毒cDNA，再以其作為模板，轉錄合成病毒基因組RNA。在應用時，通常會先分析CoV 基因組上特異的限制性內(nèi)切酶的酶切位點，在酶切位點附近設計引物，獲得1 組覆蓋CoV 基因組全長的基因片段。同時，在5'端基因片段前端，添加連接T7 RNA聚合酶啟動子的酶切位點，3'端添加引入poly-A 尾巴的酶切位點。構建片段時，通常會先將其克隆至不同質粒中，以方便大量擴增目的片段。得到目的片段后，利用限制性核酸內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生特異性末端，通過酶連獲得1 條包含CoV 全部基因組以及T7啟動子、poly-A 尾巴的全長cDNA［14-15］，以全長cDNA為模板，轉錄出病毒基因組RNA 后轉染特定宿主細胞，即可拯救獲得目標毒株，后續(xù)重組病毒的構建僅需對相應基因片段的特定位點進行修改即可。另外，一項關于MHV 的研究表明，若將表達待拯救毒株N蛋白的mRNA與體外轉錄出的全長病毒RNA一同轉染細胞，能夠顯著增強病毒RNA 基因組的復制及轉錄能力，從而有利于病毒的拯救［16］。近年來，隨著環(huán)狀聚合酶延伸反應（circular polymerase extension reaction，CPER）技術的發(fā)展，可將帶有CMV啟動子序列片段與包含CoV 基因組的1 組片段在體外合成環(huán)狀cDNA，更快速、高效、簡便地實現(xiàn)CoV的拯救［17］。

該方案不需依賴細菌系統(tǒng)構建病毒全長cDNA，與依賴細菌系統(tǒng)的cDNA構建方法相比，可有效解決病毒全長cDNA 在細菌中的不穩(wěn)定性和毒性問題。同時，病毒cDNA 片段可在質粒上進行操作和制備，一定程度上降低了工作量及工作難度。目前，已在引起SARS-CoV、中東呼吸綜合征的冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）、PEDV 和SARS-CoV-2 等冠狀病毒的感染性cDNA 的構建中得到應用［18-20］。以SARS-CoV-2為例，在SARS-CoV-2 暴發(fā)的第一時間，WAND 等［21］利用體外連接的策略快速獲得了病毒基因組全長cDNA，經(jīng)病毒拯救后，獲得與原始親本株有相似感染及增殖特性的拯救毒株，在通過插入nLuc以及mNeonGreen等報告基因后，作為藥物篩選及疫苗評價平臺，極大地促進了SARS-CoV-2抗病毒藥物以及疫苗的研發(fā)。

1.2.2 基于BAC 的反向遺傳學系統(tǒng) 與基于體外線性化的反向遺傳學技術相比，基于BAC 的反向遺傳學技術是將獲得的包含CoV 基因組全長的DNA 片段連接至DNA 載體上。由于CoV 基因組較大，使得病毒全長cDNA在一般質粒中難以穩(wěn)定存在，但PENZES 等［22］于2000 年在構建TGEV 全長cDNA 的過程中即克服了這一問題。同時，通過添加大腸埃希菌F因子（fertility-factor），可嚴格控制BAC 在大腸埃希菌中的拷貝數(shù)，使得宿主細胞增殖期間，每個細胞僅保留1 ～2 個人工染色體的拷貝，極大地保證了病毒基因組全長cDNA 的穩(wěn)定性及其序列相關的宿主細胞毒性。其構建策略主要如下：首先，通過RT-PCR 或化學合成獲得幾段帶有同源序列的DNA 片段。在病毒基因組5'端的DNA 片段通過PCR 連接添加與啟動子以及與載體質粒連接所需的同源臂序列，3'端DNA 片段包含poly-A 尾巴以及與ABC 連接所需的同源臂序列。然后，將所有DNA 片段按特定順序連接至選定的ABC 上。最后，在T7 或CMV 啟動子的作用下，通過體外轉錄后轉染（T7 啟動子）或直接轉染（CMV啟動子）細胞即可獲得相應的重組病毒。

該方案的主要優(yōu)勢在于能夠穩(wěn)定插入較大DNA片段，同時，通過F 因子、獨特克隆位點、合適啟動子、抗性篩選標記等的修飾，可極大地優(yōu)化病毒全長cDNA 構建、修改、篩選以及病毒拯救的流程。構建至相應的質粒載體上后，可大量獲得包含病毒全長cDNA 的載體，且后續(xù)基因修飾均可在質粒上進行，可加快重組病毒全長cDNA 的構建過程。利用該方案，研究人員將PEDV 的S 蛋白進行異源替代，產(chǎn)生的重組病毒具備與原PEDV 不同的中和特性，提示了構建異源S 蛋白的重組腺病毒作為減毒候選疫苗株的可能性［23］。

1.2.3 基于痘病毒載體的反向遺傳學系統(tǒng) 基于痘病毒載體的反向遺傳學技術的主要特點在于選擇了痘病毒基因組作為承載病毒基因組全長cDNA 的載體。痘病毒載體是一種反向遺傳學研究的通用載體，在不影響病毒復制的前提下，能夠插入大片段的外源基因（26 000 ～31 000 bp），同時，牛痘病毒基因組穩(wěn)定，具有傳染性，可在組織培養(yǎng)中高效復制，容易得到滴度較高的毒株［13］。該方案在應用時，首先要對痘病毒的基因組序列進行分析，尋找可供外源cDNA 插入的限制性酶切位點。當將包含CoV 全長基因組的cDNA片段插入至痘病毒基因組中后，線性化轉染BHK 細胞中，即可拯救出相應的病毒顆粒。該方案首先應用于HCoV-229E 全長cDNA 的構建，隨后又在雞傳染性支氣管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）、MHV、SARS-CoV 和FIPV 等CoV 中得到應用［24］。以痘病毒載體作為CoV 的反向遺傳學操作系統(tǒng)，一方面，可研究CoV 的遺傳表征，為CoV 減毒及滅活疫苗的研發(fā)奠定理論基礎；另一方面，去除CoV 必需基因后，構建的重組痘病毒可作為候選的病毒載體疫苗，具有極廣泛的應用前景［25］。

1.2.4 基于多質粒載體的反向遺傳學系統(tǒng) 基于多質粒載體的反向遺傳學技術主要解決了CoV 反向遺傳學研究中，由于CoV 龐大的基因組導致全長cDNA難以獲得以及體外轉錄相對困難的問題。其構建步驟主要如下：首先，根據(jù)CoV 基因組特征，將其劃分為3 或多個主要片段，通過逆轉錄或體外合成等方式獲得相應的DNA 片段；其次，將得到的片段分別連接至不同質粒上；最后，將包含CoV 基因組不同部分的全部質粒共轉染至293T 細胞中，即可獲得相應的病毒顆粒［26］。

該方案的主要優(yōu)點在于質粒的構建相對簡單，可快速獲得目標重組病毒。且由于病毒基因組cDNA存在于不同質粒上，操作也相對簡單。但由于無法產(chǎn)生包含病毒基因組全長的RNA，只能形成病毒顆?？諝ぃ瑹o法進行連續(xù)傳代。該方案目前已在SARSCoV-2 中成功得到應用［27］。在對PEDV 的細胞嗜性的研究中，研究人員通過多質粒載體的反向遺傳學技術，發(fā)現(xiàn)了其S 蛋白上3 個與PEDV 的Vero 細胞嗜性相關的位點，提示PEDV 的細胞嗜性可能與其S2亞基的剪切位點或RBD 的結構有關，為CoV Vero 細胞適應的疫苗候選株提供了理論指導［26］。

1.2.5 基于YAC 的TAR 克隆的反向遺傳學系統(tǒng) 病毒序列的大小限制以及不穩(wěn)定性是將CoV 基因組全長cDNA克隆至可復制載體中的主要障礙，盡管基于BAC 的策略一定程度上克服了這些問題，但部分病毒序列對于細菌的細胞毒性依然限制了部分CoV 基因組全長cDNA的構建。與細菌相比，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）對于病毒序列的細胞毒性敏感度更低［28］。此外，通過TAR 克隆技術，能夠簡單、快捷地進行大DNA 片段的操作［29］。因此，YAC 已經(jīng)成為CoV 反向遺傳學研究中較為常用的手段。其構建流程與基于BAC 的反向遺傳學系統(tǒng)相似。首先，將待構建的CoV 基因組劃分為幾個彼此帶有重疊區(qū)域的片段，并以病毒基因組為模板，通過反轉錄PCR 獲得相應的cDNA 片段。將帶有同源末端的1組cDNA片段及線性化的載體片段導入釀酒酵母后，通過TAR克隆即可制備包含病毒基因組全長cDNA 的人工染色體［28］。

相較于以上提到的幾種反向遺傳學系統(tǒng)，基于YAC系統(tǒng)的反向遺傳學技術主要優(yōu)勢在于以下2點：首先，YAC 基因載量大，能夠攜帶高達300 kb的插入片段；其次，基于酵母的TAR克隆在組裝組分片段方面具有更高的效率。全長克隆可在酵母系統(tǒng)中擴增，為進一步研究提供了充足的材料，節(jié)省了制備體外連接片段的大量時間，并且與基于體外連接的策略相比，能夠進行更多重組片段間的重組［30］。在大流行初期，ISENI 等［31］就基于YAC 的反向遺傳學平臺，在1 個月內(nèi)制備了SARS-CoV-2 的毒株，同時構建了帶有標記基因GFP的SARS-CoV-2-GFP和synSARSCoV-2-GFP，極大地推動了SARS-CoV-2 疫苗的研究進展。

2 反向遺傳學技術在疫苗研發(fā)領域的應用

反向遺傳學能通過對CoV 基因組的定向改變，來研究相關基因的功能及其對于病毒表型、性狀的影響。通過反向遺傳學操作，可快速獲得大量的病毒資源，極大地推動CoV 重要毒力位點的發(fā)現(xiàn)及對病毒作用機制的研究，從而獲得理想的減毒株來研制疫苗。與此同時，通過給病毒添加GFP 等可視化標記，還可實現(xiàn)病毒感染的實時監(jiān)控，從而優(yōu)化病毒的細胞及動物感染模型，為相關疫苗的快速測評提供一個更為直觀、精準的途徑。

2.1 減毒位點及Vero 細胞適應性位點的發(fā)現(xiàn) 首先，在對CoV 復制及致病機理有一定了解的基礎上，能夠對CoV 基因組復制或致病關鍵位點進行改造，在不影響其免疫原性的基礎上，得到相應的減毒毒株，解決疫苗生產(chǎn)過程中的安全性問題。同時，針對新出現(xiàn)的CoV 突變株，可通過相應突變位點的改造，快速得到突變株的減毒毒株，應用于疫苗生產(chǎn)。其次，在減毒株骨架基礎上，進一步獲得人用疫苗細胞基質適應性更好、滴度和產(chǎn)量更高骨架，引入新變異株的S 蛋白或與免疫逃逸相關的中和位點，克服新變異株適應性弱、滴度和抗原產(chǎn)量低的困難。進一步，利用反向遺傳學平臺，能夠對CoV 基因功能、蛋白結構、免疫逃逸及致病機理等進行更深入研究，預測未來可能出現(xiàn)的CoV 大流行，利用反向遺傳學手段，提前獲得相應的減毒疫苗株，為CoV 的大流行做好準備。

2.1.1 非結構蛋白（non-structure protein，NSP）NSP1是CoV（α 及β-CoV）感染細胞后編碼的第1 個蛋白，能夠抑制感染細胞中干擾素表達，進而抑制機體對病毒的免疫應答。因此，NSP1 是研究CoV 感染、復制的重要位點。反向遺傳學研究已經(jīng)證明，當敲除SARS-CoV-2 NSP1 的141 ～143 位氨基酸KSF 后，病毒毒力就會減弱。同時，感染細胞的固有免疫應答也會恢復［32］。

NSP2 同樣被報道與病毒復制相關。當將MHV和SARS-CoV 中NSP2 敲除后，病毒的生長和復制將會減弱。但不同CoV NSP2 同宿主細胞的作用機制有所差異［33］。

NSP3是CoV復制／轉錄復合物（replication／transcription complex，RTC）的重要組成成分，同時也是CoV中最大的多功能域蛋白。其中，木瓜樣蛋白酶結構域（papain-like protease，PLpro）、泛素樣結構域（ubiquitin-like domains）和ADP 核酸磷酸酶結構域（ADPribose-phosphatase domains）在不同CoV 中均高度保守［34］。反向遺傳學研究已經(jīng)證明，當NSP3的環(huán)ADP酸糖蛋白水解酶活性降低后，SARS-CoV 在小鼠中的致病性將會減弱，并顯著增強小鼠的固有免疫反應。同時，MHV NSP3的V787S突變也會導致病毒毒力減弱，并增強宿主的免疫保護。PEDV 和TGEV NSP3的590 ～1 215位氨基酸殘基也被證明與病毒免疫逃逸相關。NSP4 是一種與雙膜囊泡（double-membrane vesicles，DMV）形成有關的跨膜蛋白，當研究人員將其C-末端的結構域去除后，病毒的復制將受到影響［35］。

NSP5也稱為3CLpro（3C-like protease）或Mpro（motrypsin protease），是CoV 復制過程中1 個至關重要的酶，負責pp1a／ab上11個位點的酶切，由此形成12個成熟的NSPs。反向遺傳學研究表明，MHV NSP5 的T26I 和D65G 突變會使得病毒對3CL-like 蛋白酶抑制劑產(chǎn)生抗性［36］。

CoV 的NSP6 與宿主細胞自噬相關，具有多個跨膜結構域。當敲除SARS-CoV 基因組中的NSP6 后，病毒無法形成復制所必需的DMV。研究人員利用反向遺傳學驗證了MHVNSP7、NSP8 的缺失均可使得病毒無法復制，NSP9 和NSP10 缺失也會對病毒的復制產(chǎn)生影響［37］。

NSP12和NSP13是CoV RTC最核心部分，分別起到RdRp（RNA-dependent RNA polymerase）和解旋酶的作用，對于病毒的復制不可或缺。CoV NSP14 具有5'→3'端的核糖核酸酶（ExoN）和N7 甲基轉移酶（N7 MTase）活性。前者與RAN聚合酶的保真性有關，被認為是CoV保持其龐大基因組的關鍵［38-39］。

CoV 編碼的NSP15 具有核酸內(nèi)切酶活性，在病毒復制過程中發(fā)揮重要作用。被認為是CoV 減毒株制備的1 個關鍵位點。當MHV NSP15 發(fā)生H262A突變后，NSP15 將會失活，其在小鼠模型上的致病性也大大降低，并能刺激機體產(chǎn)生免疫保護反應。在PEDV中，NSP15同樣也是1個關鍵的毒力因子［40］。

NSP16具有2'-O-甲基轉移酶活性（2'-O-MTase），在CoV 中高度保守，是1 個值得注意的減毒靶點［41］。反向遺傳學研究證明，MHV 的D129A、SARS-CoV 的D130A、MERS-CoV的D130A和PEDV（KDKEK-AAAA）能夠使得NSP16 失活降低病毒毒力，并刺激機體產(chǎn)生更強的Ⅰ型和Ⅲ型干擾素反應。同時，NSP16 的突變體還能夠與NSP1、NSP14 或S 蛋白中的另一個突變位點協(xié)同作用，產(chǎn)生更穩(wěn)定的減毒株［42］。

2.1.2 主要結構蛋白 CoV 的S 蛋白是位于病毒顆粒表面的Ⅰ類融合蛋白，由S1 和S2 2 個亞基構成，是亞單位疫苗開發(fā)的核心分子。有研究人員構建了2株相互交換了S基因的嵌合病毒，發(fā)現(xiàn)其中1株毒力較高，另一株無毒，證明了S基因是CoV 毒力所必需的，但不是與CoV 相關的唯一因素［43］。而另一項反向遺傳學研究以同樣的方式研究了S基因在不同代毒株PEDV 發(fā)病機制中的作用，結果表明，除S基因外，其他基因同樣會對病毒毒力造成影響［44］。而對SARS-CoV、TGEV、IBV和PEDV等CoV的研究表明，病毒顆粒在內(nèi)質網(wǎng)-高爾基體中間隔室上的聚集與S 蛋白上2 個保守基序（YxxΦ 和KxHxx／KKxx）有關，研究人員將PEDV 中這2 個保守基序缺失或突變后發(fā)現(xiàn)，YxxΦ 基序（YEVF 或YEAF）觸發(fā)S 蛋白的內(nèi)吞作用，KVHVQ 基序參與了病毒復制過程中，S 蛋白與宿主細胞的內(nèi)質網(wǎng)和高爾基體之間的相互作用；這2個基序的缺失顯著增強了Vero 細胞中合胞體的形成，并降低了毒株的毒力［45］。

CoV 的E 蛋白是CoV 主要結構蛋白中最小的蛋白質，參與了CoV 的組裝、出芽和致病等過程。E 蛋白的缺失會使得病毒的復制效率和毒力顯著降低，但仍能形成具有感染性的病毒顆粒。而對MERSCoV 和TGEV 的反向遺傳學研究表明，E基因缺失后，在正常細胞中不能拯救病毒的全長cDNA，但能夠在E蛋白表達的細胞間傳播［46-48］。

M 蛋白也是病毒顆粒組裝所需的主要結構蛋白，可與E蛋白和S蛋白共同形成完整的病毒樣顆粒（virus-like particle，VLP）。SARS-CoV M 蛋白的兩端多肽均具有免疫原性［26］，但其所引起的免疫保護效力還有待進一步探討。有研究表明，CoV 的M 蛋白也能夠抑制宿主細胞干擾素的產(chǎn)生。而MERS-CoV的M 蛋白能夠通過抑制RF3的BK1依賴的磷酸化來抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生［49］。

CoV 的N 蛋白在病毒的生命周期中發(fā)揮著多種功能，包括調(diào)節(jié)病毒RNA合成、核衣殼形成以及病毒組裝等。N 蛋白的表達對于從感染性cDNA 中回收病毒是必要的。N 蛋白能夠誘導機體產(chǎn)生細胞免疫反應，當研究人員利用重組病毒MVA-MERS-N 免疫小鼠后，小鼠能夠產(chǎn)生更強的T 細胞免疫，保護小鼠免受MHV 致命感染［50］。而SARS-CoV N 蛋白的1 ～422 位氨基酸殘基片段和110 ～422 位氨基酸殘基片段能夠在小鼠中產(chǎn)生特異性抗原，并與SARS康復患者血清發(fā)生反應［51］。SARS-CoV 的N 蛋白還是一種干擾素拮抗劑，通過抑制IRF-3和NF-κB抑制干擾素合成，干擾TRIM25介導的RIG-I泛素化或減弱PTAC介導的RIG-I／MDA5激活［24］。

2.1.3 輔助蛋白 CoV 的輔助蛋白在病毒致病過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，從MERS-CoV 中刪除ORF3 和ORF5、從SARS-CoV 中刪除ORF8 均不會影響病毒復制，但會減弱病毒毒力［52-53］。由于CoV 的輔助蛋白不會影響病毒復制，也常作為外源基因插入的靶點。值得注意的是，一些輔助蛋白被認為具有離子通道活性，并與宿主細胞的固有免疫相關，可能能夠幫助病毒逃避宿主細胞的免疫監(jiān)視，并增強病毒毒力［54-55］。因此，輔助蛋白缺陷的CoV 被認為是CoV減毒株制備的重要策略。

2.2 其他 反向遺傳學技術還能夠應用于建立病毒感染模型以及疫苗評價。有研究人員利用反向遺傳學技術，將PEDV 基因組中的ORF3替換為紅色熒光素蛋白（red fluorescent protein，RFP）基因，獲得1 株能夠在體內(nèi)外有效復制，并介導仔豬發(fā)病的重組毒株icPEDV-ΔORF3-RFP，為對該病毒發(fā)病機制、嗜性、中和抗體以及疫苗保護評估的研究提供了一個安全、高效的平臺［56］。

3 小結與展望

CoV 已經(jīng)多次跨越物種屏障，其中一些獲得了人際間傳播的能力，其中對人類生命健康具有嚴重威脅的主要包括SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2。此外，已知其他4 種CoV 會感染人類導致輕微疾病，包括人CoV-229E（HCoV-229E）、人CoV-NL63（HCoVNL63）、人CoV-OC43（HCoV-OC43）、人CoV-HKU1（HCoV-HKU1）。蝙蝠通常被認為是一系列CoV 的天然宿主［56］。一些蝙蝠CoV 也有可能出現(xiàn)在人類群體中，如馬蹄蝠中的SARS-like病毒SHC014-CoV［57-58］。反向遺傳學技術能夠實現(xiàn)對CoV 基因組的直接操作，通過相關位點突變、敲除或重排等，均有可能獲得理想的、用于CoV 疫苗生產(chǎn)的疫苗株，與此同時，利用反向遺傳學技術，還能夠對CoV-宿主相互作用、宿主免疫反應和病原體免疫逃避策略進行更深入的研究。如探究CoV 感染期間受影響的宿主細胞途徑，確定能夠抑制宿主先天免疫的CoV 蛋白和特定的信號途徑等。將反向遺傳學與基因組學和結構生物學相結合，有助于描述出目前的CoV 種群，預測可能出現(xiàn)的人畜共患病CoV，為未來的CoV暴發(fā)做好準備，促進針對CoV感染的防治策略的發(fā)展。