羅 弦，劉 竹，李陽(yáng)鵬，胡 劍，歐賢紅，譚曉秋,，陳唐葶

1.西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所，醫(yī)學(xué)電生理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川省醫(yī)學(xué)電生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（瀘州646000）；2.西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（瀘州 646000）

隨著全球人口老齡化的加劇，老齡化已成為心血管疾病、癌癥、糖尿病等人類(lèi)疾病最主要的危險(xiǎn)因素之一。目前我國(guó)心血管疾病的發(fā)病率仍持續(xù)增高[1-2]，心血管疾病死亡率占城鄉(xiāng)居民總死亡率的首位[3]，也是老年人死亡的主要原因。心律失常是臨床常見(jiàn)的心血管疾病，可單發(fā)或與其它心血管疾病伴發(fā)，并隨年齡增加而發(fā)病率增加。有報(bào)道顯示65 歲以上老年人發(fā)生心律失常的概率約為30.62%，遠(yuǎn)高于一般成年人[4-5]，而惡性心律失常也是心血管疾病致死原因之一。本研究旨在通過(guò)比較青年和老年小鼠在程序性電刺激下誘發(fā)的室性心律失常（ventricular tachycardia，VT）發(fā)生率，利用光標(biāo)測(cè)技術(shù)（optical mapping）對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探究，為臨床診斷和治療老齡化相關(guān)性心律失常提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6J青年小鼠（8～12周齡）和老年小鼠（16+月齡），SPF級(jí)，各44只，其中36只用于電刺激誘發(fā)心律失常實(shí)驗(yàn)，5 只用于光標(biāo)測(cè)實(shí)驗(yàn)，3 只用于組織形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)小鼠來(lái)自西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK（川）2018-17]，本研究通過(guò)西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)：20210927-011），動(dòng)物使用許可證[SCXK（川）2018-065]。

1.2 心電圖及程序性電刺激

將小鼠放入小動(dòng)物麻醉機(jī)（R500，瑞沃德），異氟烷吸入麻醉后，固定在小動(dòng)物固定板上（仰臥位），經(jīng)口行氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)（潮氣量1.2 mL/min，呼吸比5：4）。在小鼠四肢接好電極并記錄心電圖（420 s生理記錄儀，成都泰盟）。穩(wěn)定記錄10 min 基礎(chǔ)心電圖后，進(jìn)行開(kāi)胸手術(shù)，暴露心臟，撕開(kāi)心包膜，并安裝好刺激電極，調(diào)整刺激器及程控刺激方案（刺激強(qiáng)度5 V，刺激間隔30 ms），給予心室快速起搏，記錄30 min后腹腔注射異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO）（1 mmol/kg）[6-7]。實(shí)驗(yàn)分組：青年小鼠直接電刺激為Youth 組，記錄完畢再給予ISO處理后重復(fù)電刺激方案，為Youth+ISO組；老年小鼠直接電刺激為Old組，記錄完畢后再給予ISO處理后重復(fù)電刺激方案，為Old+ISO組。

1.3 超聲檢測(cè)小鼠心臟

使用3%～5%異氟烷氣體誘導(dǎo)麻醉，0.5%～1%異氟烷維持麻醉，保持心率400～450 次/min。胸部備皮后固定在超聲固定板上（仰臥位），超聲探頭置于胸部上方，調(diào)整方位，觀察小鼠心臟短軸切面（parasternal short-axis section，PSAX），測(cè)量并且記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。分析射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）、縮短分?jǐn)?shù)（fractional shortening，F(xiàn)S）、左室舒張末期前壁厚度（end-diastolic left ventricular anterior wall thickness，LVAWd）、左室收縮末期前壁厚度（end-systolic left ventricular anterior wall thickness，LVAWs）、左室舒張期末內(nèi)徑（enddiastolic left ventricular diameter，LVIDd）、左室收縮末期內(nèi)徑（end-systolic left ventricular diameter，LVIDs）、左室舒張末期后壁厚度（end-diastolic left ventricular posterior wall thickness，LVPWd）、左室收縮末期后壁厚度（end-systolic left ventricular posterior wall thickness，LVPWs）。

1.4 小鼠心臟、體重及脛骨長(zhǎng)度測(cè)量

小鼠稱(chēng)重后，頸椎脫臼處死，取下心臟，4%多聚甲醛固定，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，另外部分心臟在PBS液體中洗凈后，濾紙吸干水分，稱(chēng)重，最后使用游標(biāo)卡尺測(cè)量脛骨長(zhǎng)度。

1.5 小鼠心臟HE和Masson染色

將固定好的心臟組織做石蠟包埋，4 μm 切片，常規(guī)HE 和Masson 染色，使用CaseViewer 及Image J 進(jìn)行圖像采集和分析。

1.6 小鼠心臟光標(biāo)測(cè)記錄

小鼠頸椎脫臼處死后，取出心臟，將主動(dòng)脈固定在Langendorff 灌流系統(tǒng)。生理鹽溶液（PSS 液）心臟灌流10 min 排出余血，停搏劑Blebbistatin（10 μM）灌流10 min，心臟停止舒縮活動(dòng)。取電壓敏感染料RH237（1 μM）和Ca2+敏感染料Rhod-2AM（1 μg/mL）循環(huán)灌注染色10 min 后，繼續(xù)循環(huán)灌注停搏劑。在心臟心尖部給予程控刺激（刺激強(qiáng)度5 V，波寬2 ms，頻率10 Hz），MacroLED燈（530 nm）提供激發(fā)光，630 nm長(zhǎng)通濾波器收集膜電壓（voltage of membrane，Vm）熒光，585/40 nm帶通濾波器收集Ca2+熒光，同時(shí)采集2 種熒光信號(hào)值。實(shí)驗(yàn)結(jié)束用ElectroMap軟件分析結(jié)果[8-9]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)軟件為GraphPad Prism software version 8.0 及IBM SPSS Statistics 22.0。

2 結(jié)果

2.1 青年和老年小鼠心電圖及心律失常發(fā)生率比較

老年小鼠和青年小鼠相比，基礎(chǔ)心電圖P 波持續(xù)時(shí)間以及P-R、QRS和QT間期相似（圖1A、1B），但老年小鼠表現(xiàn)出更低的心率，表現(xiàn)為R-R 間期延長(zhǎng)（t=4.202，P ＜0.001，圖1B）。程序性電刺激誘發(fā)小鼠室性快速性心律失常（圖1C，室性心動(dòng)過(guò)速和心室顫動(dòng)），兩組小鼠均可誘發(fā)出室性心律失常。給予腹腔注射ISO 5 min之后，老年小鼠室性心律失常的誘發(fā)率顯著高于青年小鼠（P ＜0.01，表1）。由此可見(jiàn)，在急性給予ISO所致的β 腎上腺素能應(yīng)激條件下，老年小鼠的心律失常易感性增加。

表1 青年和老年小鼠VT發(fā)生率比較Table 1 Comparison of VT occurrence rate between young and aged mice

圖1 青年和老年小鼠心電活動(dòng)差異Figure 1 Electrocardiogram of young and old mice

2.2 青年和老年小鼠心臟收縮和舒張功能比較

青年小鼠和老年小鼠隨機(jī)各選取10 只做超聲心動(dòng)圖檢測(cè)心功能（圖2A、2B）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與青年小鼠相比，老年小鼠的EF 和FS 均顯著降低。老年小鼠的LVIDd，LVIDs，LVPWd 與青年小鼠相比顯著增厚（表2）。

表2 青年小鼠和老年小鼠心臟收縮和舒張功能超聲心動(dòng)參數(shù)比較Table 2 Comparison of cardiac function between young and old mice

圖2 青年和老年小鼠組織學(xué)之間的差異Figure 2 Histology differences between young and aged mice

2.3 青年和老年小鼠組織學(xué)比較

心臟切片HE 染色可以看出，老年小鼠較青年小鼠心臟體積增大，左心室壁增厚（圖2C、2D、2E）；與青年小鼠相比，老年小鼠心臟質(zhì)量增加，其心重脛骨長(zhǎng)度比顯著升高（t=6.749，P ＜0.001，圖2G）；心肌細(xì)胞橫截面積增大（t=21.39，P ＜0.001，圖2H）。Masson染色提示老年小鼠心肌膠原纖維化較青年小鼠嚴(yán)重，膠原沉積百分比高于青年小鼠（t=9.929，P ＜0.001，圖2F、2I）。

2.4 青年和老年小鼠心臟動(dòng)作電位時(shí)程和鈣瞬變時(shí)程比較

利用光標(biāo)測(cè)技術(shù)，在離體組織水平觀察老齡對(duì)心臟膜電位和鈣瞬變的影響（圖3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，老齡和ISO處理并無(wú)交互作用，但老齡和ISO處理均可以影響動(dòng)作電位時(shí)程（action potential duration，APD）APD80（F=24.32，P ＜0.001 和F=16.28，P ＜0.001）、鈣瞬變時(shí)程（calcium transient duration，CaTD）CaTD50（F=4.531，P ＜0.05 和F=26.36，P ＜0.001）和擬合鈣瞬變時(shí)程曲線的10%～100%的時(shí)間常數(shù)τ（τ10-100）值（F=18.61，P ＜0.001 和F=13.97，P ＜0.01）。進(jìn)一步兩兩比較分析發(fā)現(xiàn)，在10 Hz基礎(chǔ)刺激下，與青年小鼠相比，老年小鼠的APD80 和CaTD50（q=5.722，P ＜0.01 和q=4.270，P ＜0.05）延長(zhǎng)，老年小鼠與青年小鼠相比，τ10-100顯著延長(zhǎng)（q=4.900，P ＜0.05），提示老齡可能影響胞內(nèi)鈣的回收過(guò)程。而給予ISO 刺激后老年小鼠APD80（q=4.825，P ＜0.05）、CaTD50（q=6.096，P ＜0.01）、CaTD80（q=9.479，P ＜0.001）和τ10-100（q=4.324，P ＜0.05）較給藥前均縮短，但I(xiàn)SO刺激下的老年小鼠與ISO 刺激下的青年小鼠相比，APD80 明顯延長(zhǎng)（q=4.140，P ＜0.05），而CaTD50、CaTD80和τ10-100差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步通過(guò)電刺激誘發(fā)心律失常，發(fā)現(xiàn)老年小鼠在電刺激后易發(fā)心率失常，并形成典型的折返和轉(zhuǎn)子波。如圖3G、3I 和3J 所示，在小鼠心臟選取a、b、c位置，計(jì)算從a點(diǎn)到b點(diǎn)再到c點(diǎn)Vm傳播時(shí)間和方向。小鼠心臟Vm傳導(dǎo)方向由起搏點(diǎn)傳至遠(yuǎn)端，即由心尖傳至心底部；而老年小鼠發(fā)生心律失常時(shí)其Vm的傳導(dǎo)出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)、延遲、折返和異位起搏，Vm異質(zhì)性增加。這可能是老年小鼠易發(fā)心律失常的原因之一。

3 討論

心血管疾病發(fā)病率和病死率都隨著年齡的增長(zhǎng)而逐漸增加，報(bào)道顯示70 歲以上老年人比60～69 歲老年人心律失常發(fā)生率明顯增加[10]，而65～70年齡段心血管病死亡率達(dá)到最高峰[11]。高血壓、肥胖、代謝綜合癥等因素促進(jìn)了中老年人心臟疾病發(fā)病率和死亡率上升[12]。隨著年齡增加，機(jī)體各項(xiàng)功能降低，生理儲(chǔ)備能力下降和機(jī)體內(nèi)平衡紊亂[13]，從而降低了機(jī)體維持穩(wěn)定性的能力，并增加了對(duì)應(yīng)激事件的易感性[14]。本實(shí)驗(yàn)中，老年小鼠在電刺激或ISO 刺激下更易誘發(fā)心律失常，這與老齡衰弱導(dǎo)致的心臟功能降低，對(duì)應(yīng)激刺激易感性增加有關(guān)。

心肌纖維化是導(dǎo)致心律失常的重要原因之一，文獻(xiàn)報(bào)道，隨著年齡增加，心肌纖維組織可以從6%增加到10%～35%[15]。彌漫性纖維化減慢了波的傳播，增加了折返和轉(zhuǎn)子的形成，并且能延長(zhǎng)折返性心律失常的時(shí)間[16-17]。本研究中，老年小鼠心臟膠原沉積明顯增加，光標(biāo)測(cè)顯示，誘發(fā)心律失常后出現(xiàn)動(dòng)作電位的折返和轉(zhuǎn)子的形成，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，這些結(jié)果說(shuō)明心肌纖維化是老年小鼠心律失常易感性增加的機(jī)制之一。

心肌細(xì)胞收縮和電興奮性與細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)的過(guò)程密切相關(guān)。觸發(fā)動(dòng)作電位使細(xì)胞去極化，細(xì)胞膜上L型Ca2+通道開(kāi)放，從而啟動(dòng)肌漿網(wǎng)和蘭尼堿受體2（ryanodine2，RyR2）的Ca2+釋放。細(xì)胞內(nèi)這種膜電位與Ca2+濃度周期性變化被稱(chēng)為膜鐘和鈣鐘，以維持心臟正常的電活動(dòng)[18]。老年心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡的打破容易引發(fā)心律失常[19]，文獻(xiàn)報(bào)道老年化心臟細(xì)胞中Ca2+漏出增多[20]、肌漿網(wǎng)Ca2+回收減慢[21]、L型Ca2+通道電流減少[22]，舒張期Ca2+火花和波動(dòng)顯著增加[23]，從而增加心律失常發(fā)生率。而通過(guò)應(yīng)用治療性丹特林穩(wěn)定RyR2中的域間相互作用可減少過(guò)量的肌漿網(wǎng)Ca2+泄漏并減弱心律失常的發(fā)生。本研究中，光標(biāo)測(cè)技術(shù)可同時(shí)記錄電壓和鈣信號(hào)，可同時(shí)觀察動(dòng)作電位和鈣瞬變時(shí)程變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)老年小鼠心肌細(xì)胞APD、CaTD和鈣瞬變時(shí)間常數(shù)τ10-100明顯延長(zhǎng)，快速電刺激和ISO刺激后，老年小鼠出現(xiàn)明顯的電傳導(dǎo)折返和轉(zhuǎn)子波形成，Vm異質(zhì)性增加，這可能與老年小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào)，SERCA2a 功能降低[24]，Ca2+回收減慢相關(guān)，是老年小鼠心律失常易感性增加的又一機(jī)制。除此之外，衰老心臟中ATP敏感K+通道、延遲整流K+通道和其他鉀通道功能不全，也可能導(dǎo)致APD延長(zhǎng)，增加心律失常易感性[25-26]。

4 結(jié)論與啟示

老年小鼠心律失常易感性增加的機(jī)制是復(fù)雜的，衰弱、心功能降低、心肌纖維化、胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)等都是老年小鼠易發(fā)心血管疾病以及心律失常的因素。開(kāi)發(fā)藥物維持心臟胞膜鐘和鈣鐘的穩(wěn)態(tài)、減少心肌纖維化，可能降低老年小鼠心臟對(duì)應(yīng)激刺激產(chǎn)生心律失常的發(fā)生率。