李 楊, 徐 曼, 潘妙霞, 陳劍妹, 王玉川, 蔡興莉

中南大學湘雅醫(yī)學院附屬?？卺t(yī)院 腎病風濕科,海南 ?？?570208

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)為糖尿病的并發(fā)癥之一,嚴重影響患者預后[1]。DN病理改變的重要特征為系膜細胞增殖,腎小球系膜的細胞外基質(zhì)堆積、基底膜增厚、系膜區(qū)擴張,從而發(fā)展為腎小球硬化[2-4]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)為長度>200 bp的轉錄本,且不具有任何明顯的蛋白質(zhì)編碼能力[5]。LncRNAs可以影響不同的細胞功能,參與多種生理和病理過程[6-11]。長鏈非編碼RNA生長停滯特異性轉錄本5(long non-coding RNAs growth arrest-specific transcript 5,LncRNA GAS5)可通過與Yes關聯(lián)蛋白結合,促進其磷酸化和降解,從而抑制結直腸癌的進展[12]。LncRNA GAS5在DN患者的血清中表達下調(diào),并參與DN進展[13]。本研究旨在探討LncRNA GAS5在DN進展中的作用機制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及分組 5周齡大鼠購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司;人腎小球系膜細胞(human mesangial cell,HMC)購自武漢普諾賽生命科技有限公司;TRIzol RNA試劑購自Invitrogen公司;SYBR Premix Ex Taq GC試劑盒購自TAKARA公司;Lipofectamine 2000轉染試劑購自Invitrogen公司;雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega公司;沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關酶1(silent information regulator factor 2 related enzyme 1,SIRT1)、GAPDH抗體購自Abcam公司;細胞計數(shù)試劑(cell counting kit-8,CCK-8)試劑購自TargetMol公司。

1.2 研究方法

1.2.1 體外DN模型構建 腎小球系膜細胞于高糖(25 mmol/L)Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(dulbecco′s modified eagle medium,DMEM)中培養(yǎng),模擬建立DN細胞模型,分為LncRNA GAS5干擾組、LncRNA GAS5過表達組與陰性對照組。

1.2.2 外泌體的分離鑒定、攝取實驗 收集細胞上層清液,去除雜質(zhì)與細胞碎片后于濾器中(0.22 μmol/L)過濾,在電鏡銅網(wǎng)上涂20 μl外泌體懸液,于室溫條件下放置10 min,采用30 μl磷鎢酸(20 mg/ml)復染1 min,于透射電鏡下觀察、拍照記錄。

1.2.3 RNA提取及實時熒光定量聚合酶鏈式反應檢測 利用TRIzol提取總RNA,采用分光光度計檢測RNA濃度。利用逆轉錄試劑盒以及SYBR Premix Ex Taq GC試劑盒進行逆轉錄反應以及實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測。基因的Ct值通過FAST7500系統(tǒng)檢測,標準化后,計算每個基因的相對表達量。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法 通過裂解液充分裂解細胞,所得樣品于4℃條件下離心15 min并收集上層清液。加入上樣緩沖液后,將蛋白樣品放置于100℃蜂窩爐中進行變性。經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉印至聚偏二氟乙烯膜,采用5%脫脂奶粉封閉,并于4℃條件下孵育一抗過夜。采用Tris緩沖液-聚山梨醇酯20(tris buffered saline with tween 20,TBST)洗滌聚偏二氟乙烯膜后,加入相應種屬二抗,于室溫下孵育2 h,在凝膠成像儀中檢測蛋白表達。

1.2.5 雙熒光素酶報告實驗 根據(jù)LncRNA GAS5、miRNA以及靶基因mRNA結合位點,利用軟件設計相應引物,構建LncRNA GAS5野生型和突變型雙熒光素酶載體。各組細胞轉染后48 h,參照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒操作說明檢測熒光素酶活性。

1.2.6 DN模型 選取10只健康的5周齡大鼠為研究對象。將大鼠分為模型組與對照組,每組各5只。模型組采用高脂高糖喂養(yǎng)1個月,一次性腹腔注射40 mg/kg鏈脲佐菌素,72 h后檢測血糖>16.7 mmol/L為模型誘導成功。對照組飲食正常,腹腔注射同等劑量的生理鹽水。獲取模型組與對照組大鼠腎組織,檢測LncRNA GAS5的表達情況。

2 結果

2.1 DN中LncRNA GAS5表達情況 模型組腎組織樣本LncRNA GAS5表達水平低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖1a)。模型組血清外泌體中LncRNA GAS5表達水平低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖1b)。模型組HMC細胞中LncRNA GAS5表達水平低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖1c)。模型組HMC細胞上清外泌體中LncRNA GAS5表達水平低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖1d)。

圖1 DN中LncRNA GAS5表達情況(a.腎組織樣本;b.血清外泌體樣本;c.HMC細胞樣本;d.HMC細胞上清外泌體樣本)

2.2 LncRNA GAS5過表達抑制DN纖維化進程 LncRNA GAS5過表達組HMC細胞增殖水平低于陰性對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖2a～c)。LncRNA GAS5過表達組HMC細胞遷移能力低于陰性對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖2d)。LncRNA GAS5過表達組HMC細胞中α-平滑肌肌動蛋白、纖連蛋白、α(I)膠原表達均低于陰性對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖2e)。

圖2 LncRNA GAS5過表達抑制DN纖維化進程[a.在HMC細胞中過表達LncRNA GAS5;b.CCK-8檢測HMC細胞增殖情況;c.平板克隆檢測HMC細胞生長情況;d.Transwell檢測HMC細胞遷移情況;e.qRT-PCR檢測HMC細胞中α-平滑肌肌動蛋白、纖連蛋白、α(I)膠原表達情況]

2.3 LncRNA GAS5負向調(diào)控miR-135a-5p表達 StartBase v2.0預測發(fā)現(xiàn),miR-135a-5p與LncRNA GAS5具有靶向關系(圖3a)。在HMC細胞中共轉染GAS5-WT、miR-135a-5p后,LncRNA GAS5過表達組熒光素酶活性低于陰性對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),共轉染GAS5-MUT和miR-135a-5p后,熒光素酶活性無明顯改變(圖3b)。與Ago2抗體結合后,LncRNA GAS5過表達組富集水平高于陰性對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖3c)。LncRNA GAS5過表達組生物素化的miR-135a-5p吸附物中LncRNA GAS5富集水平高于陰性對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖3d)。敲減或過表達LncRNA GAS5后,LncRNA GAS5過表達組HMC細胞中miR-135a-5p表達水平相應高于或低于陰性對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖3e、f)。

圖3 LncRNA GAS5負向調(diào)控miR-135a-5p表達(a.StartBase v2.0預測miR-135a-5p與LncRNA GAS5結合;b.熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-135a-5p與LncRNA GAS5結合;c.Ago2抗體檢測LncRNA GAS5富集情況;d.生物素檢測LncRNA GAS5富集情況;e.LncRNA GAS5敲低HMC細胞中miR-135a-5p表達;f.LncRNA GAS5過表達組HMC細胞中miR-135a-5p表達)

2.4 MiR-135a-5p負向調(diào)控SIRT1表達 經(jīng)TargetScanHuman 8.0預測發(fā)現(xiàn),SIRT1為miR-135a-5p的靶點之一(圖4a)。在HMC細胞中共轉染SIRT1-WT、miR-135a-5p后,LncRNA GAS5過表達組熒光素酶活性低于陰性對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而共轉染SIRT1-MUT、miR-135a-5p后,熒光素酶活性無明顯改變(圖4b)。過表達或敲減miR-135a-5p后,SIRT1的mRNA、蛋白表達水平均相應低于或高于陰性對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖4c～4d)。敲減或過表達LncRNA GAS5后,LncRNA GAS5過表達組HMC細胞中SIRT1表達水平相應低于或高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖4e、f)。

圖4 MiR-135a-5p負向調(diào)控SIRT1表達(a.TargetScanHuman 8.0預測miR-135a-5p與SIRT1潛在結合位點;b.熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-135a-5p與SIRT1結合;c.過表達/敲減miR-135a-5p的 HMC細胞中SIRT1的mRNA表達水平;d.過表達/敲減miR-135a-5p的 HMC細胞中SIRT1蛋白表達水平;e.敲減 /過表達LncRNA GAS5的 HMC細胞中SIRT1的mRNA表達水平;f.敲減/過表達LncRNA GAS5的 HMC細胞中SIRT1的蛋白表達水平)

2.5 LncRNA GAS5通過miR-135a-5p/SIRT1調(diào)控DN纖維化進程 感染miR-135a-5p或轉染siSIRT1后,LncRNA GAS5過表達組對HMC細胞增殖的抑制作用及對α-平滑肌肌動蛋白、纖連蛋白、α(I)膠原表達抑制作用均弱于陰性對照組,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖5。

3 討論

DN的重要病理特征之一為系膜細胞異常增殖,其過程復雜,具體機制尚不清楚[14]。外泌體是由細胞分泌的具有雙層膜結構的小囊泡,廣泛分布于體液中,其可參與細胞周期、血管生成以及組蛋白修飾等過程,且可用于多種疾病的診斷[15-16]。LncRNA通過調(diào)控下游miRNA參與包括DN在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展,且可作為DN潛在的生物標志物和治療靶點[17-18]。有研究報道,miR-135a可通過調(diào)節(jié)人轉化受體電位陽離子通道亞家族C成員1促進DN患者的腎纖維化過程[19]。此外,在大鼠DN模型中,抑制miR-135a也可減小腎的纖維化程度[20]。

本研究結果顯示,模型組腎組織與血清外泌體中LncRNA GAS5表達水平低于對照組,且HMC細胞內(nèi)及上清外泌體中LncRNA GAS5表達水平同樣低于對照組。這提示,外泌體LncRNA GAS5具有作為DN檢測標志物的臨床應用價值。本研究結果發(fā)現(xiàn),LncRNA GAS5過表達組HMC細胞中α-平滑肌肌動蛋白、纖連蛋白、α(I)膠原表達均低于陰性對照組。這提示,過表達LncRNA GAS5可以抑制高糖條件下HMC細胞的生長、轉移和纖維化,LncRNA GAS5可作為DN的潛在治療靶點。本研究結果還發(fā)現(xiàn),敲減或過表達LncRNA GAS5后,HMC細胞中miR-135a-5p表達水平相應高于或低于陰性對照組,而SIRT1表達水平低于或高于陰性對照組。這表明,LncRNA GAS5通過靶向miR-135a-5p可以促進DN發(fā)病過程中的HMC增殖、遷移和纖維化因子的分泌,而特異性抑制該信號通路或可達到治療DN的目的。

綜上所述,LncRNA GAS5可通過miR-135a-5p/SIRT1軸調(diào)控DN的進展,為闡明DN進展的分子機制提供重要線索。